Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Immunology and Infection

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Summary

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

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Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

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Abstract

Carboxyfluorescein suinimidyl ester (CFSE) auf Basis von vivo zytotoxicity-Assays ermöglichen eine sensible und genaue Quantifizierung von CD8+ zytolytischen T-Lymphozyten (CTL), die gegen Tumor-und pathogene Peptide ausgelöst werden. Sie bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tötungsuntersuchungen. Erstens erlauben sie die Überwachung der CTL-vermittelten Zytotoxizität innerhalb architektonisch intakter sekundärer Lymphorgane, typischerweise in der Milz. Zweitens ermöglichen sie mechanistische Studien während der Grundide-, Wirkungs-und Rückrufungsphasen der CTL-Reaktionen. Drittens bieten sie nützliche Plattformen für Impfungen bei der Wirksamkeit von Medikamenten in einer wahrhaft in vivo-Umgebung. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung von begleiteten CTL-Antworten gegen mehr als ein Peptid-Ept eines Modelltumorantigen (Ag) zur Verfügung, nämlich das simianische Virus 40 (SV40)-kodiert großes T Ag (T Ag). Wie die meisten anderen klinisch relevanten Tumorproteine beherbergt T Ag viele potenziell immunogene Peptide. Allerdings führen nur vier solcher Peptide zu nachweisbaren CTL-Antworten bei C57BL-6-Mäusen. Diese Reaktionen sind konsequent in einer hierarchischen Reihenfolge angeordnet, die auf ihrer Größe basiert und die Grundlage für die "Immunodominanz" TCD8 in diesem mächtigen System bildet. Dementsprechend konzentriert sich der Großteil der T-Ag-spezifischen T CD8-Reaktion auf ein einzelnes immunominantes Epiope, während die anderen drei Epitope erkannt werden und nur schwach reagieren. Die Immunominanz beeinträchtigt die Breite der Antitumor-T-CD8-Reaktionen und wird als solche von vielen als Hindernis für eine erfolgreiche Impfung gegen Krebs angesehen. Daher ist es wichtig, die zellulären und molekularen Faktoren und Mechanismen zu verstehen, die die TCD8 -Immunodominanz diktieren oder formen. Das Protokoll, das wir hier beschreiben, ist auf die Untersuchung dieses Phänomens im T Ag-Immunisierungsmodell zugeschnitten, kann aber leicht modifiziert und auf ähnliche Studien in anderen Tumormodellen ausgeweitet werden. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie die Auswirkungen experimenteller immuntherapeutischer Eingriffe mit Hilfe von vivo Zytotoxizitätsuntersuchungen gemessen werden können.

Introduction

Herkömmliche CD8+ T-Zellen (TCD8) spielen wichtige Rollen in der antikantikanten Immunüberwachung. Sie funktionieren in erster Linie in der Kapazität von zytolytischen T-Lymphozyten (CTLs), die tumorspezifische oder-assoziierte Peptid-Antigene (Ags) erkennen, die innerhalb der geschlossenen Spalte der großen Histokompatibilitätskomplexen (MHC)-Klasse-I-Moleküle angezeigt werden. Voll bewaffnete CTLs nutzen ihr zytotoxisches Arsenal, um bösartige Zellen zu zerstören. Der Antikörper TCD8 kann im Kreislauf oder sogar in primären und metastasierenden Massen vieler Krebspatienten und tumortragenden Tieren nachgewiesen werden. Sie sind jedoch oft anergisch oder erschöpft und versäumen es, Krebs auszurotten. Daher sind viele immuntherapeutische Modalitäten so konzipiert, dass sie die T-CD8 -Frequenzen erhöhen und ihre Funktionen wiederherstellen und steigern.

Tumorproteine beherbergen viele Peptide, von denen einige immunogen und potenziell immunoprotektiv sein können. Allerdings werden quantifizierbare T CD8-Antworten mit unterschiedlichen Größenordnungen nur gegen wenige Peptide ausgelöst. Dadurch entsteht eine "Immunodominanz-Hierarchie" unter TCD8 Klonen1. Dementsprechend besetzen die immunodominanten (ID)T CD8 prominente hierarchische Ränge, die gemeinhin an ihrer Fülle gemessen werden. Im Gegensatz dazu treten T-CD8-Zellen, deren T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für subdominante (SD)-Epitope ist, in niedrigeren Frequenzen auf. Wir und andere haben einige der Faktoren identifiziert, die die Immunodominanz in den T-CD8-Reaktionen diktieren oder formen. Dazu gehören unter anderem der Modus der GB-Präsentation zu naivem TCD8 (z.B. direkte Präsentation, Cross-Präsentation, Cross-Dressing)2,3, 4,dieArt der Ag-präsentierenden Zellen (APCs) Die Teilnahme ander T CD8-Aktivierung5, die Fülle undStabilität des ProteinsAgs 6,7und die Effizienz und Kinetik ihrer Degradierung durch Proteasome 7,8,die Die relative Selektivität des Transporters, der mit der API-Verarbeitung (TAP) fürPeptide 9 verbunden ist, die Affinität der befreiten Peptide für MHC-I-Moleküle9, 10,die Anwesenheit, Vorläuferfrequenzen und die TCR-Vielfalt von CognateT CD8 in T-Zellpools 11,12, 13,Konkurrenzzwischen T-Zellen für den Zugang zu APCs14,15und die Bruderkapazität von T CD8 Klone16. Darüber hinaus wird die T CD8-Immunominanz von mehreren Suppressorzelltypen vermittelt, wie zum Beispiel den natürlich vorkommenden regulatorischen T (nTreg) Zellen17, dem koinhibitorischen Molekül der Zelloberfläche, programmiert Todes-1 (PD-1) 16, und bestimmte intrazelluläre Enzyme wie Indoleamin 2,3 Dioxygenase (IDO)18 und das Säugetierziel von Rapamycin (mTOR)19. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die oben genannten Faktoren nicht immer vollständig für die Immunominanz verantwortlich sind.

Neben der Grundbiologie der TCD8 -Immunodominanz hat die Untersuchung dieses faszinierenden Phänomens wichtige Auswirkungen auf die Krebs-Immunologie und Immuntherapie. Erstens verleiht ein ID-Status nicht unbedingt einem gegebenen T-CD8-Klon die Fähigkeit, Tumorinitiation oder Progression20zu verhindern. Ob und wie ID und SD TCD8 zur Antitumorimmunität beitragen, kann von der Art und dem Ausmaß der Bösartigkeit und dem verwendeten Versuchssystem abhängen. Zweitens wird angenommen, dass ID-T CD8-Klonefür das Immunsystem "zu sichtbar" sein können und daher anfälliger für zentrale and/oder periphere Toleranzmechanismen 16,21. Drittens können heterogene Tumoren neoplastische Zellen enthalten, die die Erkennung durch viele, wenn nicht sogar die meisten CTLs vermeiden, indem sie nur ein schmales Spektrum von Peptid-Komplexen anzeigen: MHC-Komplexe. Unter diesen Umständen dürften TCD8 -Reaktionen in unzureichender Breite solchen Tumorzellen einen Überlebensvorteil verschaffen und so ihr Auswachsen steigern 22. Aus den oben genannten Gründen sehen viele die Immunominanz als Hürde für eine erfolgreiche T-CD8-basierte Impfung und Therapie gegen Krebs.

Die Inokulation von C57BLACH 6 Mäuse mit Silavirus 40 (SV40)-transformierte Zellen, die großen Tumor Ag (T Ag) ausdrücken, bietet ein leistungsfähiges präklinisches System, um T CD8-Immunmodulare zu untersuchen. Dieses Modell bietet mehrere Vorteile. Zunächst sind die Peptid-Epitope dieses klinisch relevanten Onkoproteins in diesem Maus-Stamm23 gut charakterisiert (Tabelle 1). Zweitens, T Ag Epitope, die Standorte I, II/III, IV und V, Trigger TCD8 Antworten, die konsequent in der folgenden hierarchischen Reihenfolge angeordnet sind: Website IV > > Website I, Website I, Website > Website V> I. mounten Sie die robusteste Reaktion auf T Ag. Im Gegensatz dazu sind die Standorte I und II/III subdominant, und die standortV-spezifischen TCD8 sind am wenigsten vorhanden und in der Regel nur in Ermangelung der Reaktionsfähigkeitauf andere Epitope 23,24nachweisbar. Drittens, die T Ag+ Tumorzelllinie, die in dem hier beschriebenen Protokoll verwendet wird, nämlich die C57SV Fibrosarkom-Zellen,und die, die in unseren vorherigen Untersuchungen 16,17, 18,19verwendetwurden. ,25,26, werdenmit subgenomischen SV40-Fragmenten 25 verwandelt. Daher sind sie nicht in der Lage, SV40-Virions zu montieren und freizugeben, die möglicherweise Host-APCs infizieren könnten. Darüber hinaus sind die C57SV-Zellen frei von klassischen Costimulationsmolekülen wie CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) und CD137 ligand (4-1BBL)16. Die obigen Attribute machen diese Linien ideal für die Untersuchung der In-vivoT CD8-Aktivierung durch Cross-Priming. Cross-Priming ist ein wichtiger Weg, um TCD8 -Reaktionen zu induzieren, vor allem jene, die gegen Tumorzellen nichthämatopoetischen Ursprungs gestartet werden, die es nicht direktversäumen, die naiven T-Zellen direkt zu unterstützen.

Antitumor TCD8 Frequenzen and/oder Funktionen können durch MHC I Tetramer-Färbung überwacht werden, Intrazelluläre Färbung für Effektzytokine (z.B. Interferon [IFN]--oder lytische Moleküle (z.B. Perforin), enzymgebundene Immunospots (ELISpot) und Ex-Untersuchungen vivo zytotoxicity Assays. Seit ihrer Gründung in den 1990er Jahren von27, 28 Jahrenermöglichte Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) auf vivo-Totoring-Assays die Auswertung von zytotoxischen Reaktionen, die durch antivirale CTLs 29,30vermittelt wurden. , 31, Antitumor CTLs 16,32,Naturkiller (NK)Zellen 33, glykolipid-reaktive invariante Naturkiller T(iNKT) Zellen 34, und bereits vorhanden und de novo donor-spezifisch Legantikörper26. Daher können ihre Anwendungen für eine breite Leserschaft von Interesse sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Forscher, die in den Bereichen Tumorimmunologie und Immuntherapie, Anti-Erreger-Immunität und präventiven und therapeutischen Impfstoff-Design arbeiten.

Um die zellvermittelte Zytotoxizität in typischen Szenarien zu beurteilen, werden zwei Populationen naiver Splenozyten, die entweder eine irrelevante Ag oder ein kognates Ag (s) aufweisen, mit zwei verschiedenen Dosen CFSE gekennzeichnet, in gleicher Zahl gemischt und in naive (Kontrolle) oder Killer injiziert. Zellgehärtete Mäuse. Die Voraussetzung für das Fehlen jeder Zielpopulation wird dann durch die Strömungszytometrie untersucht.

Wir haben in unseren Studien zur Immunodominanz in antiviralen und antitumororartigen TCD8-Reaktionen 12,16, 17optimiert und in vivo-Tötungsuntersuchungeneingesetzt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur gleichzeitigen Bewertung von ID-und SD T CD8-Antworten auf T Ag-Epitope zur Verfügung, das für ähnliche Untersuchungen in anderen Versuchssystemen problemlos übernommen werden kann. Darüber hinaus liefern wir repräsentative Ergebnisse, die zeigen, dass die NTreg-Zellabnahme und die PD-1-Blockade die ID-T-CD8-bzw. die SD-T-CD8-induzierte Zytotoxizität selektiv verbessern können. Am Ende werden wir mehrere Vorteile von in vivo Tötungsuntersuchungen sowie einige ihrer inhärenten Einschränkungen zu diskutieren.

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Protocol

Die hier beschriebenen Experimente folgen Tierverbrauchsprotokollen, die von institutionellen Stellen genehmigt wurden und sich an die festgelegten nationalen Richtlinien hielten.

1. Inoculation von C57BL-6 Mäusen mit T Ag-ausdrückenden Tumorzellen

  1. Die SV40-verwandelte Fibrosarko-Zelllinie C57SV (oder eine ähnliche T Ag+ anhaftende Zelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glukose und L-Glutamin (1x) und ergänzt mit 1 mM-Sodiumpyruvat und 10% Wärmelinaktiviert Fetale Rinderserum (FBS) in Gewebekultur-Flaschen bei 37 ° C in feuchtem Klima mit 10% CO2.
  2. Sobald die Zellen vollständig durcheinander oder leicht überwirckend werden, entfernen und entfernen Sie das Medium sanft und spülen Sie den Monolayer mit vorgewärmter steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
    NOTE: Maximaler T Ag-Ausdruck wird erreicht, wenn T Ag +-Zellen 100% Konfluenzerreichen .
  3. In einem biologischen Sicherheitsschrank vorgewärmtes Trypsin-EDTA (0,25%) Der Monolayer bei Raumtemperatur abdecken, bis die Zellen in Patches abgelegt werden. Tippen Sie mehrmals auf die Seiten der Kulturflasche, um die restlichen anhaftenden Zellen freizusetzen.
    Hinweis: Bei Bedarf und zur Beschleunigung des Trypsinierungsprozesses die Flasche in einen 37 ° C-Inkubator überführen. Abgeschlagene Zellen werden unter einem Lichtmikroskop schnell eine abgerundete Form annehmen. Dieser Schritt sollte ca. 5 Minuten dauern.
  4. Fügen Sie 5 ml DMEM-Medium hinzu und trennen Sie Klumpen, um eine Einzeller-Aufhängung vorzubereiten, indem Sie den Inhalt jeder Flasche nach oben und unten pipettieren.
  5. Übertragen Sie die Zellaufhängung durch einen Zellstrainer mit 70 μm Poren in ein Rohr.
  6. Das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C unterdrehen.
  7. Den Supernatant abwerfen. Wiederholen Sie pellende Zellen in 10 ml steriler kalter PBS.
  8. Die Schritte 1.6 und 1.7 zweimal wiederholen.
  9. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Bereiten Sie eine gleichmäßige Aufhängung vor, die 4 x 107 Cells/mL sterile PBS enthält.
  10. Fügen Sie 500 μL der obigen Aufhängung intraperitoneal (i.p.) in jeden Erwachsenen (6-12-Wochen-alt) männlich oder weiblich C57BL/6 Maus ein.

2. Behandlungs-Regimen

  1. Behandlungs-Regimen, um den Beitrag von nTreg Cells zu TCD8 -Immunodominanz zu untersuchen
    1. Vier Tage zuvor in vivo Grundierung von C57BL/6 Mäuse mit C57SV Zellen (Schritt 1.10), Jedes Tier einmal injizieren, z.B. mit 0,5 mg eines Low-Endotoxin, azide-freien anti-CD25 monoklonalen Antikörpers (mAb) (Klon PC-61.5.3), der NTreg-Zellen abschöpft, oder mit einem Ratten-IgG1-Isun Steuerung (z.B. Klon KLH/G1-2-2, Klon HRPN, oder Klon TNP6A7).
  2. Behandlungs-Regimen, um die In-Vivo-Signierung von PD-1-PD-L1-2) Interaktionen in Shaping T CD8 Immunodominanz zu testen
    NOTE: Das Engagement von PD-1 durch PD-L1 vermittelt oft, aber nicht immer, die Co-Hemmung and/oder die Erschöpfung von Ag-spezifischen TCD8. Daher kann die Behandlung mit Anti-PD-1 parallel zur Verabreichung von AntiPD-L1 und Anti-PD-L2 mAbs durchgeführt werden, um die exakte interzelluläre Interaktion zu zeigen, die an einem biologischen Phänomen beteiligt ist.

3. Vorbereitung von Ziel-Splenozyten

  1. Sterbemittel mit sex-aufeinander abgestimmten naiven C57BL/6 Mäuse (6-12 Wochen alt), die als Splenozyten-Spender durch Gebärmutterhalskrebs dienen.
  2. Positionieren Sie jede Maus mit ihrem Bauch nach oben in einem biologischen Sicherheitsschrank. Die Haut mit 70% (v/v) EtOH besprühen. Mit sterilen Zangen und Scheren heben Sie die Haut und machen Sie einen kleinen ventralen Mittelschnitt. Dann schneiden Sie die Haut in einer kreuzförmigen Art und Weise, um das Peritoneum zu entlarven.
  3. Mit Zangen ziehen Sie das Peritoneum zwertlich hoch, ohne die inneren Organe zu entreißen. Schneiden Sie das Peritoneum offen, um die Peritonealhöhle zu entlarven und sanft die Milz zu entfernen.
  4. Legen Sie die Milz (s) in einen 15 ml Dunz-Gewebeschleifer mit 5 ml sterilen PBS. Mit dem Glas-Kolumben-Einsatz des Schleifers wird manueller Druck ausgeübt, bis sich das splenische Gewebe in eine rot homogene Zellaufhängung auflöst.
    Hinweis: Je nach Anzahl der Empfängertiere pro Versuchsgruppe können mehrere Spendermaus für die Zielzellvorbereitung benötigt werden. Bis zu 3 Milben können in einem 15-ML-Schleifer zusammen homogenisiert werden.
  5. Das Homogenat in ein 15 ml Röhrchen übertragen. Das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C unterdrehen.
  6. Den Supernatant abwerfen. Resuspend pellettierte Zellen in 4 mL Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysing-Puffer für 4 min, um Erythrozyten zu beseitigen.
    NOTE: Das ist ein zeitsensibler Schritt. Die Überbelichtung von Splenozyten gegenüber ACK-Lysingpuffer erhöht ihre Fragilität und macht sie anfällig für unspezifischen Zelltod.
  7. Zu jedem Rohr 8 mL RPMI 1640 Medium mit 10% wärmeinaktivierter FBS, L-alanyl-L-Glutamin, 0,1 mM minimales essentielles Medium (MEM) nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES, und 1x Penicillin/Streptomycin, das danach Als komplettes RPMI-Medium (Materialtabelle) bezeichnet.
  8. Übertragen Sie den Inhalt durch 70 μm Poren eines Zellstrainers in ein neues 15-ML-Rohr.
  9. Das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C unterdrehen.
  10. Den Supernatant abwerfen. Wiederholen Sie die pellenden Zellen in 12 ml kompletter RPMI.
  11. Die Splenozyten-Aufhängung in 3 gleiche Portionen (je 4 ml) in 3 getrennte Rohre aufteilen.

4. Beschichtung Ziel-Splenozyten mit Irrelevanten und Cognate Peptide

  1. Beschrieben Sie die Rohre nach den Peptiden, die verwendet werden, um Zielsplenozyten zu pulsieren. Die Kontrollsplenozyten werden mit einem irrelevanten Peptid gepulst, und jede Population von kognaten Ziel-Splenozyten wird mit einem synthetischen Peptid gepulst, das dem T Ag-abgeleiteten Immunominanten Epiope (Site IV) oder einem subdominanten T Ag Ept entspricht (Site I oder Site II/III) (Tabelle 1).
    Hinweis: Die Wahl der irrelevanten Peptide hängt von der Versuchsaufstellung und der bei jeder Untersuchung verwendeten Mausbelastung ab. Die Autoren verwenden oft gB 498-505 (ein H-2Kb-begrenztes immunominantes Peptid-Eitope des Herpes simplex Virus [HSV]-1) oder GP33-41 (ein H-2D b-eingeschränktes immunkomodominante Peptid-Epikop von lymphozytisch Choriomeningitis-Virus ([LCMV]) in C57BL-6 Mäuse (Tabelle 1). Diese Peptide sind eine optimale Wahl, weil: (i) sie von Krankheitserregern abgeleitet werden, die im hier beschriebenen Mausmodell nicht vorkommen; (ii) ähnlich wie T Ag-abgeleitete Peptide, gB 498-505 und GP33-41 werden durch H-2 b-Moleküle eingeschränkt und an sie gebunden. In "Drei-Gipfel" in vivo Tötungsanalysen kann jeder der beiden Spitzen, die den kognaten Zielzellen entsprechen, Splenozyten darstellen, die mit einem immunominanten oder subdominanten Peptid gepulst werden. Die Auswahl der einzelnen Peptid-Sets variiert je nach den Zielen der einzelnen Experimente. Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 als Beispiele für solche Variationen. Für den Rest dieses Protokolls werden die T Ag-abgeleiteten Seiten I und IV subdominante und immunominante Peptide darstellen.
  2. Pulsieren Sie den Inhalt jedes beschrifteten Rohres mit 1 μM des jeweiligen Peptids für 1 h bei 37 ° C und 5% CO2.
  3. Verwenden Sie für jedes Rohr einen separaten Zellstrainer (mit 70 μm Poren), um Klumpen und Schmutz zu entfernen.
  4. Das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C unterdrehen. Den Supernatant abwerfen.
  5. Die pellenden Zellen in 12 mL steriler kalter PBS wiederverwenden und den Schritt 4.4 noch einmal wiederholen.
    Hinweis: Es ist wichtig, so viel FBS wie möglich zu entfernen, da FBS CFSE im nächsten Schritt binden kann.

5. Kennzeichnung der Splenozyten mit CFSE

  1. Resuspend Peptid-gepulste Splenozyten in 4 ml steriler PBS.
  2. CFSE um 0,25 μM, 0,25 μM und 2 μM in die Röhren mit irrelevanten Peptide-, Stand-I-und Stand-IV-gepulsten Splenozyten.
    Hinweis: Um eine einheitliche CFSE-Beschriftung zu erreichen, halten Sie jedes Rohr in einem 45 °-Winkel, bevor Sie CFSE leicht über der Zellaufhängung zur Seite hinzufügen, gefolgt von sanftem Wirbeln. So wird das Auftreten von glatten Histogrammen am Ende sichergestellt. Batch-to-Batch und altersabhängige Variationen der CFSE-Intensitäten sind nicht ungewöhnlich. Daher kann es sein, dass man mit differenziellen CFSE-Dosen experimentieren muss, bevor man sich für optimale Konzentrationen entscheidet.
    CAUTION: CFSE ist giftig bei Konzentrationen, die über 5 μM liegen.
  3. Die Rohre 15 min in einen 37 ° C-Inkubator legen und einmal alle 5 Minuten umdrehen.
  4. Fügen Sie jedem Rohr 3 mL wärmeinaktivierte FBS hinzu, um die CFSE-Reaktion zu stoppen. Den Inhalt mit sterilen PBS auffüllen.
  5. Das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C unterdrehen. Den Supernatant abwerfen.
  6. Wiederholen Sie die Pelletenzellen in 12 ml steriler PBS und wiederholen Sie den Schritt 5.5.

6. Prüfung der Adequate/Equal CFSE Kennzeichnung von Target Splenocyte Populationen

  1. Wiederholen Sie die Pelletenzellen in 3 mL PBS.
  2. Die Rohre vorsichtig abstöften. Übertragen Sie jeweils 10 μLvonCFSE low, CFSE Intermediate (int)und CFSE High Cell-Suspenpensionen in ein 5 mL runde-Polystyrol-Polystyrol-Fluoreszenz-Rohortuhr (FACS), das 200 μL DES PBS enthält.
  3. Interrogat-Zellen mit einem Strömungszytometer, ausgestattet mit einem 488 nm Laser. Zeichnen Sie ein Lymphozytentor auf der Grundlage von Vorwärtsstreuer (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Eigenschaften der Zellen, bevor Sie 5000 Ereignisse, die innerhalb des Lymphozyten-Tores im FL-1-Kanal fallen, erwerben.
  4. Innerhalb der "übergeordneten" CFSE + Population ziehen Sie zusätzliche Histogramm-Gates,um CFSEniedrig , CFSE int undCFSE hohe Unterpopulationen zu identifizieren.
  5. Bestätigen Sie gleiche oder annähernd gleiche Ereigniszahlen innerhalb der drei Tore. Bei Bedarf die Zellzahlen in den "Quelle"-Röhren (Schritt 6.1) anpassen, bevor man in Abschnitt 7 die Splenozyten des Ziels in naive und grundierte Mäuse mischt und injiziert.

7. Injektion von CFSE-gekennzeichneten Zielzellen in naive und T-Ag-graute Recipients

  1. Die Quellenröhren werden sanft vereitelt. Übertragen Sie die drei CFSE-beschrifteten Zellaufhängungen in gleichem Verhältnis in ein neues Rohr.
  2. Den Inhalt mit sterilen PBS auffüllen.
  3. Das Rohr bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C unterdrehen. Weckende Pelletenzellen mit sterilen PBS wiederbeleben.
  4. Zählen Sie Zellen in trypan blau durch ein Hämozytometer, um die zelluläre Lebensfähigkeit von mindestens 95% zu gewährleisten.
  5. Stellen Sie die Lautstärke ein, um 1 x 107 gemischte Zielzells/200 μL PBS intravenös (i.v.), über die Schwanzvene, in jeden Empfänger C57BL-6 Maus zu injizieren.
    Hinweis: Bewahren Sie die Zellen auf Eis zwischen Injektionen. Vor jeder Injektion zielgerichtete Zellen sanft vermischen. Zeichnen Sie den genauen Zeitpunkt der Injektion für jede Maus, die bestimmen wird, wann das Tier euthaniert werden muss. Es ist wichtig, die Dauer der zytotoxizität bei allen Tieren im selben Experiment konstant zu halten.

8. Datenerfassung

  1. Zwei oder vier Stunden nach der Injektion von CFSE-beschrifteten Zielzellen euthanieren die Empfängermäuse durch Gebärmutterhalskrebs.
    Hinweis: Die Dauer der in vivo Zytotoxizität kann je nach verwendetem experimentellem System, der Immunogenität der Ziel-Ags, der zu erwartenden Fülle von Peptid-Antigen-spezifischen TCD8 in der Milz und der Robustheit ihrer lytischen Funktion variieren. Unter anderem.
  2. Jede Milz separat wie in den Schritten 3.2 − 3.9 entfernen und verarbeiten.
  3. Den Supernatant abwerfen und die Pelletierzellen in 3 ml PBS wiederbeleben.
    Hinweis: Achten Sie besonders darauf, die splenischen Gewebe-und Zellpräparate bei 4 ° C oder auf Eis zu behandeln, bevor Sie zytofluorimetrische Analysen analysieren. Damit soll verhindert werden, dass die Zytotoxizität ex vivo fortbesteht.
  4. Übertragen Sie ca. 1 x 107 Zellen von jeder verarbeiteten Milz in ein sauberes FACS-Rohr.
  5. Interrogat-Zellen mit einem Strömungszytometer, das mit einem 488-nm-Laser ausgestattet ist. Zeichnen Sie ein Lymphozytentor auf der Basis von FSC und SSC-Eigenschaften der Zellen.
  6. Die Splenozyten des Empfängers und CFSE+ übertragenen Zielzellen sind identifizieren. Ziehen Sie zusätzliche Tore, die für diehohen CFSE-Tief-, CFSE-int und CFSE-Populationen mithohen Zielzellen geeignet sind.
  7. Erwerben Sie insgesamt 2000 CFSE-Großereignisse im FL-1-Kanal.

9. Datenanalyse

  1. Berechnen Sie die spezifische Lyse jeder Cognitate-Zielzellpopulation nach folgender Formel:
    % Spezifische Zytotoxizität =Equation
    Wo x = CFSEint/hohe Ereignisnummer in T Ag-grunter Maus, y = CFSE niedrige Ereignisnummer in T Ag-grunter Maus, a = CFSE int/High-Event-Nummer in naive Maus, und b = CFSE niedriges Ereignis Zahl in naiver Maus.
    NOTE: Bei ' Drei-Peak-Assays ' der Zytotoxizität, in denen die spezifische Lyse von mehr als einer Cognate-Zielpopulation bewertet wird, ist es nicht angebracht, Zielzellfrequenzen zu verwenden. Das liegt einfach daran, dass die Häufigkeit einer Cognitate-Zielzellpopulation nicht nur durch den Prozentsatz der irrelevanten Kontrollen beeinflusst wird, sondern auch durch den Prozentsatz der anderen kognaten Zielsplenozyten. Daher sollten die Ereigniszahlen innerhalb jedes Tores in der obigen Formel verwendet werden, um die Lyse jeder Cognitat-Zielzellpopulation (entweder CFSE int oder CFSE-Hochzellen) gegendie geringen Kontrollen der CFSE genau zu berechnen.

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Representative Results

Ziel des Experiments, dessen Ergebnisse in Abbildung 1 abgebildet sind, war es, festzustellen, ob die Präsenz und die Funktionen von nTreg-Zellen die Immunodominanz-Hierarchie von T Ag-spezifischem TCD8formen oder verändern. C57BL/6 Mäuse wurden vier Tage vor dem Erhalt von 2 x 10 7 C57SV-Tumorzellen i.p. mit PBS oder mit 0,5 mg eines Anti-CD25 mAb (Klon PC- 61.5.3 [PC61]) injiziert. In separaten Experimenten wurde anstelle von PBS eine Ratte IgG1-Isotypenkontrolle eingesetzt. Die erfolgreiche nTreg-Zellabnahme durch PC61 wurde durch die Strömungszytometrie17 bestätigt.

Neun Tage nach der C57SV Zellimpfung, einem Zeitpunkt, an dem die T-Ag-spezifischen TCD8 -Antwortenihr Maximum erreichen, erhielt jedes Tier eine i.v. Injektion einer Zellaufhängung, die 3 verschiedene Populationen von CFSE-beschrifteten Zielzellen enthält. Die Zielzellen der Kontrolle waren syngeneic naive Splenozyten, die mit zwei irrelevanten Peptiden (GP33-41 und gB 498-505) gleichzeitig gepulst und mit einer geringen Dosis CFSE (0,02 μM)gekennzeichnet waren. Um die kognate Zielzellen vorzubereiten, wurden syngeneic naive Splenozyten entweder mit T Ag-abgeleiteter Site I-Peptid oder Site IV-Peptid (Tabelle 1) gepulst und anschließend mit CFSE auf 0,2 μM bzw. 2 μM gekennzeichnet. Die Kontroll-und Cognit-Zielzellen wurden in gleicher Zahl gewaschen und gemischt (bei einem Verhältnis von 1, 1, 1), bevor sie in naive (Kontrolle) und T Ag-grundierte C57BL-6 Mäuse injiziert wurden. Zwei Stunden nach der Zielzellinjektion wurden Mäuse für ihre Milz geopfert, in der das Fehlen von CFSE-beschrifteten Zielzellen durch Fließzytometrie bestimmt wurde. Zielzellen wurden anhand ihrer unterschiedlichen CFS-Färtenintensitäten ausgezeichnet.

Erwartungsgemäß waren nahezu gleichwertige Spitzen, die der Kontrolle und Kognate von Zielzellen entsprechen, bei naiven Mäusen nachweisbar (Abbildung1, linke Tafel). Im Gegensatz dazu fehlte die Standort-IV-Darstellungszelle bei T Ag-grundierten Mäusen fast vollständig, unabhängig von ihrer vorherigen Behandlung mit PC61 oder PBS (Abbildung1). Interessanterweise hat die NTreg-Zellabnahme durch PC61 in vivo CTL-vermittelter Lyse des Standortes I-gepulste Zielzellen17erweitert. Diese Ergebnisse veranlassten uns zu dem Schluss, dass nTreg-Zellen gezielt die standortspezifische Zytotoxizität hemmen. Aus diesem Grund kann nTreg zell-depleting/Inaktivierungsmittel die zytolytische Effektorfunktion von CTLs verbessern, die bestimmte tumorabgeleitete Epitope erkennen.

Das obige Setup ist ein Beispiel dafür, wie in vivo cytotoxicity Assays eingesetzt werden können, um gleichzeitig die lytische Funktion von ID und SD CTL Klonen im gleichen Tier zu testen.

Figure 1
Abbildung 1:Repräsentative zytofluorimetrische Analyse von T CD8-vermittelter Zytotoxizität gegen T Ag-abgeleitete Epitope in Anwesenheit oder Abwesenheit von NTreg-Zellen. Ziel Splenozyten, die mit Kontrollpeptiden gepulst werden, Site I oder Site IV, die mit CFSE differenziert beschriftet waren, wurden von der Strömungszytometrie in der Milz einer naiven Maus (linkes Panel), einer PBS-injizierten T Ag-Grundierung (Mitteltafel) und einer PC61 (nti-CD25) verfolgt- Inspritzung (nTreg-abgetrennt) T Ag-grunte Maus (rechte Tafel). Die prozentuale spezifische Tötung von Zielzellen wurde anhand der im Protokoll beschriebenen Formel berechnet, und es werden repräsentative Zahlen angezeigt. Diese Zahl wird mit Genehmigung von Haeryfar et al. 17 übernommen. Copyright 2005. The American Association of Immunologists, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Zahl zu sehen.

In einer neueren Untersuchung haben wir gefragt, ob die Sperrung von PD-1die "Breite" der T-CD8-Antwort auf TAg 16 (Abbildung2) beeinflusst. Dies war eine klinisch relevante Frage angesichts des beobachteten therapeutischen Nutzens von PD-1-basierten "Checkpoint-Inhibitoren" bei mehreren bösartigen Erkrankungen. Obwohl solche Hemmstoffe in erster Linie durch die Umkehr der T-Zell-Erschöpfung funktionieren, waren wir neugierig zu wissen, ob die Einmischung in PD-1-PD-L1-Interaktionen die Reaktionen des PD-1-PD-L1 zusätzlich erweitern (oder schmal) Antikanker TCD8 -Antworten. In unserem T Ag-Erkennungsmodell haben intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) gezeigt, dass die Behandlung mit Anti-PD-1 oder Anti-PD-L-1die IFN-Erzeugerstandorte I und II/III 16 selektiv erweitert. Wir haben dann unsere Studie erweitert, um die in vivo zytolytische Wirkungsfunktion dieser SD CTLs zu untersuchen. C57BL-6 Mäuse wurden z.B. mit 100 μg eines Anti-PD-1 mAb (Klon RMP1-14) oder einer Ratte IgG2a Isotyp-Steuerung (Klon 2A3) zwei Stunden vor C57SV Zellimpfung injiziert. Mäuse erhielten drei und sechs Tage nach der Tumorzellinjektion zwei zusätzliche Dosen von Anti-PD-1 oder Isotyp. Am Tag 9 nach der Grundierung erhielten Kohorten naiver und grundierter Mäuse über seitliche Schwanzvenen ein Zellgemisch mit gleicher Anzahl von CFse-Lief (CFSE-Kennzeichnungsdose: 0,25 μM), CFSE int (CFSE-Kennzeichnungsdose: 0,25 μM) und CFSE hi (CFSE hi (CFSE hi (CFSE) Kennzeichnungsdosis: 2 μM) syngeneic naive Splenozyten, die mit gB498-505, Site II/. Vier Stunden später wurden die Tiere euthaniert, und die mit CFSE beschrifteten Zielzellen wurden zytofluorimetral in ihrer Milz verfolgt. Repräsentative FACS-Grundstücke (Abbildung 2A) und Daten von 3 Tieren pro Kohorte (Abbildung 2B) werden dargestellt. Während die PD-1-Blockade die IDT CD8 -Reaktion gegen die Website IV16nicht beeinflusste, wurden die Seiten I-und III-spezifische SD-Antworten belebt. Wir kamen daher zu dem Schluss, dass das Eingreifen von PD-1-PD-L1-Interaktionen zu einer ' Epiptionsverbreitung ' in den Antikanglieren-TCD8-Antworten führen kann.

Das obige Setup stellt in vivo-Tötungsuntersuchungen dar, die eine Quantifizierung der Zytotoxizität ermöglichen, die von zwei SD CTL-Klonen im selben Tier ausgelöst wird.

Figure 2
Abbildung 2: In vivo Zytotoxizität von T Ag-spezifischem TCD8 bei Anti-PD-1-behandelten Mäusen. A) Repräsentative Histogramm-Grundstücke zeigen CFSE-Spitzen, die den Zielen von Splenozyten entsprechen, diemit einem irrelevanten Peptid (CFSElow), dem Gelände II/III (CFSE int) und dem Gelände I (CFSE hoch) in T Ag-grundierten Mäuse gepulstsind, dass Erhalten einen Isotyp (linke Tafel) oder eine PD-1-Sperrung mAb (rechte Tafel). B) Die prozentuale spezifische Tötung jeder Cognitate-Zielzellpopulation wurde mit CFSE+ -Ereignisnummern in T Ag-grundierten Mäusen (n = 3 pro Gruppe) und naiven Empfängern (nicht abgebildet) und der im Protokoll beschriebenen Formel berechnet. Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittels (SEM) dar, und * * bezeichnet einen statistischen Unterschied mit p < 0,01 durch ungepaarte Student es t-Tests. Diese Zahl wird mit Genehmigung von Memarnejadian und al.16 übernommen. Copyright 2017. The American Association of Immunologists, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Zahl zu sehen.

Protein-Antigen Quelle Peptid-Epitope Bezeichnung die Reihenfolge MHC I-Restung
SV401 Large T Ag 2 T Ag206-215 Site I SAINNYAQKL H-2Db
SV40 Large T Ag T Ag223-231 Site II/III CKGVNKEYL H-2Db
SV40 Large T Ag T Ag404-411 Seite IV VVYDFLKC H-2Kb
SV40 Large T Ag T Ag489-497 Ort V QGINNLDNL H-2Db
HSV-13 Glykoprotein B GB498-505* GB498-505 SSIEFARL H-2Kb
LCMV4 Glykoprotein GP33-41* GP33-41 KAVYNFATC H-2Db
1 Simian Virus 40
2 Große Tumorantigen
3 Herpes Simplex Virus Typ 1
4 Lymphozytische Choriomeningitis Virus
* als irrelevantes Peptid verwendet

Tabelle 1. Peptide in diesem Protokoll eingeführt

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Discussion

CFSE-basierte in vivo Cytotoxicity-Assays bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tötungsuntersuchungen wie radioaktives Chrom (51Cr)-Freisetzung und farbimetrisches Laktat-Dehydrie-Dehydrogenase (LDH). Zunächst erlauben sie die Überwachung der CTL-Funktion innerhalb eines architektonisch intakten sekundären Lymphorgan.

Zweitens spiegelt die spezifische Tötung von Zielzellen in vivo zytotoxicity Assays die absolute Anzahl der Ag-spezifischen TCD8 wider, die in der Regel, aber nicht immer, eine Funktion von T CD8-Frequenzen ist, die in der Milz vorhanden sind. Dies steht im Gegensatz zu 51Cr/LDH-Freisetzungsanalysen, bei denen eine konstante Anzahl von Zellen als Effektorquelle TCD8eingesetzt wird. 51 Cr/LDH-Freisetzungsuntersuchungen können daher die Gesamtzahl der Ag-spezifischen TCD8, die dem Wirt zur Verfügung stehen können, um Tumorzellen zu eliminieren oder Infektionen zu bekämpfen, nicht zuverlässig abschätzen. Dies ist wichtig, da in vielen Fällen und Bedingungen die Größe und die Zellularität von sekundären Lymphorgans-/Geweben, die Ag-spezifische TCD8 aufnehmen , verändert werden. Zum Beispiel kann ein hypothetisches Szenario ins Auge gefasst werden, bei dem eine Virusinfektion die Gesamtzahl der für Peptid X spezifischen TCD8 erhöht und gleichzeitig mehrere andere T-CD8-Klone erweitert, die andere Besonderheiten beherbergen. Infolgedessen kann die Frequenz von X-spezifischen TCD8 unter dem Gesamt-Sprahler T CD8 nicht steigen, in diesem Fall wird ein 51Cr/LTH-Release-Test nicht hilfreich sein. Als weiteres Beispiel haben wir vor kurzem gezeigt, dass bestimmte bakterielle Superantigene den Speicher TCD8 speziell für NP147-155erweitern, ein immunkomominentes Peptid-Epitop von Influenza-A-Viren in BALB/c-Mäusen, die gut mit erhöhten In vivo lysis von NP147-155-pulsierte Zielzellen31. Da die Exposition gegenüber Superantigenen die T-Zell-Verbreitung nicht spezifisch provoziert, wäre es höchst unwahrscheinlich gewesen,eine substanzielle NP-147-155-spezifische Zytotoxizität mit 51 Cr/LDH-Freisetzungsuntersuchungen zu zeigen .

Drittens können Zielzellen, die mit Peptiden gepulst sind, die an das gleiche Molekül der MHC-Klasse I gebunden sind, mit verschiedenen Dosen CFSE gekennzeichnet werden, gemischt und in vivo Zytotoxizitätsuntersuchungen verwendet werden. Die damit einhergehende Analyse von CTL-Funktionen gegenüber solchen Peptiden ist in 51Cr/LDH-Freigabeanalysen keine Option.

Viertens, in vivo Zytotoxizitäts-Assays erlauben mechanistische Studien während der Grundierungs-, Effektor-und Rückrufungsphasen von CTL-Reaktionen. So können beispielsweise Tumorzellimpfungen oder Antitumorimpfungen bei gentechnisch veränderten Mäusen zur Beurteilung der CTL-Induktion durchgeführt werden. Darüber hinaus können in der Effektorphase Splenozyten aus Gen-Knock-in und Knock-out-Mäuse als Zielzellen eingesetzt werden. Schließlich können verschiedene Wirkstoffe (z.B. pharmakologische Inhibitoren und Medikamentenkandidaten) vor der Grundierung, während der Effektphase oder beides verabreicht werden. Daher bieten in vivo cytotoxicity Assays eine leistungsfähige Plattform für die Wirksamkeit von Medikamenten/Impfstoffe in einer wirklich in vivo-Umgebung. In diesem Werk haben wir Beispiele für immunologische Eingriffe zur Verfügung gestellt, die die vivoCTL-Reaktionen ankurbeln (Abbildung 1 und Abbildung2).

Wie andere routinemäßig verwendete Tötungsuntersuchungen liefern in vivo Cytotoxicity-Assays keine direkten Informationen über die Fähigkeit von CTLs, von einem Ziel zum anderen zu recyceln, bevor sie erschöpft werden. Darüber hinaus haben wir mehrere Tumorzelltypen als potenzielle Zielzellen in vivo Zytotoxizitäts-Assays getestet, wenn auch bisher vergeblich. Das liegt einfach daran, dass Tumorzellen die Milz nach dem Injekt i.v. nicht in nachweisbaren Zahlen erreichen. Daher kann das Verlassen von Maussplenozyten als Zielzellen als inhärente Einschränkung von vivo zytotoxizären Assays angesehen werden. Bemerkenswert ist jedoch, dass Adoptivübertragungen von Splenozyten leicht in mehreren anderen Organen (zusätzlich zur Milz), zum Beispiel in der Leber, zu finden sind. Daher kann die Ag-spezifische CTL-Funktion in mehreren Organen oder Geweben beurteilt werden.

Wir haben in vivo Zytotoxizität-Assays für die Untersuchung der Immunominanz in T Ag-spezifischen TCD8 -Reaktionen16,17optimiert. Zahlreiche Werkzeuge und Reagenzien stehen zur Verfügung, um diese Reaktionen im Kontext von Antitumorimmunität und Therapie zu untersuchen. Die im hier beschriebenen Protokoll verwendete Fibrosarko-Zelllinie (d.h. C57SV-Zellen) führt nicht zu Tumoren bei immunkompetenten Mäusen. Daher ist es ein nützliches Instrument bei der Untersuchung der Antitumorimpfung. T Ag-getriebene neoplastische Transformation in ausgewählten Geweben hat mehrere wertvolle Modelle von autochthonen Krebs hervorgebracht. Zum Beispiel beherbergen SV11-Mäuse, die in ihren Hirnventrikeln 35 choroide Plexuspapillomeentwickeln , nicht endogene T Ag-spezifische TCD8, weil diese Zellen im Thymus ausgesucht und gelöscht werden. Die Übertragung von C57BL-/6 Splenozyten in sublethals bestrahlte, tumortragende SV11-Mäuse führt jedoch zu einer erweiterten Kontrolle der Tumoren, die Berichten zufolge mit der vivo-Grundierung des Standorts IV-spezifisch TCD836,37 in Verbindung gebracht wird. . Im transgenen Adenokarzinom des Mausprostat-Modells38schwindet die IV-spezifische Reaktion der Website mit Fortschreiten der Bösartigkeit. Die ansonsten immunekzessiven standortspezifischen T-CD8-Zellen entgehen jedoch einer negativen Selektion im Thymusundvermeiden auch periphere Toleranzmechanismen 21. Dies bietet ausreichend Möglichkeiten für experimentelle therapeutische Eingriffe, die sich um standortspezifische T-CD8-Funktionen drehen. In vivo sollte sich die Untersuchung und mögliche Umkehrung der immunologischen Toleranz in verschiedenen Modellsystemen, auch im T-Ag-Erkennungsmodell, als informativ erweisen.

Die Immunominanz ist ein konsistentes Merkmal von T-CD8-Reaktionen, die nicht nur gegen Tumor Ags, sondern auch gegen pathogene Epideogene erzeugt werden. In der Tat haben wir zuvor in vivo Zytotoxizität Assays verwendet, um die Immunodominanz in Anti-Influenza-TCD8 -Reaktionen 12 zu untersuchen. Daher kann der in diesem Protokoll beschriebene optimierte Test modifiziert und in einer Vielzahl von immunologischen Anwendungen eingesetzt werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten of Health Research (CIHR) unterstützt, die MOP-130465 und PJT-156295 an SMMH vergeben. JC wird teilweise von einem Queen Elizabeth II Graduate Stipendium in Wissenschaft und Technologie des Ministeriums für Ausbildung, Hochschulen und Universitäten in Ontario unterstützt. CEM erhielt ein Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (doctoral) von Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

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