Vibrio fischeri आइसोलेट्स के बीच प्रतियोगी बातचीत की मात्रा निर्धारित करने के लिए सिक्काकरण परख

Immunology and Infection

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Summary

बैक्टीरिया अंतरजीवाणु प्रतियोगिता में उलझाने के लिए विभिन्न तंत्र ोंकोश. यहाँ, हम जीवाणु अलग के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की विशेषता के लिए एक संस्कृति आधारित प्रोटोकॉल पेश करते हैं और कैसे वे एक मिश्रित आबादी के स्थानिक संरचना को प्रभावित करते हैं.

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Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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Abstract

इस पांडुलिपि का पता लगाने और दो जीवाणु आबादी के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की विशेषता के लिए एक संस्कृति आधारित, coincubation परख का वर्णन करता है. इस विधि स्थिर प्लाज्मिड है कि प्रत्येक आबादी अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध क्षमताओं और चयन और प्रत्येक जनसंख्या के दृश्य भेदभाव के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया जा करने की अनुमति कार्यरत हैं. यहाँ, हम प्रतिस्पर्धा Vibrio fischeri उपभेदों, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण की तैयारी और coincubation का वर्णन. इस दृष्टिकोण सरल है, पैदावार त्वरित परिणाम, और निर्धारित करने के लिए कि क्या एक जनसंख्या मारता है या एक और आबादी के विकास को रोकता है इस्तेमाल किया जा सकता है, और क्या प्रतियोगिता एक diffusible अणु के माध्यम से मध्यस्थता है या प्रत्यक्ष सेल सेल संपर्क की आवश्यकता है. क्योंकि प्रत्येक जीवाणु आबादी एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है, परख एक मिश्रित कॉलोनी के भीतर प्रतिस्पर्धा आबादी के स्थानिक भेदभाव की अनुमति देता है. हालांकि वर्णित तरीकों सहजीवी जीवाणु वी fischeri इस प्रजाति के लिए अनुकूलित शर्तों का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, प्रोटोकॉल सबसे कृषि योग्य जीवाणु अलग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

इस पांडुलिपि में यह निर्धारित करने के लिए एक संस्कृति-आधारित विधि की रूपरेखा दी गई है कि क्या दो जीवाणु अलग-अलग प्रतिस्पर्धी बातचीत करने में सक्षम हैं। मिश्रित आबादी का अध्ययन करते समय, यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि जीवाणु अलग-थलग किस सीमा तक बातचीत करते हैं, विशेष रूप से कि क्या अलग-अलग सीधे हस्तक्षेप तंत्र के माध्यम से प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं। व्यतिकरण प्रतियोगिता उन अन्योन्यक्रियाओं को संदर्भित करती है जहां एक जनसंख्या सीधे वृद्धि को रोकती है या प्रतिस्पर्धी जनसंख्या1को मारता है . इन बातचीत की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे एक माइक्रोबियल समुदाय की संरचना और समारोह2,3पर गहरा प्रभाव हो सकता है.

माइक्रोबियल प्रतियोगिता के लिए तंत्र व्यापक रूप से मेजबान संबद्ध और मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया4,5,6,7, सहित विभिन्न वातावरण से बैक्टीरिया के जीनोम में मोटे तौर पर खोज की गई है, 8,9. विभिन्न प्रकार की प्रतिस्पर्धा रणनीतियों का वर्णन किया गया है10,11 जिसमें अंतरगम्य तंत्र शामिल हैं, जैसे जीवाणुनाशक रसायन1,12 और स्रावित एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स13 , साथ ही संपर्क पर निर्भर तंत्र है कि सेल सेल संपर्क की आवश्यकता के लिए लक्ष्य कोशिकाओं9,14,15,16,17 में एक निरोधात्मक प्रभावक हस्तांतरण ,18.

हालांकि संस्कृति आधारित coincubations आमतौर पर सूक्ष्म जीव विज्ञान में उपयोग किया जाता है5,8,19, इस पांडुलिपि कैसे परख का उपयोग करने के लिए प्रतियोगिता के तंत्र की विशेषता है, साथ ही अनुकूलन के लिए सुझाव रूपरेखा अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए प्रोटोकॉल. इसके अलावा, इस विधि का विश्लेषण करने और डेटा पेश करने के लिए प्रतिस्पर्धी बातचीत की प्रकृति के बारे में विभिन्न सवालों के जवाब देने के लिए कई दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हालांकि यहाँ वर्णित तकनीक पहले से इस्तेमाल किया गया interbactrial हत्या तंत्र coisolated Vibrio fischeri बैक्टीरिया के सहजीवी उपभेदों के बीच intraspecific प्रतियोगिता अंतर्निहित की पहचान करने के लिए19, वे के लिए उपयुक्त हैं पर्यावरणीय अलग और मानव रोगजनकों सहित कई जीवाणु प्रजातियों, और दोनों संपर्क पर निर्भर और diffusible प्रतिस्पर्धी तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. प्रोटोकॉल में कदम अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. यह देखते हुए कि अधिक मॉडल प्रणालियों isogenic जीवों के उपयोग से परे अपने अध्ययन का विस्तार कर रहे हैं विभिन्न जीनोटाइप शामिल करने के लिए10,16,20,21, इस विधि एक मूल्यवान संसाधन होगा शोधकर्ताओं को समझने की मांग कैसे प्रतियोगिता बहु तनाव या बहु प्रजातियों प्रणालियों को प्रभावित करता है.

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Protocol

1. Coincubation के लिए तनाव तैयार करें

  1. एक उचित संदर्भ तनाव है कि coincubation परख के दौरान जीवाणु प्रतियोगिता के लिए लक्ष्य के रूप में काम करेंगे चुनें. संदर्भ तनाव का चयन करते समय सर्वोत्तम प्रक्रियाओं के लिए चर्चा देखें और संदर्भ तनाव परिणामों को कैसे प्रभावित करेगा. इस प्रोटोकॉल में, वी fischeri तनाव ES114 संदर्भ तनाव के रूप में काम करेगा.
  2. निर्धारित जो चयन और स्क्रीनिंग तरीकों coincubation में अलग के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा
    1. आमतौर पर, विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन (जैसे kanamycin या chloramphenicol) युक्त स्थिर प्लाज्मिड के साथ उपभेदों को बदलने के लिए प्रत्येक तनाव के लिए चयन करने के लिए, साथ ही जीन नेत्रहीन के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग (जैसे GFP या आरएफपी) सहकृषि में भेद तनाव प्रकार.
      नोट: स्थिर प्लाज्मिड का उपयोग करने की आवश्यकता है क्योंकि यदि कोई तनाव चयन के अभाव में प्लाज्मिड खो देता है, तो इस तनाव की संख्या को कम करके आंका जाएगा जब मात्रा निर्धारित की जाएगी, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नेत्रहीन पता लगाया जा सकता है।
    2. टैग coincubated वी fischeri उपभेदों अंतर इस तरह है कि एक तनाव प्लाज्मिड PVSV102 होता है, जो एक हरे रंगकी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और एंटीबायोटिक kanamycin के लिए प्रतिरोध व्यक्त करता है (कान आर), और दूसरा तनाव शामिल हैं प्लाज्मिड पीवीएसवी208 , जो एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (डीएसआरईडी) और एंटीबायोटिक क्लोरैम्फीनिकोल (सीएमआर)22के प्रति प्रतिरोध व्यक्त करता है.
      नोट: अन्य अंतर चयन coincubating उपभेदों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अतिरिक्त विधियों के लिए चर्चा देखें.
    3. चयन मजबूत है यह सुनिश्चित करने के लिए coincubation परख के प्रारंभिक अनुकूलन के दौरान निम्नलिखित नियंत्रण शामिल करें. प्रत्येक तनाव है कि अंतर एंटीबायोटिक है कि इसके खिलाफ का चयन करना चाहिए युक्त agar प्लेटों पर टैग किया जाता है प्लेट (यानी, प्लेट तनाव 1 मीडिया पर है कि तनाव 2 के लिए चुनता है, और इसके विपरीत).
  3. दो दिन पहले coincubation परख, लकीर संदर्भ तनाव pVSV102, संदर्भ तनाव pVSV208, और प्रत्येक प्रतियोगी तनाव pVSV208 से -80 डिग्री सेल्सियस स्टॉक एलबीएस agar प्लेटों पर उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त (जैसे, 100 g/ क्लोरैएम्फीकॉल) और 24 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। एंटीबायोटिक चयन सुनिश्चित करने के लिए सभी कोशिकाओं को प्रयोग की शुरुआत में प्लाज्मिड होते हैं आवश्यक है.
  4. परख से एक दिन पहले, लेने और तनाव प्रकार प्रति चार अलग-अलग कालोनियों restreak (जैविक प्रतिकृति) उचित एंटीबायोटिक के साथ ताजा एलबीएस आगर प्लेटों पर और 24 डिग्री सेल्सियस में रात भर incubated।
    नोट: इस चरण के लिए अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि ब्याज के जीव की वृद्धि दर के आधार पर पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए लंबे समय तक या कम ऊष्मायन समय की आवश्यकता हो सकती है।

2. सिक्काबैकाटे बैक्टीरियल तनाव

  1. ऊष्मायन के लिए प्रत्येक जीवाणु तनाव तैयारकरना ( चित्र1A)
    1. एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करना, आगर प्लेट से कोशिकाओं को स्क्रैप करें (चावल के एक अनाज के आकार के रूप में ज्यादा) और एलबीएस शोरबा के 1 एमएल युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल clumps को ट्यूब के पक्ष में दबाकर तोड़ और ऊपर और नीचे तेजी से पाइपिंग.
    2. 1-2 एस के लिए ट्यूब और भंवर कैप. यदि सेल clumps अभी भी दिखाई दे रहे हैं, भंवर या pipette ऊपर और नीचे करने के लिए जारी जब तक नमूना नेत्रहीन वर्दी है.
    3. सभी नमूनों के लिए चरणों 2.1.1-2.1.2 दोहराएँ.
  2. उपाय और सभी नमूनों के लिए 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व रिकॉर्ड। नमूने की संभावना एक सटीक ओडी माप प्राप्त करने के लिए एलबीएस शोरबा का उपयोग कर दस गुना तक पतला करने की आवश्यकता होगी। वांछित OD600के लिए प्रत्येक नमूना सामान्य . तनाव आम तौर पर एक OD600 $1.0 के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं, जो करनेके लिए अनुवाद $106 बैक्टीरिया /
    नोट: इस चरण के लिए विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि इनोकुलम सेल घनत्व प्रतिस्पर्धा के तंत्र के आधार पर coincubation परिणामों को प्रभावित करता है। ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए चर्चा देखें.
  3. सिक्काबबन्की उपभेदों (चित्र 1B, सी)
    1. प्रत्येक तनाव के 100 एमएल (ओडी 1.0 में सामान्य) को लेबल किए गए 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़कर 1:1 अनुपात (v/v) में संदर्भ विकृति और प्रतियोगी विकृति मिलाएं। एक नियंत्रण के रूप में, खुद के एक अंतर टैग संस्करण के साथ संदर्भ तनाव मिश्रण (संदर्भ तनाव pVSV102 + संदर्भ तनाव pVSV208). यह नियंत्रण बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक है कि क्या एक प्रतियोगी तनाव की उपस्थिति संदर्भ तनाव के विकास को प्रभावित करता है. 1-2 एस के लिए मिश्रित तनाव संस्कृति भंवर.
      नोट: इस चरण के लिए ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि प्रारंभिक अनुपात परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकता है और उन्हें समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए चर्चा देखें.
    2. प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए चरण 2.3.1 दोहराएँ. इस चरण को पूरा करने के बाद, आठ मिश्रित तनाव ट्यूबों की कुल होना चाहिए: अंतर-टैग किए गए संदर्भ उपभेदों (नियंत्रण) के साथ चार जैविक प्रतिकृतियां, और अंतर-टैग किए गए संदर्भ और प्रतिस्पर्धी उपभेदों के साथ चार जैविक प्रतिकृतियां () प्रयोगात्मक).
    3. एलबीएस agar युक्त पेट्री प्लेटों पर प्रत्येक नियंत्रण और प्रयोगात्मक मिश्रण के 10 एमएल स्पॉट; इन संस्कृति स्पॉट ऊष्मायन के बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    4. सभी तरल agar में अवशोषित कर लिया गया है जब तक बेंच पर पूरी तरह से सूखने के लिए स्पॉट की अनुमति दें और 24 डिग्री सेल्सियस के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री प्लेटों को इनक्यूबेट करें। V. fischeri उपभेदों pVSV102 और pVSV208 के साथ टैग के लिए एक न्यूनतम 15 एच की आवश्यकता है एक उच्च पर्याप्त सेल घनत्व के लिए विकसित करने के लिए GFP और आरएफपी कल्पना करने के लिए, क्रमशः, जनसंख्या स्तर पर एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर. यहाँ, हम इमेजिंग मिश्रित स्थानों के लिए एक 24 एच ऊष्मायन का उपयोग करें.
      नोट: यह प्लेटें कि बहुत नम या बहुत सूखी नहीं कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि प्लेटें बहुत नम हैं, तो सिक्का धब्बा आगर प्लेट में अवशोषित नहीं किया जाएगा; एक ही दिन पर डाला प्लेटों का उपयोग करने से बचें. यदि प्लेटें बहुत सूखी हैं, तो छोटी लहरें या दरारें आगर की सतह पर बन सकती हैं, जिससे सिक्का धब्बा अनियमित आकार में हो सकता है।
    5. चरण 2.3.3 के रूप में एक ही जीवाणु निलंबन का उपयोग करना, प्रत्येक नियंत्रण और प्रयोगात्मक मिश्रण के 10 एमएल को 24-वेल प्लेटों में रखें जिसमें प्रति अच्छी तरह एलबीएस एगार का 1 एमएल होता है। चरण 2.3.3 के रूप में, 24-वेल प्लेटों में आगर को उचित नमी सुनिश्चित करें। स्पॉट को पूरी तरह से सूखने दें और 5 डिग्री सेल्सियस के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इन संस्कृति स्थलों का उपयोग प्रयोग के अंत में प्रत्येक तनाव के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाएगा।
      नोट: व्यक्तिगत कुओं में विकास के लिए जीवाणु निलंबन स्पॉटिंग अंत समय बिंदु पर आसान resuspension के लिए अनुमति देता है. यह कदम 24 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करने के लिए एक अधिक किफायती दृष्टिकोण के रूप में वर्ग बाँझ फिल्टर टुकड़े का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है. स्क्वायर बाँझ फिल्टर टुकड़े एक agar प्लेट पर रखा जा सकता है और प्रत्येक प्रयोगात्मक मिश्रण के 10 एमएल इन फिल्टर पर देखा जा सकता है, बजाय 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर. coincubation समय के बाद, फिल्टर एक 1.5 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सकता है और coincubation स्थान भंवर या ऊपर और नीचे pipeting द्वारा resuspended किया जा सकता है. एक 5 ज ऊष्मायन समय वी fischeri अलग के बीच interbactrial हत्या का पता लगाने के लिए पर्याप्त है19, हालांकि, इस coincubation समय अन्य प्रजातियों या प्रतिस्पर्धी तंत्र के लिए कम या लंबे समय तक होने की आवश्यकता हो सकती है. अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें.
  4. इनोकुलम शुरू करने के लिए सीरियल तनुकरण
    1. शुरू coincubation मिश्रण के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली 90 "तो वहाँ आठ कॉलम और बारह पंक्तियाँ हैं बारी बारी से. प्रत्येक पंक्ति में पहले कॉलम में अविचलित मिश्रण का एक नमूना होगा जिसके बाद पंक्ति में शेष कुओं में सात दस गुना धारावाहिक कमजोर हो जाएंगे (चित्र 2क)।
    2. प्रत्येक पंक्ति को विकृति ID, प्रतिकृति संख्या, और समय (inoculum प्रारंभ कर रहा है ) के साथ लेबल करें. एलबीएस आगर प्लेटों को उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पूरक लेबल करें जिस पर कमजोर पड़ने की श्रृंखला को हाजिर किया जा सकता है। प्रत्येक एंटीबायोटिक प्लेट के लिए कौन से तनाव का चयन किया जा रहा है की पहचान करने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. एक multichannel pipette का उपयोग करना, प्रत्येक अच्छी तरह से एलबीएस शोरबा के 180 एमएल जोड़ने के लिए, undiluted coincubation मिश्रण के लिए पहले स्तंभ खाली छोड़ने.
      नोट: शोधकर्ताओं ने coincubation स्पॉट को फिर से निलंबित करने के लिए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैं और एक विशेष रूप से तेजी से बढ़ रही जीवाणु प्रजातियों के साथ काम कर रहे हैं या लगातार बड़े प्रयोगों जहां सीरियल कमजोर पड़ने ले जा सकते हैं प्रदर्शन सीरियल कमजोर पड़ने प्रदर्शन एक लंबे समय के लिए प्रदर्शन करने के लिए. इन उदाहरणों में पीबीएस का उपयोग धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन की प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया की महत्वपूर्ण वृद्धि को रोकने जाएगा. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि उनके आकार या अवधि पर ध्यान दिए बिना, सभी प्रयोगों में किस समाधान का उपयोग किया जाता है (उदा., PBS या LBS) के अनुरूप होना महत्वपूर्ण है.
    4. एक 200 एमएल एकल चैनल pipette का उपयोग करना, अच्छी तरह से पहले स्तंभ के लिए ट्यूब से coincubation मिश्रण के 100 एमएल हस्तांतरण. टिप छोड़ें और सभी coincubation मिश्रण के लिए दोहराएँ.
    5. एक multichannel pipette का उपयोग करना, कॉलम 1 से 2 में 2 लाख हस्तांतरण और ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिश्रण. युक्तियाँ छोड़ें और प्रत्येक स्तंभ के लिए दोहराएँ ताकि अंत तक, प्रत्येक पंक्ति में प्रारंभिक coincubation मिश्रण का दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने शामिल हैं।
      नोट: बार कमजोर पड़ने की संख्या के साथ संगत हो ऊपर और नीचे pipeted रहे हैं. उदाहरण के लिए, कमजोर पड़ने श्रृंखला भर में संगत होने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए पांच बार पाइपेट संभाल दबाना।
    6. आठ सुझावों के साथ लगे एक multichannel pipette का उपयोग करना, एक कमजोर पड़ने श्रृंखला में प्रत्येक अच्छी तरह से 5 एमएल aspirate (यानी, आठ कुओं की एक पंक्ति) और यह एलबीएस agar प्लेट है कि संदर्भ तनाव के लिए चयन करता है पर हाजिर (Kanamycin के साथ पूरक). प्रतिस्पर्धी विकृति के लिए चयन करने वाली प्लेट पर इस चरण को दोहराएँ (क्लोरैएम्फिनिकॉल के साथ पूरक) (चित्र2ख)। इनक्यूबेटर में रखने से पहले स्पॉट को पूरी तरह से सूखने दें।
      नोट: एक ही सुझाव संदर्भ और प्रतियोगी तनाव के लिए चयन प्लेटों पर एक प्रतिकृति कमजोर पड़ने श्रृंखला हाजिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रतिकृति के बीच बदला जाना चाहिए. एलबीएस आगर प्लेटों के लिए पिपेट टिप के अंत को छूने से बचें क्योंकि यह एक अवसाद बना सकता है जो प्लेट गणना के दौरान एक जीवाणु कॉलोनी और विषम परिणामों के समान हो सकता है। यदि टिप थाली को छूता है, तो एक नोट करें और कॉलोनी गिनती में अवसाद को शामिल न करें।
  5. टी अंतिम माप ले रहा है
    1. 24-वेल प्लेटों में coincubation स्पॉट के बाद 24 डिग्री सेल्सियस पर 5 एच के लिए incubated किया गया है, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एलबीएस शोरबा के 1 एमएल जोड़ने और सभी कोशिकाओं को पुन: निलंबित कर रहे हैं जब तक ऊपर और नीचे pipeting द्वारा coincubation स्पॉट resuspend। शक्ति जिसमें कोशिकाओं सभी प्रतिकृतियां भर में resuspended रहे हैं के साथ संगत हो. उदाहरण के लिए, पूरी तरह से प्रत्येक नमूने को पुन: निलंबित करने के लिए pipette संभाल आठ बार दबाना।
    2. एक बार प्रत्येक coincubation स्थान resuspended है, एक सीरियल कमजोर पड़ने के लिए एक 96 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करने और एलबीएस agar प्लेटें उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ जिस पर कदम 2.4.1 के रूप में एक ही रास्ते में कमजोर पड़ने हाजिर करने के लिए.
    3. टी अंतिम माप के लिए सीरियल कमजोर पड़ने को पूरा करने के लिए 2.4.2-2.4.6 चरणों का प्रदर्शन.
      नोट: एक महत्वपूर्ण नियंत्रण coincubation परख के प्रारंभिक अनुकूलन के दौरान शामिल किया जाना चाहिए. coincubation अवधि के अंत में, मीडिया है कि दोनों एंटीबायोटिक दवाओं भी शामिल है पर मिश्रित उपभेदों प्लेट. न तो तनाव विकसित करने में सक्षम होना चाहिए जब तक 1) एक सहज उत्परिवर्तन होता है, या 2) चयन मार्करों उपभेदों के बीच आदान-प्रदान कर रहे हैं.

3. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके Coincubations दृश्य

  1. कदम 2.3.3 और 2.3.4 से एलबीएस आगर पेट्री प्लेट्स पर प्रत्येक coincubation स्थान हरे और लाल फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए सुसज्जित एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, जो स्थिर प्लाज्मिड पर व्यक्त किया जा रहा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ मेल खाते हैं।
  2. नियंत्रण coincubation स्थान की छवियों को लेने के द्वारा शुरू (संदर्भ तनाव pVSV102 + संदर्भ तनाव pVSV208).
    1. आवर्धन समायोजित करें तो जगह ध्यान में है.
    2. GFP का निरीक्षण करने के लिए उपयुक्त उत्तेजना प्रकाश और फिल्टर का उपयोग करना, जोखिम समय समायोजित करें ताकि केवल coincubation स्थान से फ्लोरोसेंट का पता लगाने योग्य है और मीडिया से किसी भी पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट कम है या दिखाई नहीं है।
    3. उत्तेजना प्रकाश बदलें और आरएफपी का पालन करने के लिए फिल्टर, जोखिम समय का समायोजन करने के लिए माध्यम से पृष्ठभूमि को कम.
  3. प्रयोगात्मक उपचार से प्रत्येक coincubation स्थान के लिए, GFP फिल्टर और जोखिम चरण 3.2.2 में निर्धारित समय का उपयोग कर संदर्भ तनाव के लिए छवि.
  4. आरएफपी फिल्टर का उपयोग करके प्रतिस्पर्धी तनाव को छवि करें, जोखिम समय का समायोजन करें ताकि फ्लोरोसेंट केवल सिक्का स्थान और माध्यम से पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट से मनाया जाता है। दोनों छवियों को बचाने और दोनों तनाव आईडी, प्रतिकृति संख्या, ऊष्मायन समय जब छवि लिया गया था (उदा., 24 ज) शामिल करने के लिए उन्हें नाम। सभी प्रतिकृतिके के लिए दोहराएँ.
    नोट: Coincubation समय विभिन्न प्लाज्मिड या जीवाणु प्रजातियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए चर्चा देखें.

4. डेटा विश्लेषण

  1. प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक नियंत्रण और प्रयोगात्मक उपचार के लिए CFUs की गणना (टी शुरू और टी अंतिम)
    1. एक बार जब कालोनियों धारावाहिक कमजोर पड़ने प्लेटों पर दिखाई दे रहे हैं (उदाहरण के लिए, 24 एच पर 24 डिग्री सेल्सियस वी fischeriके लिए), कमजोर पड़ने कारक जहां व्यक्तिगत कालोनियों गिना जा सकता है और बड़े, बहु उपनिवेश ीसमूहों में एक साथ नहीं हो गया है की पहचान (चित्र 2B) . प्रत्येक दोहराने के लिए, गिनती और एक दिया कमजोर पड़ने के लिए अलग-अलग कालोनियों की संख्या रिकॉर्ड। यह संख्या उस प्रतिकृति के लिए CFUs का प्रतिनिधित्व करता है।
    2. नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग कर coincubation में प्रत्येक तनाव के लिए कुल CFUs के लिए कमजोर पड़ने के लिए CFUs कन्वर्ट:
      [ CFUs ] (डिल्यूशन फैक्टर x vol. कमजोर पड़ने के स्थान के)] x vol. undiluted नमूना के ] कुल CFUs
      उदाहरण: T0: [(6 CFUs) [ (10]-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] ] 1.2E7 कुल CFUs तनाव 1 के मिश्रित स्थान में प्रयोग की शुरुआत में
      T5: [(4 CFUs) [ (10]-3 x 0.005 एमएल) ] x [1.0 mL] ] 8.0E5 कुल CFUs तनाव 1 के बाद मिश्रित स्थान में 5 h coincubation
      प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक तनाव के लिए CFU मूल्यों कच्चे डेटा है कि कई अलग अलग विश्लेषण और सांख्यिकीय परीक्षणों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (अनुभाग 4.2 नीचे देखें).
  2. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्रतिस्पर्धी दबाव द्वारा संदर्भ तनाव को कम करता है, निम्न डेटा रूपांतरणों को निष्पादित करें: (i) यह निर्धारित करना कि क्या स्पर्धक तनाव की उपस्थिति में संदर्भ तनाव का अनुपात कम हो जाता है, या (ii) की गणना लॉग संबंधित प्रतिस्पर्धी सूचकांक (RCI). ये विश्लेषण कच्चे डेटा को अनुपात में परिवर्तित करते हैं और एक बातचीत के प्रतिस्पर्धी परिणाम का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं, लेकिन प्रतिस्पर्धा के तंत्र (यानी, हत्या बनाम विकास निषेध) का निर्धारण नहीं कर सकते।
    1. coincubation के दौरान प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रत्येक तनाव के अनुपात की गणना
      1. एक उपचार में प्रत्येक तनाव के अनुपात में CFU डेटा कन्वर्ट. T0 में संदर्भ तनाव (RS) के लिए, संदर्भ तनाव और T0 पर प्रतियोगी (सीएस) के लिए कुल CFUs के योग द्वारा T0 पर संदर्भ तनाव के लिए कुल CFUs विभाजित करें:
        RST0 CFUs - (आरएसT0 CFUs + सीएसT0 CFUs) - टी 0 पर संदर्भ तनाव का अनुपात।
        T0 पर प्रतियोगी तनाव के अनुपात का निर्धारण करने के लिए एक ही गणना प्रदर्शन:
        सीएसटी0 सी0 सी0 सी0यू0सी0 ( आर0टी0 सी0 सी0 सी0सी0यू0) - टी0 पर संदर्भ तनाव का अनुपात
        प्रत्येक समय बिंदु के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ और दोनों प्रयोगात्मक उपचार और नियंत्रण उपचार (अलग-अलग टैग संदर्भ तनाव coincubation) के लिए दोहराने।
      2. खड़ी छड़ ग्राफ में T0 और T5 पर प्रत्येक विकृति प्रकार के औसत अनुपात को ग्राफ़ करें (चित्र 3क)।
      3. सुनिश्चित करें कि उपभेदों का वांछित प्रारंभिक अनुपात प्राप्त किया गया था। coincubations के लिए जहां उपभेदों शुरू में मिश्रित किया गया 1:1, प्रत्येक तनाव प्रकार T0 पर जनसंख्या के $0.5 शामिल होना चाहिए और सांख्यिकीय एक छात्र के टी परीक्षण का उपयोग कर एक दूसरे से अलग नहीं होना चाहिए(पी gt; 0.05). यदि एक विकृति का अनुपात T0 में अन्य तनाव की तुलना में काफी बड़ा है, तो प्रयोग को दोहराएँ जब तक कि 1:1 प्रारंभिक अनुपात प्राप्त नहीं हो जाता.
      4. निर्धारित करें कि प्रतिस्पर्धी तनाव में 5 ज के बाद जनसंख्या का काफी बड़ा अनुपात शामिल है, एक छात्र के t-परीक्षण करें जो T0 और T5 पर प्रयोगात्मक उपचार में प्रत्येक तनाव के अनुपात की तुलना करता है। यदि प्रतिस्पर्धी विकृति का अनुपात टी 5 (पी एंडएलटी; 0ण्05) में संदर्भ विकृति से काफी भिन्न है, तो इस परिणाम से पता चलता है कि तनाव प्रतिस्पर्धा हुई होगी। चरण 4.2.1.5 पर आगे बढ़ें.
      5. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्रतियोगी तनाव की उपस्थिति ने 5 ज के बाद संदर्भ तनाव के अनुपात को कम कर दिया है, एक छात्र के टी-परीक्षण को नियंत्रण में संदर्भ तनाव के अनुपात के साथ नियंत्रण में संदर्भ तनाव के अनुपात की तुलना में प्रदर्शन करें प्रयोगात्मक उपचार (संदर्भ तनाव v प्रतियोगी तनाव).
        नोट: यदि संदर्भ तनाव का अनुपात नियंत्रण के सापेक्ष प्रयोगात्मक उपचार में सांख्यिकीय रूप से कम है (पी एंड एलटी; 0.05), तो प्रतियोगी तनाव काफी 5 ज के बाद संदर्भ तनाव के अनुपात को कम कर दिया और संदर्भ तनाव से बाहर कर दिया.
    2. प्रत्येक उपचार के लिए लॉग RCI मान की गणना (नियंत्रण सहित)
      नोट: सापेक्ष प्रतिस्पर्धी सूचकांक, या RCI, एक एकल मान है कि कैसे तनाव प्रकार के अंत अनुपात प्रारंभिक अनुपात से अलग है की तुलना है. RCI मान लॉग-रूपांतरण है कि शून्य से अधिक लॉग RCI मान प्रतिस्पर्धी तनाव (CS) को इंगित करता है कि संदर्भ तनाव (RS), शून्य से कम लॉग RCI मान इंगित करता है कि संदर्भ तनाव प्रतिस्पर्धी तनाव, और एक लॉग RCI शून्य का मान इंगित करता है कि न तो तनाव से अधिक प्रतिस्पर्धा की गई थी।
      1. निम्न समीकरण का उपयोग कर प्रत्येक नियंत्रण और प्रयोगात्मक उपचार के लिए लॉग RCI मान की गणना करें:
        लॉग करें [(CST5 CFU ] रुपयेT5 CFUs) ] (सीएसT0 CFU ] आरएसटी0 CFUs)] लॉग RCI
      2. ग्राफ़ लॉग RCI एक अलग बॉक्स और मूंछ साजिश जहां डेटा क्षैतिज दिशा में रेखांकन कर रहे हैं का उपयोग कर मूल्यों (चित्र 3B).
      3. निर्धारित करें कि क्या प्रत्येक उपचार एक छात्र के t-परीक्षण प्रत्येक उपचार (नियंत्रण सहित) के लॉग RCI मानों की तुलना करने के द्वारा शून्य से काफी अलग था एक शून्य मान के साथ प्रतिकृति की एक ही संख्या की तुलना करने के लिए एक डेटा सेट करने के लिए। यदि प्रयोगात्मक उपचार के लिए लॉग RCI मान सांख्यिकीय शून्य से अधिक हैं (P और lt; 0.05), तो प्रतियोगी तनाव संदर्भ तनाव outcompiate.
        नोट: नियंत्रण सांख्यिकीय शून्य से अलग नहीं होना चाहिए (P gt; 0.05), क्योंकि अंतर टैग संदर्भ उपभेदों isogenic हैं.
      4. प्रयोगात्मक उपचार के लिए लॉग RCI मान नियंत्रण से काफी अधिक थे कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक छात्र के t-परीक्षण प्रदर्शन (P और lt; 0.05). यदि प्रयोगात्मक उपचार से लॉग RCI मान सांख्यिकीय नियंत्रण उपचार से अधिक हैं, तो प्रतियोगी तनाव संदर्भ तनाव outcompiated.
  3. तंत्र जिसके द्वारा प्रतिस्पर्धी तनाव संदर्भ तनाव outcompes निर्धारित करने के लिए निम्न सांख्यिकीय विश्लेषण करें: (i) कच्चे कुल CFU डेटा का विश्लेषण, या (ii) संदर्भ तनाव के प्रतिशत वसूली की जांच. ये विश्लेषण चरण 4-2 से उन लोगों के सापेक्ष देखने के लिए अधिक बोझिल हो सकते हैं, लेकिन यह पहचान करेंगे कि क्या प्रतिस्पर्धी तनाव इसे बढ़ाकर संदर्भ तनाव को बाहर निकाल देता है, संदर्भ तनाव वृद्धि को रोकता है, या सक्रिय रूप से संदर्भ तनाव को दूर करता है।
    1. कच्चे कुल CFU डेटा का विश्लेषण
      1. एक अंतर-पत्र स्कैटर प्लॉट का उपयोग करके दोनों उपभेदों के लिए कच्चे कुल CFU डेटा को ग्राफ़ करें, जहाँ प्रतिकृतियां अलग-अलग डेटा बिंदुओं के रूप में दिखाई जाती हैं (चित्र 4A)। लॉग स्केल पर डेटा प्रदर्शित करें, और दोनों उपभेदों के लिए औसत T0 CFUs इंगित करने वाली क्षैतिज रेखा जोड़ें.
      2. प्रतियोगी तनाव की उपस्थिति नकारात्मक संदर्भ तनाव को प्रभावित किया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, T5 पर नियंत्रण और प्रयोगात्मक उपचार के लिए संदर्भ तनाव CFUs की तुलना एक छात्र के टी परीक्षण प्रदर्शन. यदि संदर्भ तनाव प्रयोगात्मक उपचार में CFUs सांख्यिकीय नियंत्रण की तुलना में कम कर रहे हैं (पीएंड एलटी; 0.05), तो प्रतियोगी तनाव की उपस्थिति काफी संदर्भ तनाव को प्रभावित किया.
      3. प्रतियोगी तनाव की उपस्थिति या तो के विकास को बाधित या संदर्भ तनाव का सफाया निर्धारित करने के लिए, नियंत्रण और प्रयोगात्मक उपचार के लिए T0 और T5 पर संदर्भ तनाव CFUs की तुलना एक छात्र के टी परीक्षण प्रदर्शन.
        नोट: एक प्रतियोगी के अभाव में, संदर्भ तनाव CFU में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाना चाहिए जब नियंत्रण उपचार के लिए T0 और T5 की तुलना. प्रयोगात्मक उपचार का विश्लेषण करते समय, यदि टी 5 पर संदर्भ तनाव CFUs सांख्यिकीय रूप से T0 (चएवं 0.05) की तुलना में भिन्न नहीं हैं, तो प्रतिस्पर्धी तनाव ने संदर्भ तनाव के विकास को बाधित किया। यदि संदर्भ तनाव T5 CFUs T0 CFUs (पीएंड एलटी; 0.05) की तुलना में काफी कम हैं, तो प्रतिस्पर्धी तनाव संदर्भ तनाव को मार डाला.
    2. संदर्भ तनाव का प्रतिशत वसूली की गणना
      1. संदर्भ तनाव के लिए कुल CFU डेटा रूपांतरण (RS) प्रतिशत वसूली डेटा में समीकरण के नीचे का उपयोग कर:
      2. (आरएसT5 CFUs ] रुपयेT0 CFUs) x 100 ] संदर्भ तनाव की वसूली
      3. एक पृथक छड़ ग्राफ़ का उपयोग करके संदर्भ विकृति की प्रतिशत पुनर्प्राप्ति प्रदर्शित करें जहाँ प्रत्येक छड़ नियंत्रण अथवा प्रयोगात्मक उपचार का प्रतिनिधित्व करती है (चित्र 4ठ)। संदर्भ तनाव की 100% वसूली को इंगित करने के लिए y $ 100 पर डैश्ड रेखा जोड़ें (कोई वृद्धि या संदर्भ तनाव CFUs में 0 h से 5 h तक की कमी)।
      4. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्रतिस्पर्धी तनाव ने संदर्भ तनाव को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया है, प्रयोगात्मक उपचार के लिए नियंत्रण उपचार के लिए संदर्भ तनाव प्रतिशत वसूली की तुलना करने वाले एक छात्र के टी-परीक्षण करें। यदि प्रतिशत वसूली नियंत्रण से काफी कम है (Pऔर lt; 0.05), तो प्रतियोगी तनाव नकारात्मक संदर्भ तनाव को प्रभावित किया.
      5. की पहचान करने के लिए कि क्या प्रतियोगी तनाव के विकास को बाधित या संदर्भ तनाव का सफाया, एक छात्र के टी परीक्षण प्रयोगात्मक उपचार के लिए संदर्भ तनाव प्रतिशत वसूली की तुलना और एक के साथ सभी प्रतिकृति की एक ही संख्या के साथ एक डेटा सेट प्रदर्शन 100 का मूल्य.
        नोट: यदि प्रयोगात्मक उपचार सांख्यिकीय रूप से 100 (चएवं 0ण्05) से भिन्न नहीं है, तो प्रतिस्पर्धी तनाव ने संदर्भ विकृति के विकास को बाधित किया। यदि प्रयोगात्मक उपचार में संदर्भ तनाव प्रतिशत वसूली काफी 100 से कम है (पीएंड एलटी; 0.05), तो प्रतियोगी तनाव संदर्भ तनाव को मार डाला.
    3. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों की व्याख्या
      1. एक बार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों लिया जाता है, निर्धारित है कि क्या प्रत्येक तनाव स्पष्ट रूप से coincubation स्थान में पता लगाने योग्य है. नियंत्रण coincubation के लिए (संदर्भ तनाव pVSV102 + संदर्भ तनाव pVSV208), दोनों GFP और आरएफपी एक coincubation स्थान से दिखाई देना चाहिए. यदि ऐसा नहीं है, तो प्रयोग को फिर से सेट करें जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि उपभेदों को एंटीबायोटिक-मुक्त प्लेटों पर ठीक से लेबल किया गया है और उन्हें coincubated किया गया है।
      2. प्रत्येक प्रयोगात्मक coincubation स्थान के लिए, संभव परिणामों के लिए जाँच करें.
        नोट: यदि प्रतियोगी तनाव दिखाई देता है, लेकिन संदर्भ तनाव का पता नहीं चला है, कि प्रतियोगी तनाव को मार डाला या संदर्भ तनाव के विकास को बाधित पता चलता है. यदि दोनों उपभेदों मौजूद हैं और समान रूप से मिश्रित (GFP और आरएफपी coincubation स्थान भर में मौजूद), इन आंकड़ों का सुझाव प्रतियोगी तनाव संदर्भ तनाव के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं करता है और दोनों उपभेदों coexist. यदि दोनों उपभेदों मौजूद हैं, लेकिन स्थानिक रूप से अलग कर रहे हैं (या तो GFP या आरएफपी के microcolonies coincubation स्थान भर में मौजूद हैं), कि संदर्भ तनाव और प्रतियोगी तनाव से पता चलता है प्रतिस्पर्धी बातचीत और संशोधनों में आकर्षक हो सकता है संदर्भ तनाव या प्रारंभिक coincubation अनुपात की आवश्यकता हो सकती है. अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें.

5. यह निर्धारित करना कि क्या सहभागिता संपर्क-निर्भर है

नोट: यदि आप पाते हैं कि एक तनाव को मारता है या संदर्भ तनाव को रोकता है, बातचीत diffusible या संपर्क पर निर्भर हो सकता है. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सहभागिता कक्ष-कक्ष संपर्क पर निर्भर है, निम्न संशोधनों के साथ 1-2 चरणों के लिए ऊपर वर्णित एक coincubation आखूद करें.

  1. 1-1-2-2 चरण निष्पादित करें.
  2. एक बार उपभेदों सामान्यीकृत कर रहे हैं, शारीरिक रूप से अलग उपभेदों एक 0.22 मिमी pores आकार के साथ एक नाइट्रोसेलुलोस फिल्टर का उपयोग कर. यह छिद्र आकार एंटीमाइक्रोबियल और छोटे अणुओं के प्रसार के लिए अनुमति देता है लेकिन वी fischeri कोशिकाओं के बीच शारीरिक संपर्क को रोकता है।
    नोट: यदि बातचीत सेल सेल संपर्क पर निर्भर है, फिल्टर के साथ प्रतियोगी तनाव से संदर्भ तनाव के जुदाई हत्या या निरोधात्मक phenotype समाप्त करना चाहिए और संदर्भ तनाव CFUs कम नहीं होना चाहिए. यदि बातचीत सेल सेल संपर्क पर निर्भर नहीं है, और एक diffusible तंत्र है, उपभेदों को अलग करने संदर्भ तनाव की हत्या से प्रतियोगी तनाव को रोकने नहीं करना चाहिए.
    1. एक अलग फिल्टर के केंद्र पर एक फिल्टर और स्पॉट 5 एमएल प्रतियोगी तनाव के केंद्र पर संदर्भ तनाव के 5 एमएल स्पॉट 5 एमएल स्पॉट. एलबीएस ऐगार प्लेट की सतह पर संदर्भ तनाव युक्त फिल्टर रखें। संदर्भ तनाव के साथ फिल्टर के शीर्ष पर सीधे प्रतियोगी तनाव युक्त फिल्टर रखें.
      नोट: प्रत्येक तनाव फिल्टर पर देखा जाता है बजाय नीचे तनाव agar प्लेट पर सीधे देखा तो उपभेदों और अधिक आसानी से एक दूसरे के शीर्ष पर सीधे रखा जा सकता है.
    2. यदि चिंता है कि उपभेदों सीधे एक दूसरे के शीर्ष पर खड़ी नहीं कर रहे हैं, संदर्भ तनाव inoculum की मात्रा को कम फिल्टर पर देखा. यह सुनिश्चित करेगा संदर्भ तनाव स्थान के क्षेत्र छोटे और पूरी तरह से ऊपर या प्रतियोगी तनाव के नीचे है. वैकल्पिक जो तनाव शीर्ष पर और नीचे आगर माध्यम से पोषक तत्वों के प्रसार में अंतर के लिए खाते में है.
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर छोटे अणुओं के प्रसार के लिए अनुमति देता है, एक नियंत्रण उपचार जहां संदर्भ तनाव एक फिल्टर पर देखा जाता है और एक एंटीबायोटिक है कि यह करने के लिए संवेदनशील है शामिल (chloramphenicol) दूसरे पर देखा जाता है. एक दूसरे के शीर्ष पर सीधे फिल्टर ढेर और एक एलबीएस agar प्लेट पर जगह है. एंटीबायोटिक फिल्टर के माध्यम से फैलाना करने में सक्षम होना चाहिए और संदर्भ तनाव को मार देना चाहिए.
  3. 5 ज के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर के साथ प्लेटों को इनक्यूबेट करें। फिल्टर ले जाने से बचने के लिए इनक्यूबेट करते समय आगर प्लेट को उलटा न करें।
  4. चरण 2.4 के अनुसार शुरू inoculum के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन.
  5. टी अंतिम माप ले रहा है
    1. बाँझ चम्मियों का उपयोग करना, एलबीएस शोरबा के 5 एमएल युक्त एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब के लिए फिल्टर के प्रत्येक सेट हस्तांतरण। सुनिश्चित करें कि फिल्टर शारीरिक रूप से ट्यूब के भीतर अलग कर रहे हैं प्रत्येक तनाव प्रकार के पूर्ण resuspension के लिए अनुमति देते हैं.
    2. फिल्टर सभी कोशिकाओं के स्पष्ट कर रहे हैं जब तक ऊपर और नीचे pipeting द्वारा फिल्टर से उपभेदों को फिर से निलंबित. दोनों पक्षों से फिल्टर और स्पष्ट सेल सामग्री बारी बारी से करने के लिए चम्मिताकाओं का प्रयोग करें। नमूनों के बीच इथेनॉल के साथ चितर्ंकिल।
    3. चरण 2.5 के अनुसार टी फाइनल के लिए सीरियल कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। T final के लिए कुल CFUs की गणना करते समय, "अनdiluted नमूना की कुल मात्रा" 1 एमएल से 5 एमएल तक समायोजित करें.

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Representative Results

जीवाणु आबादी के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत का आकलन करने के लिए, एक coincubation परख प्रोटोकॉल विकसित किया गया था और वी fischeriके लिए अनुकूलित . इस विधि स्थिर प्लाज्मिड का इस्तेमाल करता है कि एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेत: कोडित, अंतर चयन और प्रत्येक तनाव के दृश्य भेदभाव के लिए अनुमति देता है. coincubation परख से एकत्र डेटा का विश्लेषण करके, एक बातचीत के प्रतिस्पर्धी परिणाम और बातचीत के तंत्र की पहचान की जा सकती है. एक उदाहरण के रूप में, निम्न लिखित प्रयोगों V. fischeri अलग का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. Coincubated उपभेदों दो स्थिर प्लाज्मिड में से एक आश्रय: pVSV102 kanamycin प्रतिरोध और GFP +, या pVSV208 chloramphenicol प्रतिरोध और DsRed व्यक्त व्यक्त +. नमूना डेटा में, उपभेदों को 1:1 अनुपात में मिलाया गया और एलबीएस आगर प्लेटों पर 5 एच के लिए इनक्यूबेट किया गया। एक नियंत्रण उपचार के रूप में, संदर्भ तनाव के अंतर टैग संस्करणों एक दूसरे के साथ coincubated थे. प्रयोगात्मक उपचार संदर्भ तनाव के साथ प्रदर्शन किया गया (harboring pVSV102) और या तो प्रतियोगी तनाव 1 या प्रतियोगी तनाव 2 (harboring pVSV208). प्रत्येक विकृति की संस्कृतितैयार की गई थी और ऊपर वर्णित और चित्र 2 में दर्शाए अनुसार इसे बनाया गया था ।

चित्र 3 मेंयह निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया है कि क्या प्रतियोगी तनाव 1 या 2 संदर्भ विकृति को दो तरीकों से प्रस्तुत किया गया है। चित्र 3क मेंप्रयोग के दौरान प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रत्येक विकृति प्रकार के अनुपात की गणना चरण 4-2-1 के अनुसार की गई थी। प्रयोगात्मक उपचारमें, नमूना डेटा संदर्भ विकृति को दर्शाता है और प्रतियोगी विकृति 1 प्रयोग की शुरुआत (0 ज) और अंत (5 ज) में 0.5 के अनुपात में मौजूद है, जो नियंत्रण उपचार में जो देखा जाता है उसके अनुरूप है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि एक 5 h coincubation के बाद उपभेदों के अनुपात में परिवर्तन नहीं हुआ है, और इसलिए कोई प्रतियोगिता नहीं मनाया गया था. इसके विपरीत, जब संदर्भ तनाव प्रतियोगी तनाव 2 के साथ incubated किया गया था, संदर्भ तनाव शुरुआत में 0.5 के अनुपात में मौजूद था (0 ज), और एक अनुपात और 0.01 अंत में (5 ज) प्रयोग है, जो नियंत्रण से काफी कम था उपचार (छात्र की टी-परीक्षण: P और lt; 0.001). इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि संदर्भ तनाव के अनुपात प्रतियोगी तनाव 2 की उपस्थिति में कमी आई है, और इसलिए प्रतियोगी तनाव 2 और संदर्भ तनाव के बीच प्रतिस्पर्धा का सुझाव दिया. इस प्रकार का विश्लेषण यह निर्धारित करते समय लागू किया जाना चाहिए कि समय के साथ समुदाय के भीतर उपभेदों का अनुपात कैसे बदलता है लेकिन प्रतिस्पर्धी बातचीत के तंत्र को निर्धारित करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है, और इसलिए अतिरिक्त विश्लेषण के साथ जोड़ा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रतिस्पर्धी तनाव 2 की उपस्थिति में कम होने वाले संदर्भ तनाव के अनुपात को कई प्रकार के इंटरैक्शन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है: (i) तनाव 2 संदर्भ तनाव की तुलना में अधिक तेज़ी से बढ़ा, (ii) तनाव 2 ने संदर्भ के विकास को बाधित किया तनाव, या (iii) तनाव 2 हत्या के माध्यम से संदर्भ तनाव का सफाया.

चित्र 3Bमें, चरण 4.2.2 के अनुसार प्रत्येक उपचार के लिए लॉग संबंधित प्रतिस्पर्धी अनुक्रमणिका (RCI) की गणना की गई थी. जब संदर्भ तनाव प्रतिस्पर्धी तनाव 1 के साथ incubated किया गया था, लॉग RCI मूल्यों सांख्यिकीय शून्य से या नियंत्रण उपचार से अलग नहीं थे (पी और 0.05), उपभेदों के बीच प्रतिस्पर्धा का सुझाव नहीं देखा गया था. जब संदर्भ तनाव प्रतियोगी तनाव 2 के साथ incubated किया गया था, तथापि, लॉग RCI मान शून्य से काफी अधिक थे और नियंत्रण उपचार (छात्र टी परीक्षण: पी एंड एलटी; 0.001). इन आंकड़ों से पता चलता है कि तनाव 2 ने संदर्भ तनाव को कम से कम कर दिया है। लॉग RCI मान का विश्लेषण एक तनाव ऊष्मायन अवधि के दौरान अन्य outcompicompidd निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है। चूँकि इस विश्लेषण में अंत (5 ज) पर उपभेदों का अनुपात और प्रयोग की शुरुआत (0 ज) शामिल है, इसलिए प्रारंभिक अनुपात परिणाम को नाटकीय रूप से प्रभावित कर सकता है. इसलिए, प्रारंभिक अनुपात की जांच की जानी चाहिए और जब निष्कर्ष लॉग RCI डेटा से प्राप्त करते हैं पर विचार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह विश्लेषण प्रतिस्पर्धी तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है और बस रिपोर्ट कैसे उपभेदों के अनुपात ऊष्मायन के दौरान बदल जाते हैं.

चित्र 4 किसी दिए गए अन्योन्यक्रिया के लिए प्रतिस्पर्धा के तंत्र का निर्धारण करने के लिए डेटा विश्लेषण की दो विधियाँ प्रदर्शित करता है। चित्र 4क मेंप्रयोग के प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक विकृति के लिए कुल CFUs प्रदर्शित किए जाते हैं। जब संदर्भ तनाव प्रतिस्पर्धी तनाव 1 के साथ incubated किया गया था, दोनों उपभेदों के CFUs 5 एच के पाठ्यक्रम पर वृद्धि और संदर्भ तनाव के लिए CFUs तनाव से काफी अलग नहीं थे 1 या 5 ज पर नियंत्रण (पी gt; 0.05). इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि संदर्भ तनाव 1 तनाव की उपस्थिति में वृद्धि हुई है, और कोई प्रतियोगिता हुई सुझाव है. हालांकि, जब संदर्भ तनाव प्रतियोगी तनाव 2 के साथ incubated किया गया था, तनाव 2 CFUs 5 ज के बाद वृद्धि हुई है, लेकिन संदर्भ तनाव के लिए CFUs कमी आई. संदर्भ तनाव CFUs तनाव 2 CFUs और 5 एच पर नियंत्रण से काफी कम थे (छात्र टी परीक्षण: पी एंड एलटी; 0.002). इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि संदर्भ तनाव CFUs तनाव 2 की उपस्थिति में कमी, और सुझाव तनाव 2 संदर्भ तनाव कोशिकाओं को मारता है. यदि संदर्भ तनाव CFUs में कमी नहीं दिखा था, बल्कि कोई परिवर्तन (संदर्भ तनाव CFUs के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर 0 h और 5 h पर), इन आंकड़ों का सुझाव होगा तनाव 2 संदर्भ तनाव के विकास को बाधित करके संदर्भ तनाव outcompeted. Untransformed कुल CFU डेटा का विश्लेषण विशेष रूप से जानकारीपूर्ण है, के रूप में प्रत्येक समय बिंदु पर दोनों उपभेदों के लिए CFUs स्वतंत्र रूप से प्रदर्शित कर रहे हैं और प्रतियोगिता के तंत्र की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्र 4ख यह निर्धारित करने के लिए कि प्रतिस्पर्धी विकृति की उपस्थिति संदर्भ विकृति को कैसे प्रभावित करती है, संदर्भ विकृति की प्रतिशत वसूली दर्शाती है। जब संदर्भ तनाव प्रतिस्पर्धी तनाव 1 के साथ incubated किया गया था, एक $3,200 प्रतिशत वसूली देखा गया था, जो सांख्यिकीय नियंत्रण से अलग नहीं था और इंगित करता है तनाव 1 संदर्भ तनाव के प्रतिशत वसूली को प्रभावित नहीं किया. जब संदर्भ तनाव प्रतियोगी तनाव 2 के साथ incubated किया गया था, एक $ 4 प्रतिशत वसूली, जो नियंत्रण से काफी कम था मनाया गया (छात्र टी परीक्षण: पी एंड एलटी; 0.002). प्रतिशत वसूली भी काफी कम था 100 (छात्र टी परीक्षण: पी एंड एलटी; 0.002), तनाव का संकेत 2 संदर्भ तनाव कोशिकाओं की हत्या करके संदर्भ तनाव outcompetd. यदि प्रतिशत वसूली सांख्यिकीय 100 से अलग नहीं था, उन आंकड़ों का सुझाव होगा तनाव 2 संदर्भ तनाव के विकास को बाधित. प्रतिशत वसूली डेटा कैसे संदर्भ तनाव जनसंख्या एक प्रतियोगी तनाव की उपस्थिति के लिए प्रतिक्रिया की जांच करके प्रतियोगिता के तंत्र की विशेषता के लिए एक सरलीकृत तरीका प्रदान करता है. हालांकि, इस तरह से डेटा प्रदर्शित करने के साथ ही कैसे प्रतियोगी तनाव की बहुतायत ऊष्मायन भर में बदल के बारे में जानकारी शामिल नहीं है.

Figure 1
चित्र 1: प्रवाहचार्ट सिक्कापरख का चित्रण | (ए) जीवाणु उपभेदों या तो pVSV102 बंदरगाह (संदर्भ तनाव संकेत ref. तनाव या R.S.) या pVSV208 (प्रतियोगी तनाव संकेत Comp. तनाव या सी.एस.) या तो संदर्भ तनाव के लिए मीडिया चयनात्मक पर अलग से बड़े हो रहे हैं (LBS Kan) या प्रतियोगी तनाव (LBS कैम). तनाव तो एलबीएस शोरबा में फिर से निलंबित कर रहे हैं और एक OD करने के लिए सामान्यीकृत $ 1.0. () संदर्भ विकृति तथा प्रतिस्पर्द्धी विकृति को आयतन के 1ः1 अनुपात में मिलाया जाता है। एक सीरियल कमजोर पड़ने इस मिश्रण के साथ किया जाता है 0 एच पर दोनों उपभेदों के लिए CFUs निर्धारित करने के लिए (सी) तनाव मिश्रण तो एलबीएस agar युक्त 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर देखा जाता है. प्रत्येक प्रतिकृति अपने ही अच्छी तरह से में देखा है. स्पॉट को सूखने की अनुमति है और फिर 5 एच के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। 5 ज के बाद, प्रत्येक तनाव के लिए CFUs की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सीरियल कमजोर पड़ने किया जाता है। (घ) पैनल बी से तनाव मिश्रण को एलबीएस आगर पेट्री प्लेट्स पर भी देखा जाता है, जिस्हें 24 डिग्री सेल्सियस पर सूखने और इनक्यूबेट करने की अनुमति दी जाती है। 24 ज पर, coincubation स्थान एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप है कि हरे (संदर्भ तनाव) और लाल (प्रतियोगी तनाव) फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए अनुकूलित है का उपयोग कर छवि है. स्केल बार - 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक सीरियल कमजोर पड़ने के लिए आवश्यक प्लेटों के प्रतिनिधि छवियों. (ए) 96-वेल प्लेट का प्रयोग सीरियल कमजोर पड़ने के लिए किया जाता है। प्लेट को इस प्रकार घुमाया जाता है कि 12 पंक्तियाँ और 8 स्तंभ हों। प्रत्येक उपचार के डिस्क्रिप्टर का इस्तेमाल किया उपभेदों और plasmids वे बंदरगाह (उदाहरण के लिए, PVSV102 के साथ संदर्भ तनाव और pVSV208 के साथ प्रतियोगी तनाव) और प्रत्येक पंक्ति के लिए प्रतिकृति संख्या (R1, R2, R3, या R4) शामिल हैं. पहला स्तंभ undiluted नमूना है और प्रत्येक स्तंभ करने के लिए सही करने के लिए पिछले स्तंभ से एक 10 गुना कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करता है (ऊपर सूचीबद्ध dilution कारक). (बी) एलबीएस एगार प्लेट का उपयोग एलबीएस कान प्लेट (ऊपर) पर संदर्भ तनाव के लिए CFUs निर्धारित करने के लिए किया जाता है और प्रयोगात्मक उपचार से एलबीएस कैम प्लेट (नीचे) पर प्रतिस्पर्धी तनाव। प्रत्येक पंक्ति एक उपचार में दोहराने है (उदा., R1) और प्रत्येक स्थान के कमजोर पड़ने कारक थाली के शीर्ष पर सूचीबद्ध है. प्रत्येक प्रतिकृति के लिए गिना CFUs की संख्या दाईं ओर सूचीबद्ध है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: यह आकलन करने के लिए नमूना डेटा कि प्रतिस्पर्धी संदर्भ तनाव को कम से कम कर देता है या नहीं. (ए) या तो pVSV102 (अंधेरे ग्रे) या pVSV208 (प्रकाश ग्रे) शरण coincubating उपभेदों का अनुपात. आर.एस. संदर्भ तनाव इंगित करता है और सी.एस. प्रतिस्पर्धी तनाव इंगित करता है। डैश्ड क्षैतिज रेखा 0.5 के अनुपात को इंगित करती है। Asterisk 5 h पर नियंत्रण में प्रतियोगी तनाव या संदर्भ तनाव की तुलना में जनसंख्या के सांख्यिकीय रूप से छोटे अनुपात बनाया संदर्भ तनाव इंगित करता है (छात्र टी परीक्षण: पी एंड 0.001); ंं न ः न ः न ः तः च । (ख) सिक्का करण परख के लिए लॉग सापेक्ष प्रतिस्पर्धी सूचकांक (आरसीआई)। डैश्ड अनुलंब रेखा लॉग RCI को इंगित करता है - शून्य. Asterisk इंगित करता है लॉग RCI मान सांख्यिकीय शून्य से अधिक है और नियंत्रण (छात्र के t-परीक्षण: P और lt; 0.001) है। त्रुटि पट्टियाँ SEM इंगित करती हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रतिस्पर्धा के तंत्र का निर्धारण करने के लिए नमूना डेटा। (A ) कुल CFU coincubation परख के लिए मायने रखता है वी fischeri isolates कि अंतर या तो pVSV102 या pVSV208 के साथ टैग किया गया के साथ प्रदर्शन किया. CFUs प्रयोग की शुरुआत में एकत्र किए गए थे (0 ज) और 5 ज ऊष्मायन के बाद. आर.एस. संदर्भ तनाव इंगित करता है और C.S. प्रतिस्पर्धी तनाव इंगित करता है। डैश्ड क्षैतिज रेखा दोनों उपभेदों के लिए औसत 0 ज CFUs इंगित करता है; तारांकन चिह्न इंगित करता है संदर्भ तनाव CFUs सांख्यिकीय 5 एच पर नियंत्रण उपचार के सापेक्ष प्रयोगात्मक उपचार में कम थे (छात्र टी परीक्षण: पी एंड एलटी; 0.002). () संदर्भ तनाव का प्रतिशत वसूली. क्षैतिज डैश्ड लाइन 100% वसूली इंगित करता है (CFUs में कोई वृद्धि या कमी); तारांकन इंगित करता है प्रतिशत वसूली सांख्यिकीय 100% से कम था और नियंत्रण उपचार (छात्र टी परीक्षण: पी एंड एलटी; 0.002). त्रुटि पट्टियाँ SEM इंगित करती हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ऊष्मायन समय और इमेजिंग ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए नमूना डेटा. (ए) सिक्का परख के लिए कुल CFUs जहां CFUs प्रयोग की शुरुआत में एकत्र किए गए थे (0 ज), के बाद 5, 12, और 24 एच ऊष्मायन. आर.एस. संदर्भ तनाव इंगित करता है और C.S.2 प्रतिस्पर्धी तनाव 2 इंगित करता है। डैश्ड क्षैतिज रेखा दोनों उपभेदों के लिए औसत 0 ज CFUs इंगित करता है; तारांकन संकेत संदर्भ तनाव CFUs सांख्यिकीय दिए गए समय बिंदु पर नियंत्रण उपचार के सापेक्ष प्रयोगात्मक उपचार में कम थे (छात्र टी परीक्षण: पी एंड एलटी; 0.002). त्रुटि बार SEM. (B) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों को पैनल A. स्केल बार में CFU डेटा के साथ संगत इंगित करते हैं A. स्केल बार. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. coincubation अनुपात अनुकूलन के लिए नमूना डेटा. Coincubation प्रयोगों संदर्भ तनाव (आर.एस.) pVSV102 शरण (हरी, शीर्ष पंक्ति) और प्रतियोगी तनाव (सी.एस.) pVSV208 (लाल, नीचे पंक्ति) और फ्लोरोसेंटमाइक्रोस्कोपी छवियों के बीच प्रदर्शन किया गया 24 ज (ए ) उपभेदों पर लिया गया एक 1:1 अनुपात या( बी) एक 1:5 अनुपात में मिलाया गया था, जहां संदर्भ तनाव, pVSV102 युक्त, pVSV208 युक्त प्रतियोगी तनाव से outnumbered था. स्केल बार - 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऊपर वर्णित coincubation परख interbactrial प्रतियोगिता की खोज करने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण वी fischeri अलग और प्रतिस्पर्धी तंत्र की विशेषता के बीच intraspecific प्रतियोगिता की पहचान के लिए अनुमति दी19. हालांकि विधि वर्णित समुद्री जीवाणु वी fischeriके लिए अनुकूलित किया गया था, यह आसानी से नैदानिक और पर्यावरण को अलग सहित अन्य जीवाणु प्रजातियों को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिस्पर्धीतंत्र प्राय: सशर्त 5 ,6,23,24,25,26,27 को सशर्त विनियमित होते हैं . , 28, इस प्रकार विकास की स्थिति में छोटे अंतर (उदाहरण के लिए, मिलाते हुए बनाम खड़े संस्कृति, तापमान, आदि) और मीडिया प्रकार (उदाहरण के लिए, नमक सामग्री) नाटकीय रूप से परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, coincubation शर्तों के अनुकूलन की संभावना विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के साथ ही विभिन्न प्रतिस्पर्धी तंत्र के लिए आवश्यक है. यह संस्कृति की स्थिति है कि बारीकी से अलग के प्राकृतिक वातावरण को प्रतिबिंबित का चयन करने के लिए सबसे अच्छा है. उदाहरण के लिए, समुद्री पर्यावरण की लवणता और तापमान को प्रतिबिंबित करने के लिए, वी फिशरी उपभेदों के बीच सिक्का-पत्र परख 24 डिग्री सेल्सियस पर एलबीएस मीडिया के साथ निष्पादित किया गया था। तथापि, कुछ जीवाणु स्वाभाविक रूप से अपने वातावरण में27,28 में सक्षम होते हैं और इसलिए विरोधी बातचीत29के दौरान lysed कोशिकाओं द्वारा जारी आनुवंशिक सामग्री को ले जा सकते हैं. coincubation परिणामों को प्रभावित करने से इस तरह के डीएनए हस्तांतरण को रोकने के लिए, यह क्षमता या उपभेदों कि सक्षम नहीं हैं, या तो स्वाभाविक रूप से या डीएनए तेज मशीनरी के निष्क्रियता के माध्यम से नहीं है कि शर्तों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सेल विकास चरण, संस्कृति घनत्व, ऊष्मायन समय, या शुरू तनाव अनुपात जैसे प्रयोगात्मक मापदंडों को भी विभिन्न जीवाणु प्रजातियों या प्रतिस्पर्धी तंत्र के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक संस्कृति घनत्व उपभेदों के बीच सेल सेल संपर्क की मात्रा तय करेगा, जो प्रतिस्पर्धा के संपर्क पर निर्भर तंत्र को तैनात करने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता को प्रभावित कर सकता है।

चित्र 5क वी के साथ coincubation परख के अनुकूलन की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है. यहाँ, CFU संग्रह और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए ऊष्मायन समय की एक श्रृंखला प्रत्येक मीट्रिक एकत्र करने के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया गया. CFUs तुरंत संदर्भ तनाव और प्रतियोगी तनाव 2 के मिश्रण के बाद एकत्र किए गए एलबीएस agar प्लेटें (0 ज) पर देखा गया था, और CFU माप और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों तुरंत लिया गया और 5, 12, और 24 ज के बाद. ये नमूना डेटा दो उपभेदों के बीच बातचीत के बारे में कोई निष्कर्ष निकालने से पहले पूरी तरह से अनुकूलन के महत्व पर प्रकाश डाला. उदाहरण के लिए, बातचीत के तंत्र के बारे में दो अलग अलग निष्कर्ष जब CFUs एकत्र कर रहे हैं के आधार पर deduced किया जा सकता है: CFUs से संकेत मिलता है तनाव 2 संदर्भ तनाव को मार डाला, जबकि CFUs 24 h पर एकत्र सुझाव तनाव 2 के विकास को रोकता है संदर्भ तनाव.

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से coincubation स्पॉट के दृश्य के लिए इष्टतम समय CFU संग्रह के लिए इष्टतम समय से अलग हो सकता है. चित्रा 5B 0, 5, 12, और 24 एच पर coincubation स्पॉट के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों को प्रदर्शित करता है। 0 और 5 ज पर, coincubation स्पॉट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ दिखाई नहीं दे रहे हैं. 12 एच पर ली गई छवियों के लिए, नियंत्रण उपचार में दोनों उपभेदों दिखाई दे रहे हैं, अभी तक आरएफपी (संदर्भ तनाव pVSV208) विशेष रूप से dimmer है. 12 h पर प्रयोगात्मक उपचार में, प्रतियोगी तनाव 2 दिखाई देता है (अभी तक मंद) और संदर्भ तनाव पता लगाने योग्य नहीं है. जीवाणु अलग के बीच तनाव-विशिष्ट मतभेद फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं, और इस प्रकार मिश्रित स्थान में कोशिकाओं की चमक. क्योंकि RFP नियंत्रण में GFP की तुलना में विशेष रूप से dimmer है, coincubation स्पॉट incubated किया जा करने के लिए जारी रखना चाहिए और एक बाद में समय पर फिर से छवि. 24 ज पर ली गई छवियों में, दोनों उपभेदों प्रत्यक्ष रूप से पता लगाने योग्य हैं और नियंत्रण प्रयोग में एक समान चमक पर. प्रयोगात्मक उपचार तनाव में 2 दिखाई देता है, जबकि संदर्भ तनाव coincubation स्थान के भीतर नहीं मनाया जाता है. 15 - 24 ज ऊष्मायन समय क्रमशः स्थिर प्लाज्मिड pVSV102 और pVSV208 का उपयोग कर वी fischeri के लिए GFP और आरएफपी कल्पना करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन ऊष्मायन समय विभिन्न प्लाज्मिड या जीवाणु प्रजातियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि coincubation स्पॉट के दृश्य और CFU डेटा इकट्ठा करने के लिए इष्टतम समय अलग हैं, 24 एच पर इमेजिंग जल्दी वी fischeriके लिए बातचीत स्क्रीन करने के लिए एक अच्छा तरीका है, क्योंकि 24 एच पर इमेजिंग से प्राप्त परिणाम (लक्ष्य दिखाई है या नहीं) 5 या 12 एच पर चढ़ाना सीएफएस से प्राप्त अधिक समय गहन मात्रात्मक डेटा को दर्शाता है।

प्रारंभिक अनुपात काफी परिणाम प्रभावित कर सकते हैं, खासकर जब दो निरोधात्मक उपभेदों incubating, और दक्षता या विकास दर की हत्या में तनाव विशिष्ट मतभेद के लिए खाते में समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, चित्र 6क उन प्रयोगों की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों को प्रदर्शित करता है, जहाँ संदर्भ विकृति को स्वयं (नियंत्रण) और तीन अन्य V. fischeri के साथ coincubated किया गया था, जो 1:1 अनुपात से प्रारंभ होता है. इन नमूना डेटा में, संदर्भ तनाव स्पष्ट रूप से पता चला है जब खुद के साथ incubated, प्रतियोगी तनाव 1, और प्रतियोगी तनाव 3 24 ज के बाद. हालांकि, जब प्रारंभिक अनुपात को 1:5 (यानी, 50 एमएल संदर्भ तनाव के साथ प्रतिस्पर्धी तनाव के साथ मिश्रित समायोजित किया गया था) संदर्भ तनाव केवल स्पष्ट रूप से पता लगाया जाता है जब खुद के साथ coincubated और तनाव 1, यह दर्शाता है कि दोनों तनाव 2 और तनाव 3 outcompiate संदर्भ तनाव. यह समायोजन प्रतिस्पर्धी उपभेदों द्वारा प्रदर्शित किसी भी हस्तक्षेप प्रतियोगिता तंत्र के प्रभाव को अस्पष्ट करने से संदर्भ तनाव की तीव्र वृद्धि दर को रोकता है। चित्र 6Aके परिणामों के आधार पर, 1:5 (संदर्भ विकृति : प्रतियोगी तनाव) का अनुपात संदर्भ विकृति को मारने की क्षमता के लिए अतिरिक्त V. fischeri उपभेदों की जांच करने के लिए किया जाना चाहिए।

यह प्रोटोकॉल या तो कानामिसिन या क्लोरैएम्फीनिकोल प्रतिरोध जीन युक्त प्लाज्मिड के साथ अंतर लेबलिंग उपभेदों द्वारा coincubating उपभेदों के बीच भेदभाव करता है। हालांकि, विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य चयन विधियों बेहतर विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के लिए अनुकूल हो सकता है. अंतर चयन के लिए अन्य तरीकों में शामिल हो सकते हैं: 1) विशिष्ट विकास कारकों (जैसे, डीएपी या थाइमिडीन) के लिए एक तनाव/जाति-विशिष्ट ऑक्सोट्रोफी का शोषण, 2) सशर्त विकास आवश्यकताओं (उदाहरण के लिए, एक तनाव 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है जबकि अन्य नहीं), या 3) counterselection मार्करों कि को खत्म करने या टैग तनाव के विकास को बाधित जब उचित परिस्थितियों में हो एक "हत्या" जीन व्यक्त करने के लिए (उदा., ccdB या sacB).

उचित संदर्भ तनाव का चयन प्राप्त करने और coincubation परख से reproduible परिणाम की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है. एक संदर्भ तनाव अच्छी तरह से अध्ययन किया जाना चाहिए (यानी, वैज्ञानिक साहित्य का एक व्यापक शरीर है), कोई स्पष्ट हत्या या निरोधात्मक क्षमता है, और आदर्श एक अनुक्रम जीनोम है. उदाहरण के लिए, एस्चेरीचिया कोली के कुछ उपभेदों में अनेक जीवाणु सिक्काकरण प्रयोगों30,31के लिए सामान्य संदर्भ उपभेदों हैं। हालांकि, ई. कोलाई एक दिया प्रतिस्पर्धी तंत्र या प्रतियोगी है, जो परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं के लिए पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक नहीं हो सकता है. उदाहरण के लिए, कुछ बैक्टीरिया विशेष रूप से एक ही पारिस्थितिक आला के लिए बारीकी से संबंधित प्रजातियों या प्रतियोगियों को लक्षित तंत्र विकसित हो सकता है और उनके प्रतिस्पर्धी तंत्र एक ई कोलाई संदर्भ तनाव के खिलाफ प्रभावी नहीं होगा.

संक्षेप में, यहाँ वर्णित विधि interbactrial बातचीत और प्रतियोगिता का मूल्यांकन करने के लिए एक आसानी से संशोधित और मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करना है. इस विधि पर्यावरण या नैदानिक अनुसंधान के लिए प्रासंगिक जीवाणु अलग करने के लिए लागू किया जा सकता है, और माइक्रोबियल बातचीत है कि पहले से अज्ञात या जांच करने के लिए मुश्किल किया गया है की विविध तंत्र का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम समीक्षकों को उनकी सहायक प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं. ए.एन.एस. गॉर्डन और बेटी मूर फाउंडेशन द्वारा अनुदान GBMF 255.03 के माध्यम से जीवन विज्ञान अनुसंधान फाउंडेशन के लिए समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

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References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8, (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2, (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8, (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6, (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4, (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198, (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12, (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7, (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198, (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25, (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427, (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24, (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25, (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71, (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72, (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287, (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9, (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4, (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80, (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12, (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347, (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82, (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

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