En in vitro-protokoll for evaluering av MicroRNA nivåer, funksjoner og assosierte mål gener i tumor celler

JoVE Journal
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen bruker en sonde-basert sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), en sulforhodamine B (SRB)-analysen, 3 ' uoversatt regioner (3 ' UTR) kloning, og en luciferase analysen for å verifisere målet gener av en miRNA av interesse og å forstå funksjonene til miRNAs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Seo, H. A., Hwang, C. Y., Moeng, S., Park, J. K. An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells. J. Vis. Exp. (147), e59628, doi:10.3791/59628 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) er små regulatoriske RNAs som er anerkjent for å modulere en rekke intracellulære signalering trasé i flere sykdommer, inkludert kreft. Disse små regulatoriske RNAs hovedsakelig samhandle med 3 ' uoversatt regioner (3 ' UTR) av deres mål Messenger RNAs (mRNAs) til slutt resulterer i Hemming av dekoding prosesser av mRNAs og styrking av målet mRNA degradations. Basert på uttrykks nivåer og intracellulære funksjoner, miRNAs er i stand til å tjene som regulatoriske faktorer av kreftfremkallende og tumor-undertrykkende mRNAs. Identifisering av bona fide mål gener av en miRNA blant hundrevis eller kanskje tusenvis av beregningsmessig spådd mål er et avgjørende skritt for å skjelne rollene og grunnleggende molekylære mekanismer av en miRNA av interesse. Ulike miRNA mål prediksjon programmer er tilgjengelig for å søke mulig miRNA-mRNA interaksjoner. Men det mest utfordrende spørsmålet er hvordan man skal validere direkte mål gener av en miRNA av interesse. Denne protokollen beskriver en reproduserbar strategi for viktige metoder for hvordan å identifisere miRNA mål knyttet til funksjonen til en miRNA. Denne protokollen presenterer en praktisk guide på trinn-for-trinn-prosedyrer for å avdekke miRNA nivåer, funksjoner og relaterte mål mRNAs ved hjelp av sonde-basert sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), sulforhodamine B (SRB) analysen etter en miRNA etterligne transfeksjoner , dose respons kurve generasjon, og luciferase analysen sammen med kloning av 3 ' UTR av et gen, som er nødvendig for riktig forståelse av rollene til individuelle miRNAs.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) er de små regulatoriske RNAs som i hovedsak modulere prosessen med oversettelse og degradering av Messenger RNAs (mRNAs) ved å reagere på de 3 ' uoversatt regioner (3 ' UTR) i bona fide mål gener1. Uttrykk for miRNAs kan reguleres av transcriptional og post-transcriptional mekanismer. Ubalansen av slike regulatoriske mekanismer bringer ukontrollert og karakteristiske miRNAs uttrykks nivåer i mange sykdommer, inkludert kreft2. En enkelt miRNA kan ha flere interaksjoner med ulike mRNAs. Tilsvarende kan en individuell mRNA styres av ulike miRNAs. Derfor er intracellulære signalering nettverk intrikat påvirket av utpreget uttrykt miRNAs der fysiologiske lidelser og sykdommer kan initieres og forverret2,3,4, 5 andre priser , 6. selv om den endrede uttrykk for miRNAs har blitt observert i ulike typer kreft, den molekylære mekanismer som modulere oppførsel av kreftceller i forbindelse med miRNAs er fortsatt i stor grad ukjent.

Akkumulere bevis har vist at kreftfremkallende eller tumor-undertrykkende roller miRNAs avhenge av hvilke typer kreft. For eksempel, ved å målrette stallgreip boksen O3 (FOXO3), miR-155 fremmer celle spredning, metastasering, og chemoresistance av tykktarmskreft7,8. I kontrast er begrensningen av glioma celle invasjon indusert av miR-107 via regulering av neurogenic geometriske hakk homologe protein 2 (NOTCH2) uttrykk9. Vurderingen av miRNA-Target interaksjoner i forbindelse med miRNA funksjoner er en uunnværlig del for å bedre forstå hvordan miRNAs regulere ulike biologiske prosesser i både sunne og syke stater10. I tillegg kan oppdagelsen av bona fide mål (er) av miRNAs ytterligere gi en finjustert strategi for en miRNA-basert terapi med ulike anti-kreft narkotika. Den største utfordringen innen miRNAs er imidlertid identifikasjonen av direkte mål for miRNAs. Her er detaljerte metoder presentert som reproduserbar eksperimentelle tilnærminger for miRNA målet genet besluttsomhet. Vellykket eksperimentell design for miRNA målet identifikasjon innebærer ulike trinn og betraktninger (figur 1). Sammenligning av modne miRNA nivåer i tumorceller og normale celler kan være en av de vanligste prosedyrene for å velge en miRNA av interesse (figur 1a). Den funksjonelle studien av en utvalgt miRNA å oppdage virkningene av en miRNA på celle spredning er viktig å innskrenke listen over beste potensielle kandidat mål av en miRNA av interesse (figur 1B). Basert på eksperimentelt validerte funksjoner av miRNAs, en systematisk gjennomgang av litteratur og database i selskap med en miRNA mål prediksjon programmet er nødvendig for å søke den mest relevante informasjonen om gen funksjoner (figur 1C). Identifisering av virkelige målet gener av en miRNA av interesse kan oppnås ved å implementere eksperimenter som luciferase analysen sammen med kloning av 3 ' UTR av et gen, sanntids PCR, og vestlige blotting (figur 1d). Målet med den nåværende protokollen er å gi omfattende metoder for viktige eksperimenter, sonden-baserte sanntids polymerase kjedere reaksjon (PCR), sulforhodamine B (SRB) analysen etter en miRNA etterligne transfeksjoner, dose-respons kurve generasjon, og luciferase analysen sammen med kloning av 3 ' UTR av et gen. Den nåværende protokollen kan være nyttig for en bedre forståelse av funksjonene til individuelle miRNAs og konsekvensen av en miRNA i kreft terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. modne MicroRNA (miRNA) Expression analyse

  1. Modne miRNA komplementære DNA (cDNA) syntese
    1. Tilsett 254 i totalt RNA og 4,5 μL av deoxyribonuclease I (DNase I) blandinger, og tilsett deretter ultrarent vann i PCR-rør for å ta opp til 18 μL (fig. 2a). Forbered reaksjonen for hver total RNA-prøve renset fra flere cellelinjer med nok mengde DNase I blandinger basert på det totale antall reaksjoner.
      Merk: DNase I blandinger består av DNase I (1,8 μL), ribonuklease inhibitor (0,3 μL) og 25 mM MgCl2 (2,4 μL). For å reproduserbar anskaffe total RNA, ble en Kol onne BAS ert utvinningsmetode applicated i stedet for å bruke en fenol-kloroform BAS ert utvinningsmetode. Det ble rapportert at utvinningsutbyttet for noen miRNAs kan varieres avhengig av antall celler ved bruk av en kloroform BAS ert utvinningsmetode på1,12.
    2. Ruge rørene i en termisk cycler. Kjør rørene i 10 min ved 37 ° c, og varme-Deaktiver DNase I med 5 min inkubasjons ved 90 ° c. Umiddelbart plassere rørene på isen etter inkubasjons.
    3. Transfer 7,1 μL av DNase jeg behandlet total RNA i 2 sett med nye rør og deretter legge til 1,5 μL av antisens primere for glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH)-genet (figur 2b).
      Merk: Mengden av total RNA for cDNA syntese blir 100 ng på dette trinnet. Bestanden konsentrasjonen av GAPDH antisens primere er 10 μM. legge GAPDH antisens primere er for generering av GAPDH cDNAs ved hjelp av en gen-spesifikke primer metoden.
    4. Ruge rørene ved hjelp av en termisk cycler. Start ved 80 ° c i 5 min, etterfulgt av reaksjonen ved 60 ° c i 5 min. Plasser rørene umiddelbart på is etter inkubasjons.
    5. Tilsett 3,4 μL av omvendt transkripsjon (RT) enzym blandinger i hver reaksjon (figur 2b). RT enzym blandinger er sammensatt av 100 mM deoxyribonucleotide triphosphates (0,15 μL), 10x RT buffer (1,5 μL), ribonuklease inhibitor (0,75 μL), og omvendt transkripsjon enzym (1 μL). Forbered nok mengde blandinger basert på det totale antall reaksjoner.
    6. Tilsett 3 μL av 5x-primere for en spesifikk miRNA i hver reaksjon (figur 2b).
      Merk: Totalt volum er 15 μL for hver reaksjon.
    7. Kjør rørene ved hjelp av en termisk cycler. Start ved 16 ° c i 30 min, etterfulgt av reaksjonen ved 42 ° c i 30 min, og til slutt ved 85 ° c i 5 min. Hold ved 4 ° c for gjenværende tid (fig. 2b). Single-strandet cDNAs er generert i dette trinnet for både en bestemt miRNA og GAPDH genet i samme tube.
  2. Sann tids polymerase kjedere reaksjon (PCR) og dataanalyse
    1. Fortynne hver cDNA med ultrarent vann for 1:49 forhold.
    2. Forbered reaksjonsblandinger for en bestemt miRNA og GAPDH (tabell 1). For påvisning av en bestemt miRNA og GAPDH, sette opp tre eksemplarer reaksjoner for hver cDNA prøven.
    3. Utfør sann tids PCR og dataanalyse (figur 2C). Analysere data ved hjelp av komparativ CT metode13,14.

2. MicroRNA (miRNA) MimicTransfection

Merk: miRNA-107 er valgt fra trinn 1. Siden miRNA-107 er ned-regulert i tumorceller sammenlignet med normale celler, kan det være spekulert i at miRNA-107 er en svulst undertrykkende miRNA. I tilfelle av en miRNA som er opp-regulert i tumorceller sammenlignet med normale celler (f.eks, miRNA-301), antisens Oligonukleotider mot miRNA-301 kan brukes for trinn 2, 3 og 4.

  1. Telle cellene med en telling-kammer enhet og plate cellene i en 96-brønn plate. Celle tetthet er 2 x 103 celler/100 μL for hver brønn. Ikke bruk cellekultur medier som inneholder penicillin-Streptomycin (P/S) fordi P/S kan redusere transfeksjoner effektivitet.
  2. Forbered et sett med transfeksjoner blandinger for å transfect cellene i flere endelige konsentrasjoner av miRNA kontroll etterligne og miRNA-107 etterligne på neste dag (Figur 3).
    1. Fra aksjen (25 μM konsentrasjon) av miRNA kontroll etterligne eller miRNA-107 etterligne, fortynne og legge tilsvarende mengde kontroll etterligne eller miRNA-107 etterligne i redusert serum Media sammen med en transfeksjoner reagens ved hjelp av mikrosentrifugen rør (figur 3a). Bland forsiktig oligo som inneholder blandinger ved hjelp av en micropipette. Den totale mengden av oligos (miRNA etterligne kontroll + miRNA-107 etterligne) bør være samme i hver brønn. Tomme brønner inkluderer 100 μL av cellekultur medier og reduserte serum medier som inneholder en transfeksjoner reagens uten celler.
  3. Etter en 10 min inkubasjons i en cellekultur hette, bland forsiktig oligo som inneholder blandinger igjen og legg deretter til 50 μL av blandinger i hver brønn. Hold de transfekterte cellene i en cellekultur inkubator. Erstatt transfeksjoner reagens som inneholder medier med fersk cellekultur medier som inneholder både fosterets storfe serum (FBS) og P/S etter 6-12 h inkubasjons. Ytterligere ruge cellene for 72 h. Den totale behandlingsvarigheten av miRNA etterligne er 96 h.

3. Sulforhodamine B (SRB)-analysen

  1. Celle fiksering
    1. Fjern cellekultur mediene i hver brønn av platen og fyll umiddelbart 100 μL av 10% Trekloredikksyre syre (TCA) i hver brønn. Nøye aspirer cellen kultur Media fra hver brønn for å unngå eventuelle celle skade og avløsning fra bunnen.
      Merk: Klargjør 40% TCA ved å tilsette 20 g TCA-pulver i 50 mL destillert vann. Fra 40% TCA, gjør 10% TCA ved fortynning 40% TCA med destillert vann ved 1:3 fortynning ratio.
    2. Hold platen som inneholder 10% TCA i kjøleskap (4 ° c) i 1 time.
    3. Vask platen flere ganger ved submerging i vannbeholderen og tørk den. Fjern overflødig vann fra innsiden av brønnene ved å trykke på platen til det ikke er vann igjen i brønner. La platen stå på en laboratoriebenk for å tørke den før du går til neste trinn.
  2. Farging av celler
    1. Pipetter 50 μL av 0,4% SRB løsning i hver brønn inkludert blanke brønner. Rist platen forsiktig til 0,4% SRB-løsning dekker hele bunnen av brønnene.
      Merk: Klargjør og bruk 0,4% SRB-oppløsning ved å tilsette 0,4 g SRB pulver i 100 mL 1% eddiksyre. Rist løsningen nøye for å blande den. Pakk flasken med 0,4% SRB-løsning i et lett beskyttende materiale som aluminiumsfolie. Oppbevar 0,4% SRB løsning i kjøleskap.
    2. Etter inkubasjons i 40 min til 60 min., vask platen ved å skylle den med 1% eddiksyre. Vask platen til det ubundne fargestoffet er helt vasket bort (figur 3b).
    3. La platen stå på en laboratoriebenk for å tørke den før du går til neste trinn.
      Merk: Platen skal være helt tørket før du går til trinn 3,3.
  3. Absorbansen måling
    1. Pipetter 100 μL av Tris base løsning (10 mM) i de tilsvarende brønnene, inkludert blanke brønner. Hold platen på en shaker i 10 min. mål absorbansen ved 492 NM.

4. generering av en dose-Response Curve

  1. Analysere SRB analysedata i et regneark. Trekk den tomme absorbansen fra de absorbansen verdiene for hver gruppe, og Beregn gjennomsnittet (AVE) og standardavviket (STD) for absorbansen verdier for hver gruppe.
  2. Beregn prosentandelen av gjennomsnittlig absorbansen (AVE%) og standardavvik (STD%) av hver gruppe ved hjelp av absorbansen verdier for SRB-analysen.
    Merk: Det AVE% av miRNA administrere etterligne behandlet gruppe er 100%. Beregn STD% ved hjelp av følgende formel: STD% = (STD for hver gruppe/AVE-absorbansen av kontroll etterligner behandlet gruppe) x 100.
  3. Importer rådata, inkludert behandlings konsentrasjoner, AVE% og STD% i programvaren ved å justere disse dataene vertikalt. Siden log 0 ikke er definert, setter du den første konsentrasjonen av X-aksen til en verdi som er nær 0 (f.eks. 0,01).
  4. Klikk på Opprett graf -fanen og velg enkle scatter-feilfelt. Velg regneark Kol onner som symbol verdier og klikk neste. I data format panelet velger du XY-par og klikker på neste. Velg tilsvarende datakolonner i det valgte data panelet. Klikk Fullfør for å opprette plottet.
    Merk: X-aksen representerer konsentrasjonene, Y-aksen angir prosentandelen av gjennomsnittlig absorbansen for hver konsentrasjon (AVE-%), og feilfeltene påpeker prosenten av standardavviket for hver konsentrasjon (STD%).
  5. Dobbeltklikk X-aksen for å endre Skalerings typen og skaleringen for aksen. Endre typen skala fra lineær til logg. Endre start-og slutt områdenummeret til henholdsvis 0,01 og 200.
  6. Høyreklikk på et scatter plott, Velg kurve Fit, og gå til underkategori brukerdefinert. Velg dose-svar kurve, klikk Neste knapper, og klikk deretter finish knapp. Kurven for dose respons genereres nå sammen med en rapportkategori (figur 4a).
    1. Hvis du vil angi Formel 1 i programvaren for generering av en dose svar kurve, klikker du analyse -kategorien og velger Veiviser for regresjon. Gå til brukerdefinert i formel kategorien, og klikk deretter ny -knappen. Sett inn formel 1, variabler, innledende parametere og begrensninger i de tilsvarende tomme boksene (figur 4b, C). Klikk Legg til som -knappen og angi navnet på ligningen som dose-Response kurve. Lignings navnet er nå generert i den under kategorien brukerdefinert i ligningen kategorien. f angir prosentandelen av celle levedyktighet (% celle levedyktighet) i Formel 1.

Ligning 1
Equation 1

  1. Gå til rapport fanen, og kontroller verdiene n, k og R.
    Merk: y0 indikerer 100% celle levedyktighet av Mirna kontroll etterligne behandlet gruppe, n indikerer Hill-type koeffisient (skråningen av et plott), k indikerer konsentrasjonen av mirna-107 etterligne som produserer en 50% av mirna-107 etterligne maksimal effekt (halvparten maksimal hemmende konsentrasjon, IC50), og R indikerer den gjenværende upåvirket fraksjonen (motstands fraksjonen)15. Ligningen som brukes til å generere en dose svar kurve, gjenkjenner området fra y0 til R-verdi (hvis noen) som 100% (figur 4a). Derfor er det nødvendig å anskaffe den justerte k (IC50)-verdien som er beregnet basert på området fra y0 til en verdi på null (figur 4a). Justert k (IC50) sammen med andre ICx verdier (foreksempel ic10 til IC90) kan fås ved hjelp av ligning 2, som er avledet fra Formel 1. Avledning av formel 2 fra Formel 1 er angitt i supplerende figur 1.

Ligning 2
Equation 2

  1. Dobbeltklikk venstre museknapp i cellen der formel 2 er brukt. Ved hjelp av ligning 2 og parametere fra den genererte dose respons kurven, er den tilgjengelig for å beregne de justerte verdiene for ICx, fra IC10 til IC90 (figur 4d).
  2. Skriv inn likhetstegnet etterfulgt av formelen som begynner med en hakeparentes i cellen. Når du skriver inn formelen, reparerer du verdien for n, k og R som de absolutte cellereferansene ved å legge til dollartegnet i tilsvarende kolonne og rad, slik at disse faste verdiene ikke vil bli endret når du automatisk fyller formelen ned til radene (figur 4d). Alternativt kan justerte verdier beregnes manuelt ved hjelp av formel 2.
    Merk: IC90 -verdi er ikke fastslått fordi R-verdien er større enn 10. I tillegg, hvis R-verdien er over 20, bestemmes heller ikke verdien av IC80 (figur 4d).

5. verifisering av direkte mål gen av en MicroRNA av interesse

Merk: Etter å ha utført funksjonelle eksperiment som SRB analysen, er miRNA-107 bekreftet som en svulst undertrykkende miRNA og det er svært gjennomførbart at miRNA-107 direkte mål oncogenes. Sjekklisten over alle anslåtte mål gener ved hjelp av en miRNA mål prediksjon program som TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/), og deretter innskrenke til potensielle kandidat mål basert på funksjonen til et gen i databaser, inkludert PubMed og GeneCards.

  1. Primer design for kloning av 3 ' uoversatt region (UTR)
    1. Sett navnet på et gen i GeneCards (https://www.genecards.org/) og klikk på symbolet på et gen. Vurdere å Ensembl Genova nettleser ved å klikke ENSEMBL ID av et gen, og klikk deretter transkripsjoner ID i transkripsjon tabellen. Etter det, klikk exoner eksisterte i transkripsjon-baserte viser listen til venstre.
    2. Kopier nukleotid sekvenser av 3 ' UTR og lim den inn i primer design program. Kopier sekvensene på nytt fra dette programmet, og lim den inn i et tekstbehandlingsprogram. Sjekk tilstedeværelsen av miRNA bindende sekvenser i tillegg til tilstedeværelsen av begrensning enzymer nettsteder som brukes for kloning.
      Merk: Hvis det ikke er noen begrensning enzym anerkjennelse nettsteder innenfor 3 ' UTR, begrensningen enzymer valgt for kloning kan brukes til neste trinn.
    3. I primer designprogrammet, godta 3 ' UTR sekvenser og begynne å designe fremover og revers primere med følgende tilstand. Lengde: 20-30 nukleotider, TM: 45-58 ° c, GC%: 40-60%. Forskjellen mellom TM-verdiene til de to primere bør være mindre enn 5 ° c. Primer sekvensene som brukes i denne studien er gitt i supplerende figur 2. Legg begrensning enzym anerkjennelse sekvenser samt 4 tilfeldige nukleotider til designet primere.
  2. Gradient PCR
    1. Forbered 25 μL av PCR reaksjonsblandinger inkludert designet primere per en annealing temperatur (tabell 2). Forbered nok mengde blandinger basert på det totale antall reaksjoner. Bland løsningen ved å pipettering og tilsett 25 μL reaksjonsblandinger i hvert rør. Sentrifuger rørene i noen sekunder.
    2. Utfør 35-40 PCR-sykluser fra denaturering trinn til forlengelses trinn. Definer PCR-syklusen som følgende trinn: 98 ° c i 1 min (1 syklus, polymerase aktiverings trinn), 95 ° c i 10 s (denaturering trinn), 45 ° c-68 ° c i 30 s (annealing trinn), 68 ° c (forlengelses trinn, 10 s-1 min per 1000 BP), 68 ° c i 3 min (avslutnings trinn) , og til slutt avkjøles til 4 ° c.
    3. Kjør PCR-produktene og sjekk båndene på en 1% agarose gel med DNA-stiger. Finn den beste annealing temperaturen (figur 5a). Forsterk 3 ' UTR av et gen igjen med den beste annealing temperaturen for neste trinn.
  3. Dobbel fordøyelse
    1. Gjør reaksjonsblandinger inkludert to restriksjon enzymer, XhoI (eller AsiSI) og NotI, i et rør (tabell 3). Ruge blandinger for 3-4 h ved hjelp av et vannbad (37 ° c).
    2. Kjør dobbel fordøyd produkter på en 1% agarose gel og deretter kutte bandene under UV-lys. I tilfelle av luciferase vektorer, før du kjører på en gel, reagerer doble fordøyd vektorer med 10 U av alkaliske phosphatases for en annen 1 time for å hindre en recircularization under ligation trinn.
    3. Rens den doble fordøyd PCR produkter og luciferase vektorer fra excised band.
  4. Ligation av PCR produkter inn i luciferase vektorer
    1. Lag 20 μL av ligation reaksjonsblandinger, inkludert DNA-ligase (Tabell 4).
      Merk: Molar forholdet mellom PCR-produkt (INSERT) og luciferase vektor kan være 3:1. 1:1 eller 2:1.
    2. Sentrifuger kort for 10-15 s og ruge ved 16 ° c over natten ved hjelp av en termisk cycler.
      Merk: Alternativt kan slangen inkubert ved 4 ° c i 2-3 dager for ligation. I dette trinnet vil PCR-innsatsen bli klonet til området som er plassert nedstrøms for et renilla reporter gen (figur 5B). Binding av miRNAs til klonet 3 ' UTR av et gen kan reduseres i renilla aktivitet. Firefly-luciferase er for normalisering av renilla uttrykks nivåer.
  5. Transformasjon og koloni PCR
    1. Tilsett ligation blandinger (3-5 μL) i røret som inneholder kompetente celler. Trykk forsiktig på røret og oppbevar det på is (20 min).
      Merk: Frigjør kompetente celler på is før du legger til ligation blandinger.
    2. Raskt og forsiktig overføre røret til en varme blokk. Etter et varme sjokk (42 ° c i 30 s-1 min), plasser slangen på is i 20 minutter.
    3. Spre kompetente celler på Luria-Bertani (LB) agar plate. Dyrke kompetente celler i en inkubator (37 ° c) over natten.
      Merk: Ampicillin (50-100 μg/mL) finnes i agar plate.
    4. Velg en enkelt koloni og resuspend E. coli i en av de 8-stripe rør som inneholder ultrarent vann. Gjenta dette trinnet for å resuspend E. coli fra tilfeldig utvalgte 4-8 kolonier (figur 5c).
    5. Overføring 25 μL av E. coli suspensjon i et annet sett med 8-stripe rør. Nå er det 2 sett med rør av E. coli suspensjon.
      Merk: Ett rør er for koloni PCR og en annen er for inoculation. E. coli suspensjon for inoculation kan lagres midlertidig ved 4 ° c (figur 5c).
    6. Utfør kolonien PCR ved hjelp av E. coli suspensjon. Dette trinnet er å avgjøre om koloniene inneholder en innsats. Velg de beste koloniene å vaksinere og isolere luciferase vektorer harboring 3 ' UTR av et gen (figur 5c).
      Merk: Gjenta trinn 5.1-5.5 for hver 3 ' UTR av utvalgte gener. Følg tilstanden til PCR-reaksjonen vist i tabell 2 ved å erstatte det genomisk DNA med E. coli suspensjon.
  6. Luciferase analysen
    1. Forbered en 24-brønn plate. Bruk 1-2 x 104 celler i 500 μL cellekultur Media for hver brønn. Ikke bruk cellekultur medier som inneholder P/S for transfeksjoner, fordi bruk av P/S kan redusere transfeksjoner effektivitet.
    2. Transfect 50 ng av luciferase vektorer i cellene med kontroll etterligne eller en bestemt miRNA etterligne ved hjelp av en transfeksjoner reagens (figur 5D). Hvis screening virkningene av en bestemt miRNA etterligne på mer enn én konsentrasjon, holde den totale mengden oligos samme i hver brønn (se trinn 2).
    3. Vask innsiden av brønnene to ganger ved hjelp av fosfat bufret saltvann (PBS) på neste dag.
    4. Påfør 200 μL lyse Rings reagens i brønnene og utfør cellelyse tilstrekkelig før du måler luciferase aktivitet.
      Merk: Oppbevar platen på en riste plate minst 15 min.
    5. Overfør 5-10 μL av celle lysat inn i det nye røret og tilsett 100 μL av reagens I. Bland løsningen umiddelbart ved å pipettering og lese Firefly luciferase-aktiviteten ved hjelp av en luminometeret.
      Merk: Les Firefly luciferase aktivitet for 10-15 s.
    6. Tilsett 100 μL av reagens II i samme rør, og bland deretter med pipettering to ganger. Les renilla luciferase aktivitet for 10-15 s ved hjelp av en luminometeret. Gjenta trinn 5.6.5 og 5.6.6 for hver prøve.
    7. Beregn forholdet mellom renilla og Firefly (figur 5e).
      Merk: Aktiviteten til Firefly representerer den transfeksjoner effektiviteten til luciferase konstruksjoner i cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket og nøyaktig bekreftelse på miRNA nivåer er viktig for tolkningen av data som klassifisering av miRNAs er mulig basert på den forventede roller miRNAs i utvikling og progresjon av en sykdom. Nivåene av miRNA-107 og miRNA-301 ble målt i tre bukspyttkjertel cellelinjer ved hjelp av sonde-baserte kvantitative PCR. Syntesen av cDNAs av både en bestemt miRNA og et referanse gen i samme reaksjon kan øke reproduserbarheten av data. PANC-1 og CAPAN-1 er menneskelige bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom cellelinjer, mens HPNE er en udødeliggjort bukspyttkjertel duct cellelinje transduced med et retroviral uttrykk vektor harboring den menneskelige telomerase Reverse transkriptase (hTERT) genet. miRNA-107 ble signifikant redusert i PANC-1 og CAPAN-1-celler sammenlignet med HPNE-celler (figur 2C). Nivåene av miRNA-301 var betydelig opp-regulert i PANC-1 og CAPAN-1 celler sammenlignet med HPNE celler. Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporter som miRNA-107 er epigenetically deaktivert i bukspyttkjertelen kreftceller og at miRNA-301 nivåer er høyere i bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom celler enn vanlig bukspyttkjertel ductal celler16, 17av dem.

Den 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysen reflekterer celle metabolske aktiviteter. Denne funksjonen har en betydelig høyere mulighet til å erverve mangelen på sammenhengen mellom MTT-analysen og det totale celle tallet siden analysen forhold inkludert en slags behandling reagenser kan alvorlig påvirke enzymatisk reduksjon av tetrazolium 18,19. For å overvinne denne begrensningen, den sulforhodamine B (SRB) analysen ble brukt for å måle effekten av miRNA-107 på celle spredning å identifisere potensielle biologiske funksjoner av miRNA-107. Mengden bundet SRB fargestoff i de faste cellene kan brukes som et surrogat av endringen i totalt antall celler. Den SRB analysen i denne studien viser tydelig at spredning av PANC-1 celler redusert etter en miRNA-107 etterligne transfeksjoner (Figur 3). Den miRNA-107 konsentrasjon som forårsaket en hemming av 50% celle levedyktighet (IC50) ble bestemt av generering av en dose-respons kurve. I tillegg er anvendelsen av ligning 2 fordelaktig for å beregne alle mulige hemmende konsentrasjoner (ICx) for nøyaktig evaluering av effekten av miRNA-107 (Figur 4).

Undersøkelse av sammenhengen mellom miRNAs og mRNAs nivåer er en effektiv måte for miRNA målet identifikasjon fordi miRNAs kan regulere målet genet nivåer via nedbrytning av mRNAs2,20. Men siden miRNAs også opptre på translational nivå uten å påvirke prosessene av mRNA fornedrelse, den eksperimentelle godkjenningen av miRNA-Target genet interaksjoner med luciferase analysen er et viktig skritt. Den største fordelen med en luciferase analysen er at denne analysen kan utelukke endringer av mRNA nivåer regulert av nedbrytning av mRNAs21. Derfor er kloning av 3 ' UTR av anslåtte mål gener et viktig skritt for å identifisere reelle mål gener av en miRNA interesse i forbindelse med sanntids PCR og Western Blot eksperimenter. En effektiv utnyttelse av dual reporter vektorer gjør det mulig å erverve entydige eksperimentelle data siden måling av kontroll reporter nivåer kan redusere eksperimentelle variasjoner som antall celler. Normalisering prosesser av luciferase analysen data ervervet fra vektorer som inneholder 3 ' UTR av en synuclein gamma (SNCG) genet er vist i figur 5e. I tillegg screening av 11 potensielle spådd mål av miRNA-107 viser tydelig at bare SNCG, en positiv regulator av tumor cellevekst22,23, direkte samhandler med miRNA-107 i PANC-1 celler (figur 6). Dette funnet indikerer at miRNA-107 kan negativt regulere spredning av PANC-1 celler ved modulerende SNCG uttrykket.

Figure 1
Figur 1: eksperimentell design for miRNA mål identifikasjon. Dette diagrammet viser flyten av en eksperimentell design som bidrar til å identifisere målet for en miRNA. (A) analyse av eldre miRNA uttrykk nivåer og valg av en miRNA av interesse. (B) tre eksperimenter, slik som miRNA etterligne TRANSFEKSJONER, SRB analysen, og generering av en dose respons kurve kan gjennomføres for den funksjonelle studien av utvalgte miRNAs. (C) for å innskrenke kandidat mål gener av en miRNA interesse, er det fordelaktig å sjekke informasjon og funksjon av anslåtte mål gener i mål prediksjon programmer, PubMed, og GeneCard. (D) etter å oppdage noen potensielle kandidat mål gener av en miRNA av interesse, er det mulig å utføre praktiske eksperimenter som kloning av 3 ' UTR av mRNAs, luciferase analysen, sanntids PCR, og Western Blot å endelig bevise direkte mål gener av en miRNA av interesse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eldre miRNA uttrykk analyse. (A) Legg til total RNA fra hver cellelinje (PANC-1, CAPAN-1 og HPNE), DNase i blandinger, og ultrarent vann i merket Strip-rør. Total volum i hvert rør er 18 μL (PANC-1 og CAPAN-1 er kreftcelle linjer i bukspyttkjertelen, mens HPNE er en vanlig bukspyttkjertel kanal cellelinje). (B) Transfer 7,1 ΜL av DNase jeg behandlet blandinger i 2 sett med nye Strip-rør, og 1,5 μL av antisens primere for et GAPDH-genet er også lagt til i hvert rør. Ruge PCR Strip-rør ved angitte reaksjonsbetingelser. Deretter legger RT enzym blandinger og 5x RT primere for en bestemt miRNA (miRNA-107 eller miRNA-301) i sine utpekte rør, og deretter re-ruge rørene ved angitte forhold. Single-strandet cDNAs for en bestemt miRNA og GAPDH genereres. (C) eldre miRNA-107 og miRNA-301 nivåer ble bestemt av sonden-baserte sanntid PCR ved hjelp av total RNA ISOLERT fra PANC-1, CAPAN-1, og HPNE celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: etterligne transfeksjoner og SRB analysen. (A) Top panelet viser fortynning av miRNA kontroll etterligne og miRNA-107 etterligne å forberede transfeksjoner blandinger. Utvalget av endelige konsentrasjoner av miRNA-107 etterligner er 0 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM og 100 nM. Totalt volum i hver kolonne er for transfeksjoner av celler i en brønn av en 96-brønn plate. Nederste panel viser et eksempel på skalering opp transfeksjoner blandinger for å forberede nok mengde blandinger for transfeksjoner av cellene i 4 brønner på en indikert konsentrasjon. Deretter legger du til 50 μL av blandinger i hver brønn ved å følge det foreslåtte formatet for transfecting miRNA kontroll etterligne med miRNA-107 etterligne. Denne platen ble brukt for SRB analysen, som inkluderer celle fiksering, celle farging, og absorbansen måling. (B) faktisk bilde av den 96-brønn plate som viser SRB fargede celler. Dette bildet viser tydelig at antall PANC-1 celler avtar som konsentrasjonen av miRNA-107 etterligne øker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: generering av en dose respons kurve. (A) representative dose-respons kurve av miRNA-107 ETTERLIGNE transfekterte PANC-1 celler. Transfekterte celler ble inkubert kontinuerlig for 96 h. parametere anskaffet fra dose respons kurven vises også. (B) ligningen, variablene, de første parametrene og begrensningene, sammen med beskrivelsene av definisjoner og verdier. (C) sett definisjonene og verdiene i de tilsvarende panelene i programvaren. Den "f" indikerer% cellen levedyktighet (for eksempel verdien av "f" er "90" og "10" på IC10 og IC90, henholdsvis). Den y0 verdien er 100 og indikerer 100% celle levedyktighet av miRNA kontroll etterligne transfekterte celler. Den "n" indikerer Hill-type koeffisient (skråningen av et plott). Den "k" indikerer konsentrasjonen av miRNA-107 etterligne som produserer en 50% av miRNA-107 etterligne maksimal effekt (IC50). "R" indikerer gjenværende upåvirket brøkdel (motstands fraksjonen). (D) dette panelet viser hvordan du beregner justerte ICx-verdier basert på parametrene (n, k og R) anskaffet fra Formel 1. Prosentandelen (%) celle levedyktighet i panelet representerer "f" i Formel 1 og beregnes ved å trekke x-verdien av hver ICx fra y0 (100). Formel 2 i formellinjen i regnearket er angitt som "= ((100-D3)/(D3-$B $5)) ^ (1/$B $3) * $B $4)" for beregning av justert IC10 -verdi. Bruk ligning 2 til andre celler for å beregne andre ICx-verdier ved å trykke på venstre museknapp på den valgte cellen (rød farge) og dra ned til cellen av IC90 -verdi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: verifisering av direkte målet genet av en miRNA av interesse. Eksperimenter begynner med å designe primere for kloning av 3 ' UTR. Primere brukes for gradient PCR. (A) den beste annealing temperatur kan velges blant de seks indikerte annealing temperaturer å forsterke 3 ' UTR av et gen. Neste, dobbel fordøyelse er utført med begrensning enzymer og PCR produkter er ligaturer inn luciferase vektorer. (B) luciferase vektorer inneholder 2 reporter gener, Firefly og renilla luciferase, kan brukes til skjermen samspillet av miRNAs med 3 ' UTR av mRNAs. PCR-innlegg blir klonet i en region som er plassert nedstrøms for det renilla reporter genet. Ligaturer produkter ble forvandlet til kompetente celler og vokste celler på LB agar plate. (C) individuelle kolonier (#1 til #6) ble plukket opp og resuspendert i 50 μL av ultrarent vann. E. coli suspensjonen ble brukt for kolonien PCR og inoculation. Colony PCR er et praktisk verktøy for å velge de beste koloniene for inoculation og isolering av luciferase vektorer harboring 3 ' UTR av et gen. (D) for luciferase analysen, miRNA kontroll etterligne eller miRNA-107 etterligne var TRANSFEKTERTE i PANC-1 celler med luciferase konstruksjoner ved hjelp av en 24-brønn plate. (E) dette panelet demonstrerer representative rådata og beregning av forholdet mellom renilla å Firefly etter utføring av luciferase analysen for validering av en SNCG genet som en miRNA-107 mål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Screening av anslåtte mål gener av miRNA-107. Screening av interaksjoner mellom miRNA-107 og 3 ' UTR av anslåtte mål ble utført i PANC-1 celler ved hjelp av luciferase konstruksjoner. Basert på de negative virkningene av miRNA-107 på celle spredning, var potensielle kandidat gener bestemt for kloning og screening analyser. miRNA kontroll etterligne eller miRNA-107 etterligne ble transfekterte inn PANC-1 celler med luciferase konstruksjoner som inneholder 3 ' UTR av hvert valgte genet for 24 h. Forholdet mellom renilla og Firefly ble beregnet og normalisert basert på de målte nivåene av begge luciferases i PANC-1 celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Oppdagelsen Mirna GAPDH
Komponenter
Master mix for sonde-basert sanntids PCR (2x) 10 μL
Master mix for Dye-basert sanntids PCR (2x) 10 μL
Sonde blanding (5x) 4 μL
GAPDH-primere (1 μM hver) 4 μL
Utvannet cDNA (1:49) 6 μL 6 μL
Totalt volum 20 μL 20 μL

Tabell 1: betingelser som brukes for en bestemt miRNA og GAPDH-oppdagelse av sann tids PCR i denne studien.

Komponenter 1x reaksjon 7x reaksjon
5x buffer 5 μL 35 μL
dNTP-blanding (2,5 mM) 2 μL 14 μL
Grunning (10 μM hver) 1 μL 7 μL
Genomisk DNA (2 ng/μL) 16,5 μL 115,5 μL
Polymerase 0,5 μL 3,5 μL
Totalt volum 25 μL 175 μL

Tabell 2: sammensetning av PCR reaksjonsblandinger for forsterkning av 3 ' UTR i denne studien.

Komponenter 1x reaksjon
10x buffer 5 μL
PCR produkter eller vektorer PCR-produkter: 25 μL vektorer: 1-2 μg
XhoI (eller AsiSI) restriksjon enzym 2 μL
NotI restriksjon enzym 2 μL
Ultrarent vann x μL
Totalt volum 50 μL

Tabell 3: vilkår for dobbel fordøyelse av PCR-produkter og luciferase vektorer ved hjelp av XhoI (eller AsiSI) og NotI-enzymer i denne studien.

Komponenter 1x reaksjon
10x buffer 2 μL
Vektorer (dobbelt fordøyd) 50 av ng
PCR produkter (Sett inn) x μL
Ligase 200 for U
Ultrarent vann y μL
Totalt volum 20 μL

Tabell 4: ligation reaksjoner på doble FORDØYD PCR-produkter og luciferase vektorer med DNA-ligase i denne studien.

Supplerende figur 1: avledning av formel 2 fra Formel 1. Formel 2 er avledet fra Formel 1 for beregning av justerte ICx-verdier. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: primer informasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Strategier for fastsettelse av bona fide miRNA mål med funksjonene til en miRNA av interesse er uunnværlig for forståelsen av flere roller miRNAs. Identifisering av miRNA mål gener kan være en retningslinje for å tolke celle signalering hendelsene modulert av miRNAs i en celle. En avsløring av funksjonelt viktige mål gener av miRNAs kan gi den grunnleggende kunnskapen til å utvikle en miRNA-basert terapi i kreft.

Flere metoder som Microarrays, små RNA biblioteket sekvensering, dype sekvensering, Reverse transkriptase in situ PCR, og nordlige blotting kan brukes til å utforske miRNA uttrykks nivåer ved hjelp av total RNA isolert fra cellelinjer og vev24, 25,26. Høy gjennomstrømming profilering av miRNAs kan gi verdifull innsikt i genetisk grunnlaget av kreftutvikling. Sonden-baserte miRNA analysen er ofte brukt til å validere profilering data og er også egnet til skjermen noen miRNAs av interesse. Imidlertid er måling av modne miRNA nivåer ved hjelp av sonde-basert sanntid PCR begrenset til å avgjøre om modne miRNAs er regulert på transkripsjon trinn eller gjennom regulering av modning. Dye-basert virkelig-tid PCR og nordlig blotting ha blitt introdusert å mål miRNA forløper høyder27,28. Måling av miRNA forløpere sammen med modne miRNA nivåer kan videre gi informasjon om hvordan modne miRNA nivåer er regulert. Videre er en helhetlig forståelse av regulering av miRNA nivåer uunnværlig for utvikling av miRNA-baserte terapeutiske tilnærminger.

Celle spredning analyser som tetrazolium-basert MTT-analysen er gjeldende for skjermen virkningene av behandling reagenser som miRNA etterligner. Siden MTT analysen reflekterer cellen metabolske aktiviteter basert på tetrazolium reduksjon av mobilnettet oxidoreductases, er det mulig å observere mangelen på korrelasjon mellom MTT analysen og den totale celle nummer19. Alternativt er SRB-analysen tilgjengelig som den mest reproduserbar celle opplistings analysen18,19. Måling av mengden av SRB fargestoff bundet til Trekloredikksyre syre faste proteiner kan representere den totale celle nummer29. I tillegg SRB analysen i denne protokollen kan brukes til skjermen flere miRNA etterligner samt anti-kreft narkotika ved hjelp 384-brønn plater. Imidlertid har SRB analysen begrensninger som manuell screening. I tillegg er denne analysen ikke tilgjengelig for ikke-tilhenger celler. Siden miRNAs også spille en avgjørende rolle i Hematologic kreft som lymfom og myelom30, effektiv overvåking av celle spredning er nødvendig for å avdekke funksjonene til miRNAs. Carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) kan intracellulært merke de ikke-tilhenger cellene. CFSE brukes til å overvåke generering av voksende celler ved flyt flowcytometri31. I tillegg kan miRNAs påvirke invasjonen, metastasering, og programmert celle død. Derfor vil andre eksperimentelle teknikker som kombinerer med denne protokollen være mer praktisk for riktig forståelse av miRNA funksjoner, som til slutt bidrar til å identifisere multitudinous biologisk relevante mål av miRNAs.

Beregning av halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) er en viktig metode ikke bare for miRNA studier, men også for effektevaluering av andre anti-kreft narkotika. IC50 -verdier kan brukes til å sammenligne de potensielle virkningene av flere miRNAs-eller anti-Cancer-legemidler på celle spredning. Det har blitt demonstrert at kombinasjonen av en miRNA-basert terapi med anti-kreft narkotika kan gi en eksepsjonell mulighet til å forbedre anti-kreft stoffets effekt. Videre kan kombinasjonen av miRNAs med anti-kreft narkotika være en ny tilnærming for å overvinne chemoresistance32,33. For evalueringen av kombinasjons effektivitet, er det en fordel å beregne justerte ICx-verdier basert på vår protokoll for vurdering av kombinasjons indeks (CI) som tillater kvantitativ estimering av synergier eller motsetningen33, i 34.

Intracellulære signalering nettverk kan være allment uorganisert av anomalously uttrykt miRNAs i mange sykdommer, inkludert kreft. Men signalering nettverk convolutedly rammet av miRNAs er fortsatt stort sett ukjent siden den lille andelen av mål gener har blitt eksperimentelt validert, og målet gener er også regulert via ikke-kirkerettslig reagerer med miRNAs35. Likevel, vår strategi og protokoll er pålitelige metoder for å tyde den cellulære mekanismer for miRNAs. I tillegg kan vår protokoll videre utvides til å implementere og evaluere kombinasjonen av miRNAs og andre anti-kreft narkotika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2017R1D1A3B03035662); og Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube SPL Life Sciences 50015
24-well plate Thermo Scientific 142475
50 mL conical tube SPL Life Sciences 50050
6-well plate Falcon 353046
6x DNA loading dye Real Biotech Corporation RD006 1 mL
8-cap strip Applied Biosystems N8010535 For cDNA synthesis
8-tube strip Applied Biosystems N8010580 For cDNA synthesis
96-well plate Falcon 353072
Acetic acid Sigma A6283-1L 1 L
Agarose A Bio Basic D0012 500 g
Alkaline phosphatase New England Biolabs M0290S 10,000 U/mL
Ampicillin Bio basic Canada Inc AB0028 25 g
AriaMx 96 tube strips Agilent Technologies 401493 For real time PCR
AriaMx real-time PCR system Agilent Technologies G8830A qPCR amplification, detection, and data analysis
AsiSI New England Biolabs R0630 10,000 units/mL
CAPAN-1 cells ATCC HTB-79
Cell culture hood Labtech Model: LCB-1203B-A2
Counting chambers with V-slash Paul Marienfeld 650010 Cells counter
CutSmart buffer New England Biolabs B7204S 10X concentration
DMEM Gibco 11965-092 500 mL
DNA gel extraction kit Bionics DN30200 200 prep
DNA ladder NIPPON Genetics EUROPE MWD1 1 Kb ladder
DNase I Invitrogen 18068015 100 units
Dual-luciferase reporter assay system Promega E1910 100 assays
Fetal bovine serum Gibco 26140-079 500 mL
HIT competent cells Real Biotech Corporation(RBC) RH617 Competent cells
HPNE cells ATCC CRL-4023
LB agar broth Bio Basic SD7003 250 g
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 0.75 mL
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-075 0.75 mL
Luminometer Promega Model: E5311
Microcentrifuge tube Eppendorf 22431021
Microplate reader TECAN Infinite F50
miRNA control mimic Ambion 4464058 5 nmole
miRNA-107 mimic Ambion 4464066 5 nmole
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 50 prep
Mupid-2plus (electrophoresis system) TaKaRa Model: AD110
NotI New England Biolabs R3189 20,000 units/mL
Oligo explorer program GeneLink For primer design
Optical tube strip caps (8x Strip) Agilent Technologies 401425 For real time PCR
Opti-MEM Gibco 31985-070 500 Ml
PANC-1 cells ATCC CRL-1469
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122 100 mL
Phosphate buffer saline Gibco 14040117 1000 mL
Plasmid DNA miniprep S& V kit Bionics DN10200 200 prep
PrimeSTAR GXL DNA polymerase TaKaRa R050A 250 units
Shaker TECAN Shaking platform
Shaking incubator Labtech Model: LSI-3016A
Sigmaplot 14 software Systat Software Inc For dose-response curve generation
Sulforhodamine B powder Sigma S1402-5G 5 g
SYBR green master mix Smobio TQ12001805401-3 Binding fluorescent dye for dsDNA
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A 25,000 U
TaqMan master mix Applied Biosystems 4324018 200 reactions, no AmpErase UNG
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) Applied Biosystems 4427975 Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)
TaqMan miR RT kit Applied Biosystems 4366597 1,000 reactions
Thermo CO2 incubator (BB15) ThermoFisher Scientific 37 °C and 5% CO2 incubation
Trichloroacetic acid Sigma 91228-100G 100 g
Trizma base Sigma T4661-100G 100 g
Ultrapure water Invitrogen 10977-015 500 mL
Veriti 96 well thermal cycler Applied Biosystems For amplification of DNA (or cDNA)
XhoI New England Biolabs R0146 20,000 units/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5, (7), 522-531 (2004).
  2. Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19, (4), (2018).
  3. Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215, (5), 667-685 (2016).
  4. Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403, (1), 120-125 (2010).
  5. Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217, (6), 2185-2204 (2018).
  6. Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
  7. Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35, (11), 664-672 (2017).
  8. Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15, (4), 4781-4788 (2018).
  9. Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18, (12), (2017).
  10. Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27, (1), 16-23 (2013).
  11. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18, (1), (2018).
  12. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46, (6), 893-895 (2012).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3, (6), 1101-1108 (2008).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  15. Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26, (6), 591-598 (2018).
  16. Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9, (4), 1886-1895 (2017).
  17. Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9, (3), 293-301 (2009).
  18. van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
  19. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5, (4), e10202 (2010).
  20. Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29, (1), 1-7 (2008).
  21. Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. 117-127 (2013).
  22. Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37, (11), 14999-15005 (2016).
  23. Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277, (38), 35050-35060 (2002).
  24. Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2, (1), 189-205 (2013).
  25. Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120, (5), 1046-1054 (2007).
  26. Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4, (1), 107-115 (2009).
  27. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, (1), 31-38 (2008).
  28. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, (6), 1097-1108 (2007).
  29. Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6, (21), (2016).
  30. Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27, (3), 143-154 (2013).
  31. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, (9), 2049-2056 (2007).
  32. Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46, (3), 233-239 (2014).
  33. Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38, (11), 6309-6316 (2018).
  34. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70, (2), 440-446 (2010).
  35. Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45, (12), 7212-7225 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics