डीएनए द्वारा डीएनए अनुक्रम मान्यता उच्च-Throughput प्राइमाज़ प्रोफ़ेशनल का उपयोग कर

Biochemistry

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Summary

प्रोटीन बाइंडिंग माइक्रोरेयर (पीबीएम) जैव रासायनिक परख के साथ संयुक्त प्रयोगों डीएनए प्राइमर के बाध्यकारी और उत्प्रेरक गुणों को जोड़ते हैं, एक एंजाइम जो टेम्पलेट डीएनए पर आरएनए प्राइमर को संश्लेषित करता है। इस विधि, उच्च throughput प्राइमाज़ प्रोफाइलिंग (HTPP) के रूप में नामित, एंजाइमों की एक किस्म के डीएनए बाध्यकारी पैटर्न प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

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Abstract

डीएनए प्राइमेज़ कम आरएनए प्राइमर को संश्लेषित करता है जो डीएनए प्रतिकृति के दौरान डीएनए पॉलिमरेज द्वारा पिछड़े किनारा पर ओकाज़ाकी टुकड़े के डीएनए संश्लेषण को आरंभ करता है। डीएनए के लिए प्रोकैरियोटिक डीएनएजी की तरह प्राइमेस की बाइंडिंग एक विशिष्ट trinucleotide मान्यता अनुक्रम में होती है। यह Okazaki टुकड़े के गठन में एक महत्वपूर्ण कदम है. पारंपरिक जैव रासायनिक उपकरण है कि डीएनए primase के डीएनए मान्यता अनुक्रम निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है केवल सीमित जानकारी प्रदान करते हैं. एक उच्च throughput microarray आधारित बाध्यकारी परख और लगातार जैव रासायनिक विश्लेषण का उपयोग करना, यह दिखाया गया है कि 1) विशिष्ट बाध्यकारी संदर्भ (मान्यता साइट के flanking दृश्यों) अपने टेम्पलेट के लिए डीएनए प्राइमाज़ की बाध्यकारी ताकत को प्रभावित करती है डीएनए, और 2) डीएनए के लिए प्राइमेज़ की मजबूत बाध्यकारी अब आरएनए प्राइमर पैदावार, एंजाइम के उच्च processivity का संकेत. इस विधि पीबीएम और प्राइमाज़ गतिविधि परख को जोड़ती है और उच्च के रूप में नामित किया गया है-थ्रूपुट प्राइमाज़ प्रोफाइलिंग (HTPP), और यह अभूतपूर्व समय और मापनीयता में डीएनए primese द्वारा विशिष्ट अनुक्रम मान्यता की विशेषता की अनुमति देता है.

Introduction

एचटीपीपी डीएनए बाइंडिंग माइक्रोरेरे प्रौद्योगिकी का उपयोग जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ संयुक्त करता है (चित्र 1) डीएनए टेम्पलेट्स की विशिष्ट विशेषताओं की सांख्यिकीय रूप से पहचान करने के लिए जो डीएनए प्राइमेज़ की एंजाइमी गतिविधि को प्रभावित करता है। इसलिए, HTPP एक तकनीकी मंच है कि क्षेत्र में एक ज्ञान छलांग की सुविधा प्रदान करता है. प्रथम मान्यता साइटों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले शास्त्रीय उपकरणों में भारी मात्रा में डेटा प्राप्त करने की क्षमता नहीं है, जबकि एचटीपीपी करता है।

पीबीएम एक ऐसी तकनीक है जिसका प्रयोग डीएनए 1,2के प्रतिलेखन कारकों की बाध्यकारी प्राथमिकताओं को निर्धारित करने के लिए नियमित रूप से किया जाता है ; तथापि, यह डीएनए के लिए प्रोटीन के कमजोर/परिवर्तनीय बंधन का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं है। आठ आधार जोड़े से मिलकर सभी संभव दृश्यों के लिए औसत प्रोटीन बाध्यकारी विशिष्टता के बारे में जानकारी प्रदान करता है कि सार्वभौमिक पीबीएम के विपरीत, HTPP अद्वितीय अनुक्रम तत्वों को शामिल एकल फैला डीएनए टेम्पलेट्स के पुस्तकालय पर आधारित है। इस तरह के डीएनए अनुक्रम तत्वों जीनोम में मौजूद कुछ डीएनए दोहराव अनुक्रम तत्वों में समृद्ध कुछ डीएनए दोहराव अनुक्रम तत्वों में समृद्ध हजारों कम (बीपी के कुछ दसियों) जीनोम दृश्यों, साथ ही साथ computationally डिजाइन डीएनए दृश्यों के दसियों शामिल है, जो विभिन्न औसत जीसी सामग्री के अधिकारी . इस तरह के एक उच्च throughput दृष्टिकोण के निर्धारण की अनुमति देता है, एक व्यवस्थित, मात्रात्मक, और परिकल्पना संचालित तरीके से, अनुक्रम से संबंधित गुण है कि प्राइमे बंधन और इसकी एंजाइमी गतिविधि3के लिए महत्वपूर्ण हैं. विशेष रूप से, प्राइमेज़-डीएनए बाइंडिंग प्राथमिकताओं के बीच महत्वपूर्ण लिंक, (विशिष्ट त्रि-न्यूक्लिओटाइड बाइंडिंग साइटों के बगल में डीएनए दृश्यों द्वारा संशोधित) और इस एंजाइमी प्रणाली4के लिए प्राइमेज़ प्रोसेक्टिविटी की पहचान की गई है।

नई प्रौद्योगिकी टी7 डीएनए प्राइमासे के लिए भी प्राइमेसी मान्यता स्थलों के बारे में हमारी समझ पर फिर से विचार करने के लिए लागू की गई थी , जिसका व्यापक अध्ययन किया गया है5. विशेष रूप से, शास्त्रीय अवधारणाओं की फिर से जांच, जैसे T7 डीएनए प्राइमाज़ के डीएनए मान्यता साइटों (जो लगभग चार दशक पहले निर्धारित किया गया था 6) प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी microarray (PBM) का उपयोग कर से संबंधित सुविधाओं में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया गया है इन मान्यता स्थलों के flanking अनुक्रम3. यह उम्मीद की गई थी कि टी 7 डीएनए प्राइमेज़ (5'-जीटीसी-3') की त्रि-न्यूक्लिओटाइड मान्यता साइट के बगल में अनुक्रम यादृच्छिक होंगे। इसके बजाय, हमने पाया कि टीजी समृद्ध flanking दृश्यों T7 डीएनए primese की संभावना को बढ़ाने के लिए अब आरएनए प्राइमर संश्लेषित processivity में वृद्धि का संकेत.

अन्य तरीकों कि इन विट्रो में प्रोटीन के डीएनए बाध्यकारी गुणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA)7, DNase मैं पदचिह्न8, सतह-प्लासम अनुनाद (एसपीआर)9, और दक्षिण पश्चिमी blotting शामिल 10.तथापि, ये कम-थ्रूपुट विधियां हैं जो केवल डीएनए अनुक्रमों की एक छोटी संख्या की जांच करने के लिए लागू होती हैं. इसके अलावा, इन तकनीकों में से कुछ की सटीक और संवेदनशीलता (उदा., EMSA) कम है. दूसरी ओर, इन विट्रो चयन11 एक तकनीक है कि, इसी तरह पीबीएम के लिए, कई बाध्यकारी दृश्यों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, कम आत्मीयता दृश्यों आमतौर पर इन विट्रो चयन के अधिकांश अनुप्रयोगों में बाहर रखा गया है; इसलिए, यह उपागम सभी उपलब्ध अनुक्रमों के लिए तुलनात्मक बाइंडिंग डेटा प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। सार्वभौमिक पीबीएम1,2 का उपयोग मुख्य रूप से प्रोकैरियोट और यूकैरियोट से प्रतिलेखन कारकों की बाध्यकारी विशिष्टताओं के साथ-साथ विशिष्ट कारकों (जैसे, कुछ लिगन्ड्स की उपस्थिति, सहकारक, आदि) की विशेषता के लिए किया जाता है जो हो सकता है इस बातचीत को प्रभावित12|

HTPP बाध्यकारी अनुक्रम संदर्भ पर जानकारी प्रदान करने के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ अभूतपूर्व उच्च throughput सांख्यिकीय शक्ति के संयोजन के द्वारा डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के लिए पीबीएम आवेदन का विस्तार। अन्य उपलब्ध तकनीकों की उपर्युक्त तकनीकी सीमाओं के कारण ऐसे आंकड़े अभी तक प्राइमेसिस और संबंधित एंजाइमों (जो डीएनए के लिए कमजोर/परिवर्तनीय बाध्यकारी हैं) के लिए प्राप्त नहीं किए गए हैं।

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Protocol

1. माइक्रोरेरे का डिजाइन

नोट: डीएनए जांच कस्टम 36-न्यूक्लिओटाइड दृश्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें दो चर flanking क्षेत्रों के बीच स्थित T7 डीएनए प्राइमेज़ (जीटीसी) के लिए मान्यता साइट से मिलकर, एक निरंतर 24-न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम के बाद एक गिलास स्लाइड3करने के लिए tethered . हम एक 4 x 180,000 microarray प्रारूप है, जो छह प्रतिकृति में प्रत्येक डीएनए अनुक्रम के खोलना सक्षम इस्तेमाल किया, बेतरतीब ढंग से स्लाइड पर वितरित.

  1. ज्ञात मान्यता दृश्यों के साथ प्राइमेस के लिए डीएनए पुस्तकालय का डिजाइन
    1. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अनुक्रम 60 न्यूक्लिओटाइड से बना है। पहले 24 न्यूक्लिओटाइड स्थिर रखें (काँच की स्लाइड से जुड़ा होना)। चर क्षेत्रों में निम्नलिखित सामान्य रूप होना चाहिए: (N)16जीटीसी (एन)17; जहाँ छ किसी भी वांछित न्यूक्लिओटाइड का प्रतिनिधित्व करता है।
    2. किसी विशिष्ट वैज्ञानिक प्रश्न को संबोधित करने के लिए flanking क्षेत्र डिज़ाइन करें (डिजाइन का एक उदाहरण निम्न पाठ में प्रस्तुत किया गया है). पार्श्व क्षेत्रों को दोहराने वाले तत्वों या विशिष्ट सममिति जैसी विशिष्ट विशेषताओं को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है।
      नोट: हम दो या तीन विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड से बना अलग flanking दृश्यों की आठ श्रेणियों बनाया है: टी और जी (समूह 1); टी और सी (समूह 2); सी और ए (समूह 3); ए और जी (समूह 4); जी, सी और टी (समूह 5); सी, टी और ए (समूह 6); जी, ए और टी (समूह 7); जी, ए और सी (समूह 8)। 2,000 विभिन्न दृश्यों प्रत्येक समूह के लिए डिजाइन किए गए थे. प्रत्येक समूह विभिन्न प्रकार और अनुक्रम दोहराता के विभिन्न संख्या के साथ दृश्यों के उपसमूहों था.
    3. नकारात्मक नियंत्रण दृश्यों का एक सेट शामिल करें (विशिष्ट बाइंडिंग साइट की कमी)4. ऐसे दृश्यों की उपस्थिति प्रयोग में विशिष्ट बाइंडिंग की घटना को मान्य करने की अनुमति देता है.
  2. अज्ञात मान्यता दृश्यों के साथ प्राइमेस के लिए डीएनए पुस्तकालय का डिजाइन
    1. यदि मान्यता अनुक्रम अज्ञात है, तो वांछित जीव (बैक्टीरिया, कवक, आदि) के जीनोम से अनुक्रम (पहले उल्लिखित विशिष्ट सुविधाओं के साथ या बिना) का चयन करके डीएनए लाइब्रेरी बनाएं।
  3. माइक्रोरे स्लाइड का डिजाइन
    1. एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से कस्टम स्लाइड (उदाहरण के लिए, 4x180K, AMADID #78366) खरीद (अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिकादेखें).। छह प्रतिकृति में प्रत्येक अनुक्रम आदेश, जहां प्रत्येक प्रतिकृति स्लाइड पर एक बेतरतीब ढंग से चयनित स्थान से जुड़ा होना चाहिए.

2. प्राइमास डीएनए बाइंडिंग प्रयोग

नोट: पहले दिन (या कम से कम 2 एच पहले) PBM, अवरुद्ध समाधान तैयार [2% w/v स्किम दूध फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस)] में और यह एक चुंबकीय उत्तेजक पर हलचल. उपयोग करने से पहले, समाधान को 0.45 $M फ़िल्टर से फ़िल्टर करें. डीएनए किस्में करने के लिए बाध्यकारी प्राइमाज़ का पता लगाने के लिए, कई चरणों में निम्नलिखित क्रम में किया जाना चाहिए।

  1. प्रक्रिया को अवरोधित करना
    1. पीबीएस में 0.01% v/v Triton X-100 के साथ एक Coplin जार में microarray स्लाइड पूर्व गीला (5 मिनट 125 आरपीएम पर एक प्रयोगशाला रोटेटर पर).
    2. गैसकेट स्लाइड (जिसे कवरस्लिप के रूप में भी संदर्भित किया जाता है) को पानी और इथेनॉल के साथ और संपीड़ित हवा का उपयोग करके सूखा धोएं।
    3. गैसकेट स्लाइड का सामना करना पड़ (वाणिज्यिक लेबल का सामना करना पड़) के साथ इस्पात संकरीकरण कक्ष (पीबीएम चैम्बर) के नीचे भाग इकट्ठा। सभा के बारे में अधिक जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें।
    4. पीबीएस में पिपीट ब्लॉकिंग समाधान (2% w/v स्किम दूध) प्रत्येक कक्ष में।
    5. Coplin जार से microarray स्लाइड निकालें, तो गैर डीएनए पक्ष सूखी (डीएनए कंपनी लेबल के रूप में एक ही पक्ष पर होना चाहिए) और किनारों एक ठीक पोंछ े का उपयोग कर. धीरे धीरे गैसकेट स्लाइड पर microarray जगह है, बुलबुले से बचने (कंपनी लेबल नीचे का सामना करना पड़). तुरंत इकट्ठा और इस्पात संकरीकरण कक्ष तंत्र कस. कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
    6. ताजा पीबीएस के 800 एमएल के साथ एक धुंधला पकवान ( "पीबीएस" पकवान) भरें। पीबीएस में ताजा तैयार 0.5% v/v ट्वीन-20 के 800 एमएल के साथ एक दूसरा धुंधला पकवान ("वॉश" डिश) भरें।
    7. पीबीएम कक्ष को खोलना और माइक्रोरे स्लाइड-कवरस्लिप "सैंडविच" को हटा दें, ध्यान रखना सील को तोड़ने के लिए नहीं। स्लाइड और कवरस्लिप के बीच संदंश रखकर इसे वॉश डिश में पानी के नीचे अलग करें।
    8. microarray स्लाइड पानी के नीचे हिला और जल्दी से एक Coplin जार करने के लिए स्थानांतरण.
    9. पीबीएस में 0.1% v/v ट्वीन-20 के साथ एक बार धोलें (5 मिनट 125 आरपीएम पर एक प्रयोगशाला रोटेटर पर)।
    10. पीबीएस में 0.01% v/v Triton X-100 के साथ एक बार धो लें (2 मिनट 125 आरपीएम पर एक प्रयोगशाला रोटेटर पर).
    11. जल्दी से पीबीएस युक्त एक Coplin जार करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण।
  2. प्रोटीन बाइंडिंग
    1. पीबीएम कक्ष को पहले वर्णित के रूप में इकट्ठा करें (चरण 2.1.2-2.1.3)।
    2. पिपेट प्रोटीन बंधन मिश्रण जिसमें 5 डिग्री सेल्सियस टी 7 डीएनए प्राइमेज़ होता है, 30 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 7.5, 6.5 एम एम एम के-ग्लूटामेट, 6 एमएम डाइथियोथ्रेटोल (डीटी), 65 डिग्री सेल्सियस राइबोन्यूसाइड ट्राइफॉस्फेट (आरएनटीपी), 2% डब्ल्यू/ सामन testes डीएनए, और 0.02% v/v Triton X-100 (TX-100) गैसकेट स्लाइड के प्रत्येक कक्ष में (रबड़ पक्षों को छूने के बिना और बुलबुले शुरू करने के बिना).
    3. इसे पीबीएस डिश में डुबोकर माइक्रोरे स्लाइड को संक्षेप में कुल्ला करें, जो स्लाइड की सतह से अतिरिक्त डिटर्जेंट को हटा देता है। स्लाइड के गैर-डीएनए सतहों को एक महीन पोंछे के साथ साफ करें।
    4. धीरे धीरे gasket स्लाइड पर microarray स्लाइड (नीचे का सामना करना पड़ रहा है) कम, एक कक्ष से दूसरे करने के लिए रिसाव को रोकने के लिए सावधान किया जा रहा है. तुरंत इकट्ठा और बुलबुले शुरू करने के बिना पीबीएम कक्ष तंत्र कस। बुलबुले फार्म करते हैं, वे धीरे एक कठिन सतह के खिलाफ इस्पात कक्ष दोहन से हटाया जा सकता है।
    5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लगाव
    1. पीबीएम कक्ष को खोलना और माइक्रोरे स्लाइड-कवरस्लिप "सैंडविच" को हटा दें, ध्यान रखना सील को तोड़ने के लिए नहीं। संदंश पकवान में पानी के नीचे से अलग करना संदंश का उपयोग करना। स्लाइड पानी के नीचे हिला और जल्दी से पीबीएस युक्त एक Coplin जार करने के लिए स्थानांतरण।
    2. पहले वर्णित के रूप में गैसकेट स्लाइड के साथ पीबीएम कक्ष इकट्ठा (चरण 2.1.2-2.1.3).।
    3. एलेक्सा 488-कंजुटेड एंटी-हिस एंटीबॉडी (10 एनजी/
    4. पहले की तरह पीबीएस डिश में डुबोकर स्लाइड को संक्षेप में कुल्ला करें, फिर धीरे-धीरे पीबीएस से स्लाइड को हटा दें, गैर-डीएनए सतह को पोंछें और इसे गैसकेट स्लाइड पर नीचे रखें।
    5. प्रकाश-ब्लीचिंग को कम करने के लिए अंधेरे में आरटी में 30 मिनट इनक्यूबेट (फ्लोरेसेंस जांच प्रकाश-संवेदी है)।
    6. पीबीएम कक्ष और कवरस्लिप को पहले की तरह अलग करें, वॉश डिश में कवरस्लिप पानी के नीचे को हटा दें।
    7. पीबीएस डिश में डुबकी द्वारा स्लाइड को संक्षेप में कुल्ला करें। संकुचित हवा के साथ स्लाइड सूखी. स्कैन करने के लिए तैयार जब तक एक स्लाइड बॉक्स में अंधेरे में स्टोर.
  4. माइक्रोरे स्लाइड स्कैन कर रहा है
    1. 495 एनएम की उत्तेजना और 519 एनएम के उत्सर्जन के साथ माइक्रोरेरे स्कैनर (सामग्री तालिकाको संदर्भित करें) का उपयोग करके चिप को स्कैन करें और मध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता एकत्र करें।

3. माइक्रोरेरे डेटा विश्लेषण

नोट: सभी डेटा संसाधन MATLAB में कस्टम लिखित स्क्रिप्ट का उपयोग कर किया गया था।

  1. पहलेवर्णित 4 के रूप में Wilcoxon रैंक योग परीक्षण p-मान का उपयोग प्रारंभिक PBM डेटा प्रसंस्करण प्रदर्शन करते हैं।
  2. आगे के विश्लेषण के लिए प्रत्येक डीएनए अनुक्रम के लिए बाइंडिंग तीव्रता के औसत मान का उपयोग करें।
  3. इसके बाद, एक तरह से ANOVA p-मानका उपयोग करते हुए, डीएनए जांच के विभिन्न समूहों के लिए प्राप्त प्राइमे-डीएनए बाइंडिंग तीव्रता में देखे गए अंतरों के सांख्यिकीय महत्व की तुलना करें, जैसा कि डीएनए पुस्तकालय डिजाइन अनुभाग3में ऊपर बताया गया है।

4. टेम्पलेट निर्देशित आरएनए संश्लेषण T7 डीएनए प्राइमाज़ द्वारा उत्प्रेरित

  1. पॉलीऐक्रिलमाइड जेल को नांदेश करने की तैयारी
    1. जेल मिश्रण के 100 एमएल तैयार करने के लिए, संयोजन 62.5 एमएल 40% ऐक्रिलमाइड-बिसाक्रिलमाइड (19:1), यूरिया के 42 ग्राम, ट्राइस बेस के 1.1 ग्राम (2-एमिनो-2-(हाइड्रॉक्सीमेथिल)-1,3-प्रोपेन्डियोल), 0.55 ग्राम बोरिक एसिड, और 0.4 एमएल का एथिलीन एडिटेटा एडिथेलिसेटिक एडिथेलिसेटिक एडिथेलिप्टिक एथिएन।
    2. मिश्रण को 14 एमएल एलिकोट्स में विभाजित करें (16.5 सेमी x 26 सेमी x 0.03 सेमी के एक जेल के लिए आवश्यक राशि) और उन्हें 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    3. एक denaturing polyacrylamide जेल तैयार करने के लिए, TEMED के 4 $L और 10% w/v अमोनियम persulfate के 40 $L पहले से तैयार मिश्रण के 14 एमएल करने के लिए जोड़ें, यह डाली, और इसे छोड़ कम से कम 2 एच के लिए आरटी पर बहुलक. जेल 4 डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के लिए रखा जा सकता है।
  2. नमूना तैयारी
    नोट: बर्फ पर अभिकर्मकों, प्रतिक्रिया मिश्रण, और नमूने रखें।
    1. दस अभिक्रियाओं के लिए आवश्यक अभिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए 11 डिग्री सेल्सियस 5x क्रियाकलाप बफर (200 एमएम ट्रास-एचसीएल, पीएच - 7.5; 50 एमएम डाइथियोथ्रिटॉल, 250 एमएम पोटेशियम ग्लूटामेट, 50 एमएमसीएल एमजी2), न्यूक्लियट के 5.5 लाख मिश्रण का 5.5 डिग्री सेल्सियस मिश्रण न्यूक्लियोटाइड ट्राइ-फॉस्फेट (एनटीपी), 5. रेडियो लेबलित राइबोन्यूक्लिओटाइड [उदा., एटीपी, ([-32P) 3000 Ci/
      नोट: सभी मात्रा संभव pipeting त्रुटियों के कारण 10% की वृद्धि हुई है. रेडियोलेबल राइबोन्यूक्लिओटाइड रेडियोधर्मी संकेत की ताकत के अनुसार पतला किया जाना चाहिए (प्रारंभिक कमजोर पड़ने आमतौर पर 1:10 या अधिक है)।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण के 2 डिग्री एल को दस पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    3. इसी पीसीआर ट्यूब के लिए 100 डिग्री एम डीएनए टेम्पलेट के 1 $L जोड़ें और नीचे स्पिन।
    4. 16 डिग्री सेल्सियस टी 7 डीएनए प्राइमाज़ के 2 डिग्री एल जोड़ें, नीचे स्पिन, धीरे मिश्रण, और फिर से नीचे स्पिन।
    5. 20 मिनट के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया इनक्यूबेट करें।
    6. शमन समाधान (95% formamide, 20 m EDTA, 0.05% w/v xylene cyanol और ब्रोमोफेनोल नीले) के 5 डिग्री एल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो, और नीचे स्पिन.
  3. डीनेटिंग पॉलीऐक्रिलमाइड जेल और बाद में संकेत का पता लगाने के माध्यम से इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा आरएनए उत्पादों का पृथक्करण
    1. 1x TBE बफर (90 एमएम Tris-बोरेट, 2 एमएम EDTA) में 1 h (10 mA, 600 V) के लिए जेल पूर्व चलाने के लिए।
    2. प्रत्येक नमूने के 2 डिग्री एल तक लोड और इलेक्ट्रोफोरोसिस (20 mA, 1100 V) 1x TBE बफर (90 एमएम Tris-बोरेट, 2 एमएम EDTA) में प्रदर्शन करते हैं।
    3. एक निर्वात के तहत 80 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए जेल सूखी.
    4. रेडियोधर्मी संकेत की ताकत पर निर्भर करता है, रात को रात में कुछ घंटों के लिए रेडियोधर्मी जेल के लिए फॉस्फोर इमेजिंग प्लेट का पर्दाफाश.
    5. फॉस्फोरइमेजर का उपयोग करके संकेत (फोटोएरेक्टेड संदीप्ति) को रिकॉर्ड करें (सामग्री की तालिकादेखें)।

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Representative Results

प्राइमाज़ बाइंडिंग साइटों मानचित्रण के लिए इस तकनीकी अग्रिम डीएनए बाध्यकारी गुण है कि मुश्किल कर रहे हैं प्राप्त करने की अनुमति देता है, अगर असंभव नहीं, शास्त्रीय उपकरणों का उपयोग कर निरीक्षण करने के लिए. इससे भी महत्वपूर्ण बात, HTPP प्राइमस बाध्यकारी साइटों की पारंपरिक समझ की समीक्षा करने में सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, HTPP ज्ञात 5'-GTC-3' मान्यता दृश्यों के अलावा बाध्यकारी विशिष्टताओं का पता चलता है, जो T7 डीएनए प्राइमेज़ के कार्यात्मक गतिविधियों में परिवर्तन की ओर जाता है. अर्थात्, अनुक्रमों के दो समूहों की पहचान की गई: मजबूत-बाध्यकारी डीएनए अनुक्रम जिनमें पार्श्वों में T/G शामिल थे और कमजोर-बाध्यकारी अनुक्रम जिनमें A/G को पार्श्वों में शामिल किया गया था (सशक्त-बाध्यकारी टेम्पलेट्स में सभी थाइमीनको एडेनिनद्वारा प्रतिस्थापित किए गए थे)। उनके अनुक्रम के भीतर 5'-GTC-3' याद कर रहे थे कि डीएनए टेम्पलेट्स के लिए कोई प्राइमेबाइ न बाइंडिंग का पता चला था।

प्रथम डीएनए मान्यता साइटों है कि इस तरह के टी / जी अमीर flanks के रूप में विशिष्ट सुविधाओं, शामिल, 10 गुना करने के लिए primase-डीएनए बाध्यकारी वृद्धि हुई है, और आश्चर्यजनक रूप से भी नवगठित आरएनए की लंबाई में वृद्धि (तीन गुना तक)(चित्र 2 पिछले प्रकाशन में 3)महत्वपूर्ण रूप से, HTPP हमें निरीक्षण और डीएनए टेम्पलेट के अनुक्रम के संबंध में प्राइमर लंबाई में परिवर्तनशीलता की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति दी.

Figure 1
चित्र 1: उच्च-थ्रूपुट प्राइमाज़ प्रोफाइलिंग (एचटीपीपी) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) स्लाइड को गतिविधि बफर (40 एमएम ट्रास-एचसीएल, पीएच 7.5; 10 एमएम एमजीसीएल2, 50 एमएम के-ग्लूटामेट, 10 एमएम डीटीटी, 100 डिग्री एम आरएनटीपी) में प्राइमे से इनक्यूबेट किया गया था। इसके बाद, एलेक्सा 488-संयोजित एंटी-हिस फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को प्रोटीन लेबल करने के लिए पेश किया गया था। हल्के धोने के कदम के बाद, स्लाइड microarray स्कैनर का उपयोग कर स्कैन किया गया था. बंधन समानता औसत फ्लोरोसेंट संकेत के अनुसार निर्धारित किया गया था और डीएनए दृश्यों तदनुसार समूहों में विभाजित किया गया. (बी)माइक्रोरे रेग से प्राप्त डीएनए-बाध्यकारी परिणामों को सहसंबंधित करने के लिए जैव रासायनिक परख की गई थी, जिसमें टी 7 डी एन ए प्राइमासे के कार्यात्मक गुणों के साथ थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: डी एन ए टेम्पलेट्स के दो समूहों पर T7 डीएनए प्राइमाज़ की उत्प्रेरक गतिविधि की तुलना (पक्षों में टी/जी के साथ मजबूत बंधन और पीबीएम से प्राप्त ए/जी के साथ कमजोर बंधन)। (ए) आरएनए प्राइमर गठन टी 7 डीएनए प्राइमेसे द्वारा उत्प्रेरित। प्रतिक्रियाओं में मानक प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रथम ाीलांकिषरीय मान्यता अनुक्रम (क्रमांकित लेन), 32पी-जेड-एटीपी, एटीपी, सीटीपी, यूटीपी और जीटीपी शामिल थे। डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स (अंधेरे नीले) के एक समूह में पार्श्वों में टी/जी निहित था, जबकि सभी थाइमाइन को दूसरे समूह (हल्के नीले) में एडेनिन से बदल दिया गया था। ऊष्मायन के बाद, रेडियोधर्मी आरएनए उत्पादों को इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा 25% पॉलीऐक्रिलमाइड जेल के माध्यम से अलग किया गया था जिसमें 7एम यूरिया होता है और ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा कल्पना की जाती है। () सापेक्ष लंबाई (प्रत्येक आरएनए प्राइमर का गठन करने वाले राइबोन्यूक्लिओटाइडकीकी की संख्या अज्ञात है) और डीएनए टेम्पलेट्स (पैनल ए) के दो समूहों पर टी 7 डीएनए प्राइमेद्वारा संश्लेषित आरएनए प्राइमर की मात्रा। भूखंडों से पता चलता है कि अब आरएनए प्राइमर डीएनए टेम्पलेट्स पर संश्लेषित (बढ़ी हुई processivity) हैं जो उच्च आत्मीयता के साथ बांधता है (जिसमें टी/जी flanks में होते हैं) उन टेम्पलेट्स की तुलना में जो कम समानता से बंधे होते हैं (जो flanks में A/G होते हैं)। (ग) डीएनए टेम्पलेट्स के दो समूहों पर संश्लेषित आरएनए प्राइमर की मात्रा का परिमाणीकरण। परिणाम डीएनए बाध्यकारी संबंध और T7 डीएनए प्राइमाज़ द्वारा संश्लेषित आरएनए की राशि के बीच एक संबंध प्रदर्शित करता है. AU (मध्यस्थ इकाई) रेडियोधर्मी संकेत की तीव्रता का माप है जो सीधे संश्लेषित आरएनए प्राइमर की मात्रा के साथ संबंधित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पीबीएम विधि व्यापक रूप से प्रतिलेखन कारकों के बाध्यकारी गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और यह भी डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे डीएनए प्राइमेज़, कि कम आत्मीयता के साथ डीएनए के लिए बाध्य. तथापि, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के कुछ संशोधनों की आवश्यकता है। microarray प्रयोग कई कदम शामिल है: डीएनए पुस्तकालय के डिजाइन, चिप की तैयारी, प्रोटीन लक्ष्य की बाइंडिंग, फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और स्कैनिंग. हल्के धोने के कदम महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि डिटर्जेंट युक्त समाधान ों के साथ लंबे washes बंधन के कमजोर / क्षणिक मोड के कारण डीएनए टेम्पलेट से प्रोटीन के वियोजन का कारण बनता है। अन्य महत्वपूर्ण कदम बाध्यकारी शर्तों (जैसे, बफर संरचना, cofactors) और ऊष्मायन समय है कि प्रत्येक विशिष्ट एंजाइम के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता शामिल हैं.

microarray से प्राप्त परिणामों को जैव रासायनिक परख में मान्य किया जाना चाहिए. जैव रासायनिक परख भी डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों की दिलचस्प सुविधाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जैसे डीएनए बाध्यकारी संबंध और एंजाइमी गतिविधि / HTPP हमें T7 डीएनए प्राइमेज़ के कार्यात्मक गुणों पर डीएनए बाध्यकारी के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए सक्षम. उदाहरण के लिए, यह देखा गया है कि यदि प्राइमेस डीएनए टेम्पलेट के लिए उच्च बंधन संबंध प्रदर्शित करता है, तो यह लंबे समय तक आरएनए प्राइमर (बढ़ी हुई प्रक्रिया) के गठन को उत्प्रेरित करता है।

कुल मिलाकर, इस लेख में प्रस्तुत विधि तेजी से, विश्वसनीय है, और एक साथ एक परिकल्पना संचालित रास्ते में एक प्रयोग में विविध डीएनए दृश्यों के हजारों के दसियों पर बाध्यकारी गुणों का परीक्षण करने का अवसर प्रदान करता है. प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए अन्य प्रोटीन या धातु cofactors के अलावा एक तेजी से, उच्च throughput तरीके से प्राइमेस के डीएनए बाध्यकारी गुणों पर उनके प्रभाव की जांच करने की संभावना प्रदान करता है। दूसरी ओर, इस विधि के आवेदन microarray स्लाइड की अपेक्षाकृत उच्च कीमत और सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता है जब प्राइमेज़ गतिविधि परख के लिए रेडियोधर्मी सामग्री से निपटने के द्वारा सीमित है.

यह ध्यान दें कि विभिन्न प्राइमेट्स दोनों microarray बाध्यकारी शर्तों और गतिविधि परख के लिए बफर शर्तों के संशोधनों की आवश्यकता महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, माइकोबैक्टीरियम तपेदिक के प्राइमाज़ को अभिक्रिया बफर में डाइवेलेंट मैंगनीज के साथ मैग्नीशियम के प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है। अनुचित धातु cofactors या अनुचित प्रतिक्रिया बफ़र्स गरीब प्राइमाज़ गतिविधि या कम डीएनए बाध्यकारी संबंध के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्राइमेस कमजोर आत्मीयता के साथ डीएनए टेम्पलेट्स के लिए बाध्य; इसलिए, microarray बाध्यकारी प्रयोग के दौरान कोमल धोने कदम की आवश्यकता है. अन्यथा, वे microarray स्लाइड से बाहर धोया जाएगा, फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के अलावा पर फूलों का संकेत के नुकसान के लिए अग्रणी.

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, कई prokaryotic प्राइमेस के डीएनए बाध्यकारी गुण (trinucleotide डीएनए मान्यता अनुक्रम सहित) अभी भी खराब समझ रहे हैं, ज्यादातर वर्तमान में उपलब्ध तरीकों की तकनीकी सीमाओं के कारण. HTPP डीएनए मान्यता साइटों या अन्य टेम्पलेट से संबंधित कारकों की जांच की खोज के लिए एक तेज और कुशल मंच का प्रतिनिधित्व करता है (यानी, समग्र न्यूक्लिओटाइड संरचना, जीसी सामग्री, दोहराव डीएनए अनुक्रम तत्वों और उनके समरूपता की उपस्थिति) कि बाध्यकारी संबंध और ssDNA बाध्यकारी एंजाइमों की गतिविधि को प्रभावित. इसके अलावा, भविष्य अनुप्रयोगों डीएनए बाध्यकारी संबंध, मान्यता पैटर्न, या primases और अन्य डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के कार्यात्मक गतिविधि पर विभिन्न प्रोटीन या cofactors के प्रभाव की ओर निर्देशित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस शोध को इसराल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 1023/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

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References

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