Double imagerie de bioluminescence de la progression tumorale et de l'angiogenèse

Medicine

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Summary

Ce protocole décrit l'établissement d'un modèle de souris tumeur-portant pour surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse en temps réel par la formation image double de bioluminescence.

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Zhang, K., Wang, C., Wang, R., Chen, S., Li, Z. Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (150), e59763, doi:10.3791/59763 (2019).

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Abstract

L'angiogenèse, comme un processus crucial de progression tumorale, est devenue un point chaud de recherche et la cible de la thérapie anti-tumorale. Cependant, il n'y a aucun modèle fiable pour tracer la progression et l'angiogenèse de tumeur simultanément d'une manière visuelle et sensible. L'imagerie par bioluminescence montre sa supériorité unique dans l'imagerie vivante en raison de ses avantages de sensibilité élevée, de forte spécificité et de mesure précise. Présenté ici est un protocole pour établir un modèle de souris tumeur-portant en injectant une renilla luciferase-étiquetée ligne de cellules de cancer du sein de monourine 4T1 dans la souris transgénique avec l'expression de luciferase de Firefly angiogenèse-induite. Ce modèle de souris fournit un outil valable pour surveiller simultanément la progression de tumeur et l'angiogenèse en temps réel par la double imagerie de bioluminescence dans une souris simple. Ce modèle peut être largement appliqué dans le criblage de drogue antitumoral et la recherche d'oncologie.

Introduction

L'angiogenèse est un processus essentiel dans la progression du cancer de petits néoplasmes localisés à de plus grandes tumeurs potentiellement métastatiques1,2. La corrélation entre la croissance tumorale et l'angiogenèse devient l'un des points d'emphase dans le domaine de la recherche en oncologie. Cependant, les méthodes traditionnelles de mesure des changements morphologiques ne parviennent pas à surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse simultanément chez les animaux vivants en utilisant une approche visualisée.

L'imagerie de bioluminescence (BLI) des cellules de tumeur est une méthode expérimentale particulièrement appropriée pour surveiller la croissance de tumeur en raison de sa non-invasiveness, sensibilité, et spécificité3,4,5,6 . La technologie BLI est basée sur le principe que la luciferase peut catalyser l'oxydation d'un substrat spécifique tout en émettant la bioluminescence. La luciférase exprimée dans les cellules tumorales implantées réagit avec le substrat injecté, qui peut être détecté par un système d'imagerie vivant, et les signaux reflètent indirectement les changements dans le nombre de cellules ou la localisation cellulaire in vivo6,7.

À l'exception de la croissance tumorale, l'angiogenèse tumorale (l'étape critique de la progression du cancer) peut également être visualisée par la technologie BLI à l'aide de souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI8,9,10. Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (Vegf) récepteur 2 (Vegfr2), un type de récepteur Vegf, est principalement exprimé dans les cellules endothéliales vasculaires des souris adultes11. Chez les souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI, la séquence d'ADN de la luciferase Firefly (Fluc) est frappée dans le premier exon de la séquence endogène Vegfr2. En conséquence, le Fluc est exprimé (qui apparaît sous forme de signaux BLI) d'une manière identique au niveau d'angiogenèse chez la souris. Pour se développer au-delà de quelques millimètres de taille, la tumeur recrute de nouvelles vascularisations à partir de vaisseaux sanguins existants, qui expriment fortement le Vegfr2 déclenché par des facteurs de croissance des cellules tumorales1. Ceci ouvre la possibilité d'utiliser des souris transgéniques vegfr2-Fluc-KI pour surveiller non-invasivement l'angiogenèse de tumeur par BLI.

Dans ce protocole, un modèle de souris tumeur-portant est établi pour surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse dans une souris simple par le luciferase de Luciferase de Feu (Fluc) et la luciferase de Renilla (Rluc) image, respectivement (figure 1). Une lignée cellulaire 4T1 (4T1-RR) est créée qui exprime de façon stable le Rluc et la protéine fluorescente rouge (RP) pour retracer la croissance cellulaire par imagerie Rluc. Pour étudier plus avant les changements dynamiques de l'angiogenèse dans la progression et la régression de la tumeur, une autre lignée cellulaire 4T1 (4T1-RRT) est créée qui exprime le virus de l'herpès simplex de gène de suicide tronqué thymidine kinase (HSV-ttk), Rluc, et RFP. Par administration de ganciclovir (GCV), les cellules exprimant hSV-ttk sont sélectivement ablated. Basé sur ces lignées cellulaires, un modèle tumoral-portant dans les souris de Vegfr2-Fluc-KI est construit qui sert de modèle expérimental reliant la progression de tumeur et l'angiogenèse de tumeur in vivo.

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Protocol

Les expériences doivent être conformes aux réglementations nationales et institutionnelles concernant l'utilisation des animaux à des fins de recherche. Les autorisations pour réaliser des expériences doivent être obtenues. Le traitement des animaux et les procédures expérimentales de l'étude adhèrent aux lignes directrices du Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université de Nankai qui sont conformes aux Lignes directrices pour les soins aux animaux approuvées par les National Institutes of Health (NIH).

1. LV-Rluc-RFP (RR) et LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) emballage et production lentivirale

REMARQUE : Le pLV-RR porte les séquences génétiques de renilla luciferase (Rluc) et de protéine fluorescente rouge (RFP) sous le promoteur EF1MD, tandis que le pLV-RRT porte les séquences génétiques codant Rluc, RFP, et le virus de l'herpès simplex tronqué thymidine kinase (HSV-ttk) ( Figure 2).

  1. Seed 1 x 106 de 293T cellules par puits dans une plaque de 6 puits et la culture pendant la nuit dans un incubateur humidifié avec 5% CO2 à 37 oC avec le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
  2. Préparer la suspension liposome : mélanger 7,5 ll de liposome et 0,25 ml de milieu essentiel minimal (MEM) dans un tube de 1,5 ml après l'incubation pendant 5 min à température ambiante (RT) pour disperser les liposomes également.
  3. Préparer la solution DesNAs (DNAs-RR) : séparément, ajouter le vecteur pLV-RR et les plasmides d'aide à 0,25 ml de MEM dans un tube de 1,5 ml tel que décrit dans le tableau 1.
  4. Obtenir le composé liposome/DNAs-RR : ajoutez doucement la solution DNAs-RR dans la suspension liposome préparée goutte à goutte et incubez pendant 20 min à RT ainsi les liaisons d'ADN à la membrane lipidique.
  5. Remplacer le milieu des cellules 293T par 1 ml de DMEM contenant 10% de FBS et ajouter le composé liposome/DNAs-RR au milieu des cellules 293T doucement.
  6. Après avoir couve dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 oC pendant 12 à 16 h, remplacez le composé liposome/DNAs-RR contenant le milieu des cellules 293T par 1 mL de DMEM contenant 10 % de FBS et 100 u/mL de pénicilline-streptomycine.
  7. Continuer à cultiver les cellules 293T dans l'incubateur humidifié pendant 48 h après la transfection. Ensuite, recueillir le supernatant des cellules 293T et centrifuger le milieu à 300 x g pendant 5 min pour granuler les cellules 293T. Transférer le supernatant contenant du lentivirus-RR (LV-RR) dans des tubes de stockage stériles de 1,5 ml de polypropylène et entreposer à -80 oC.
    REMARQUE : Une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) est nécessaire pour travailler avec le lentivirus recombinant.
  8. Répétez les étapes 1.1-1.7 et utilisez le vecteur pLV-RRT au lieu du vecteur pLV-RR à l'étape 1.3 pour obtenir le lentivirus-RRT (LV-RRT). Entreposer le LV-RRT à -80 oC.
    REMARQUE : Le stock lentiviral non purifié peut inhiber la croissance cellulaire dans certains cas. Le stock lentiviral peut avoir besoin d'être purifié. Les stocks de lentiviraux contenant des particules LV-RR ou LV-RRT doivent être divisés en tubes de 1,5 ml (1 ml par tube) pour le stockage afin d'éviter de multiples cycles de dégel libre.

2. Transduction lentivirale LV-RR et LV-RRT pour l'expression génique dans les cellules 4T1

  1. Seed 4T1 cellules dans une plaque de 6 puits (5 x 105 cellules / puits) et la culture avec Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 milieu contenant 10% FBS nuit dans un incubateur humidifié avec 5% CO2 à 37 oC.
  2. Retirez le milieu de la plaque de culture et remplacez-le par un RPMI 1640 moyen frais de 1 ml ainsi que 1 ml de bouillon lentiviral (LV-RR ou LV-RRT) à chaque puits. Ajouter 8 polybrenes g/mL et mélanger délicatement le milieu contenant des particules lentivirales en faisant monter et descendre.
    REMARQUE : Sachez que le milieu contient des particules lentivirales, qui pourraient transduire les cellules humaines.
  3. Solution de transduction de spin dans une centrifugeuse à 1 000 g pour 60 min à RT pour aider à augmenter l'efficacité de la transduction. Après centrifugation, la culture des cellules 4T1 pendant 4 à 12 h et la maintenance dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 oC.
    REMARQUE : Pour certaines lignées cellulaires, le polybrene peut être toxique pour la culture à long terme. Par conséquent, le temps d'incubation pour transduire différentes cellules peut être modifiable. Vérifiez l'état de la cellule plusieurs fois pour trouver le temps d'incubation approprié.
  4. Rafraîchissez le milieu des cellules 4T1 transducées avec 2 mL de rpMI 1640 milieu contenant 10% FBS et 100 U/mL pénicilline-streptomycine pour enlever les particules lentivirales et le polybrene.

3. Dépistage et identification des cellules 4T1 transduiseurs 4T1 par drogue

  1. Sélectionnez les cellules cédées avec le moyen contenant le blasticidin (BSD) selon le gène de résistance BSD porté par LV-RR ou LV-RRT comme étapes suivantes décrites.
    REMARQUE : Alternativement, les cellules transductées qui sont RFP-positives pourraient être choisies par cytométrie de flux selon le gène de RP porté par LV-RR ou LV-RRT.
  2. 48 h après transduction, passage des cellules 4T1 au rapport de 1:3 à 1:4 avec le milieu de sélection (RPMI 1640 milieu contenant 10% FBS, 100 U/mL pénicilline-streptomycine, et 5 'g/mL BSD). Changer de moyen tous les 2 ou 3 jours.
    REMARQUE : La concentration optimale de BSD peut varier d'une lignée cellulaire à l'autre. Par conséquent, une expérience pilote de la courbe de mise à mort devrait être effectuée pour déterminer la concentration optimale de BSD avant l'expérience initiale.
  3. 7 jours de dépistage post-drogue, observez les cellules 4T1 transducées LV-RR (4T1-RR) et les cellules 4T1 transduisantes lvà-RRT (4T1-RRT) sous le microscope à contraste de phase inversé de fluorescence. Comptez le nombre de cellules DeP 4T1 et de toutes les cellules 4T1 dans trois champs de vision pour estimer le rapport RFP-positif, respectivement (figure 2).
    REMARQUE : Alternativement, le rapport RP-positif des cellules 4T1 transducées pourrait être identifié par cytométrie d'écoulement.
  4. Mesurer les signaux renilla des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT en utilisant un système d'imagerie vivante pour détecter la relation linéaire entre les nombres cellulaires et les signaux de renilla (figure 3).
  5. Élargir les cellules 4T1-RR et 4T1-RRT d'alendur le BSD avec un milieu de sélection à des rapports fractionnés entre 1:3 et 1:4 et entreposez les stocks de lignée cellulaire dans de l'azote liquide.

4. Souris Vegfr2-Fluc-KI et modèle de souris tumeur-portant

REMARQUE : Les souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI, âgées de 6 à 8 semaines et femelles, sont utilisées dans cette expérience pour surveiller l'angiogenèse in vivo non invasive par BLI.

  1. Culture 4T1-RR cellules et 4T1-RRT cellules dans des plats Petri 60 mm dans un incubateur humidifié avec 5% co2 à 37 oC, respectivement. Lorsque les cellules sont à 80% de confluence, retirer le milieu et rincer avec du phosphate tamponné saline (PBS).
  2. Retirez le PBS et ajoutez 2 ml supplémentaires de 0,25 % trypsine-0,53 mM edTA solution respectivement. Conserver le plat à RT (ou à 37 oC) jusqu'à ce que les cellules se détachent.
  3. Ajouter 5 à 10 ml de milieu frais contenant 10 % de FBS, puis aspirer et distribuer des cellules pour resuspendre les cellules 4T1-RR et 4T1-RRT dans des tubes centrifugeurs de 15 ml, respectivement. Comptez deux types de cellules 4T1 à l'aide d'une chambre de comptage et préparez les suspensions cellulaires à une concentration de 1 x 106 pour 100 L dans le milieu RPMI 1640.
  4. Anesthésiez les souris Vegfr2-Fluc-KI avec 1% à 3% d'isoflurane en oxygène à 100% à la chambre d'induction d'anesthésie avec un débit de 1 L/min. Surveillez la réponse de pincement des orteils de la souris pour confirmer l'état de l'anesthésie. Ensuite, appliquez l'onudation ophtalmique sur les yeux de la souris pour prévenir la déshydratation.
  5. Retirer la souris de la chambre et la placer dans le cône de nez. Enlevez entièrement les cheveux de l'épaule de la souris en utilisant le shaver électrique et la crème d'épilation, qui pourrait fournir une bonne vue du champ chirurgical et éviter de bloquer les signaux BLI dans les expériences de suivi.
  6. Injecter sous-cutanée les cellules 4T1-RR (1 x 106 cellules à un volume total de 100 l) et les cellules 4T1-RRT (1 x 106 cellules à un volume total de 100 l) dans les épaules gauches et droites de chaque souris, respectivement (enregistrement comme jour 0). Placez les souris dans la zone de récupération avec un support thermique jusqu'à ce qu'elles soient complètement récupérées.
  7. Après l'implantation des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT, touchez les masses tumorales pour vérifier que les souris portent une tumeur tous les jours (Figure S1). Au jour 7 post-implantation, l'intrapéritoronnel injecte 50 mg/kg de ganciclovir (GCV) aux souris porteuses de tumeurs deux fois par jour jusqu'à la fin de l'expérience.
    REMARQUE : Avant cette expérience, le cytotoxique de GCV sur les cellules 4T1-RRT doit être détecté. L'efficacité de mise à mort de GCV pourrait être évaluée par l'évaluation de comptage cellulaire avec une concentration différente de GCV (Figure S2).
  8. Le jour 0, 3, 7, 14 et 21 après l'implantation 4T1, surveillez la croissance tumorale et l'angiogenèse des souris porteuses de tumeurs et évaluez par l'imagerie de Rluc et de Fluc (figure4).

5. Imagerie double bioluminescence de la tumeur (Rluc) et de l'angiogenèse (Fluc)

  1. Ouvrez le système d'imagerie vivante, initialisez le logiciel d'imagerie vivante, puis initialisez le système.
    REMARQUE : L'initialisation du système prendra quelques minutes pour refroidir la caméra couplée à la charge (CCD) à -90 oC avant de pouvoir commencer l'imagerie. La température deviendra verte lorsque la caméra CCD sera refroidie.
  2. Utilisez les paramètres de la caméra suivants :
    Vérifiez la Luminescence et la Photographie.
    Vérifiez la pose.
    Paramètres de luminescence:
    Temps d'exposition définit AUTO dans des conditions normales.
    Binning ensembles 8.
    F/Stop s'installe à 1.
    Filtre d'émission ouvre.
    Paramètres de la photographie:
    Binning ensembles à moyen.
    F/Stop s'installe 8.
    Paramètres du système IVIS :
    Champ de vision : vue de souris C-1, vue de souris D-5.
    La hauteur du sujet fixe 1,5 cm.
  3. Peser et enregistrer les souris et calculer le volume de coelenterazine (CTZ; 2,5 mg/kg) et De-luciferin (150 mg/kg) nécessaire.
  4. Anesthésiez la souris tumorale de 1% à 3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à la chambre d'induction d'anesthésie avec un débit de 1 L/min. Surveillez la réponse de pincement d'orteil de la souris pour confirmer l'état de l'anesthésie. Ensuite, distribuez une goutte d'onduleur lubrifiant sur les deux yeux pour éviter les dommages cornéens.
  5. Injecter 2,5 mg de CTZ (3,33 mg/mL) par kilogramme de poids corporel dans le rétrobulbar de la souris (p. ex., pour une souris de 20 g, injecter 15 oL pour délivrer 50 g de CTZ) à l'aide d'une aiguille à seringue sinistique.
  6. Déplacez la souris porteuse de tumeurs dans la chambre de la caméra avec son nez dans le cône d'anesthésie doucement et acquérir plusieurs photos de la souris dorsal immédiatement pour obtenir les signaux Rluc de cellules 4T1 jusqu'à ce que les signaux BLI s'estompent.
    REMARQUE: La demi-vie de CTZ est très courte et les signaux de Rluc chutent précipitamment de 30 s. Pour s'assurer que tout signal résiduel de Rluc s'est dissipé et que l'intervalle entre l'imagerie Rluc et Fluc devrait être supérieur à 10 min.
  7. Injecter par voie intrapéritone 150 mg/kg de D-luciferin (30 mg/mL) à l'aide d'une aiguille à seringues à insuline (p. ex., pour une souris de 20 g, injectez 100 l pour délivrer 3 mg de D-luciferin). Gardez la souris à RT pendant 10 minutes avant l'imagerie Fluc.
  8. Déplacez cette souris dans la chambre de caméra avec son nez dans le cône d'anesthésie à nouveau et acquérir plusieurs photos de la souris dorsal pour obtenir les signaux Fluc de l'angiogenèse.
    REMARQUE : Le moniteur cinétique Fluc doit être effectué pour chaque souris jusqu'à ce que les signaux atteignent le maximum, puis s'estompent.
  9. Répétez les étapes des procédures 5.4-5.8 pour chaque souris.
  10. Après l'imagerie, maintenir les souris dans un environnement chaud jusqu'à ce que les animaux se réveillent.
  11. Au moment désiré (jour 3, 7, 14 et 21), répétez au-dessus des procédures (étape 5.3-5.10) pour détecter la progression de tumeur et l'angiogenèse de tumeur au fil du temps.
  12. Analyser les données de signaux De Rluc et Fluc pour étudier la relation entre la croissance tumorale et l'angiogenèse dans la progression de tumeur.
    REMARQUE : Les régions d'intérêt (ROI) qui couvrent le site de signal BLI sont utilisées pour analyser les données. Mesurer l'éclat total (Photons) du retour sur investissement dans l'unité de Photons/secondes/cm2/steradian (p/s/cm 2/sr) pour chaque point de temps.
  13. Analyser les signaux Rluc et Fluc du retour sur investissement à l'aide d'un logiciel graphique (Figure 4).

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Representative Results

Dans cette expérience, un modèle de souris de cancer du sein a été établi utilisant des cellules 4T1 pour étudier la relation entre la croissance de tumeur et l'angiogenèse de tumeur (figure 1). Tout d'abord, deux lentivirus ont été emballés, qui portaient des séquences génétiques exprimant Rluc/RFP (LV-RR) et Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT), respectivement, comme indiqué précédemment7. Ensuite, deux lignées cellulaires 4T1 différentes, nommées 4T1-RR et 4T1-RRT, ont été créées en transduisant respectivement LV-RR et LV-RRT. Après le criblage de drogue pendant 3 jours, le 4T1-RR et le 4T1-RRT ont été observés sous un microscope de fluorescence pour détecter l'efficacité de transduction. Comme le montre l'imagerie par fluorescence, plus de 99 % des cellules 4T1-RR ou 4T1-RRT étaient positives à la DP, ce qui suggère que les lignées cellulaires 4T1-RR et 4T1-RRT ont été établies par la transduction LV-RR et LV-RRT (figure2A,B). Pendant ce temps, il n'y avait aucune différence trouvée dans la morphologie cellulaire et la croissance entre le type sauvage 4T1 et 4T1-RR ou 4T1-RRT pendant le temps de culture. En résumé, nous avons construit avec succès des lignées cellulaires 4T1-RR et 4T1-RRT sans influencer les états cellulaires. Par la suite, la formation image de bioluminescence (BLI) des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT a été capturée pour détecter les signaux de Rluc. Les images BLI ont révélé que les cellules 4T1-RR et 4T1-RRT émettaient des signaux bioluminescents forts de la même force (Figure 3A). En outre, les relations linéaires entre les signaux Rluc et les nombres cellulaires ont été observées à la fois dans les cellules 4T1-RR (R2 - 0,9989), ce qui suggère que les signaux Rluc pourraient être utilisés pour refléter la croissance tumorale in vivo (figure3B ).

Sur cette base, en utilisant les souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI, un modèle de souris tumeur-portant a été établi pour étudier l'angiogenèse pendant que le cancer du sein se développe. À la suite de frapper la séquence de Fluc dans le premier exon de la séquence de Vegfr2 dans la murine, le Fluc a été exprimé (qui apparaît comme des signaux bioluminescents) d'une manière identique à l'angiogenèse chez les souris pendant la progression de tumeur. Après l'injection sous-cutanée de cellules 4T1-RR et 4T1-RRT, la croissance cellulaire a été surveillée par des signaux Rluc en présence de CTZ aux jours 0, 3, 7, 14 et 21 (figure 4A). Dans le même temps, l'angiogenèse induite par la croissance de tumeur a été évaluée par des signaux de Fluc en présence de D-luciferin dans la même souris. Au jour 7 post-implantation de 4T1-RR et 4T1-RRT, GCV a été administré aux souris tumeur-portantes, qui a mené les cellules 4T1-RRT à mourir. Les images BLI ont révélé que les signaux Rluc des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT ont augmenté au même rythme avant le traitement de GCV ; cependant, les signaux de Rluc des cellules 4T1-RRT ont fortement diminué le traitement de poteau de GCV. tandis que les signaux Rluc de 4T1-RR ont encore augmenté doucement. De toute évidence, une relativité significative existait entre les signaux Rluc et la taille de la tumeur (Figure S1).

Pendant ce temps, selon les images Fluc, les signaux Fluc augmenté en fonction de la hausse Rluc et a diminué à la suite de la baisse Rluc (Figure 4B). Ces résultats suggèrent qu'il y avait une corrélation directe entre l'angiogenèse de tumeur et la croissance de tumeur. La mort des cellules tumorales induites par le médicament GCV peut conduire à l'inhibition de l'angiogenèse tumorale (Figure 4C). Pour démontrer que le signal de Fluc détectait en effet l'angiogenèse dans les tumeurs, les animaux ont été sacrifiés après avoir terminé l'imagerie au jour 21 pour obtenir des preuves histologiques de la vascularisation. Selon les images de l'immunostaining anti-VEGFR2, les structures microvasculaires dans le tissu tumoral 4T1-RR étaient significativement plus évidentes que dans le tissu tumoral 4T1-RRT, qui étaient compatibles avec les signaux fluc (figure 5). En résumé, cette stratégie de formation image de bioluminescence double peut être employée pour surveiller la progression et l'angiogenèse de tumeur aussi bien évaluer des effets antitutumateux de différents drogues sur la croissance de tumeur et l'angiogenèse dans le microenvironnement de tumeur.

Figure 1
Figure 1 : Carte schématique de la double imagerie de bioluminescence de la croissance et de l'angiogenèse de tumeur. Les cellules 4T1 transduisées par LV-RR et LV-RRT ont été implantées chez des souris transgéniques Vegfr2-Fluc-KI. Pendant la croissance de tumeur, BLI de Rluc et de Fluc ont été simultanément exécutés dans une souris simple pour refléter la croissance de tumeur et le statut d'angiogenèse, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Efficacité de la transduction des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT identifiées par imagerie par fluorescence. (A) Le dessin schématique de pLV-RR a montré que les séquences Rluc et RFP ont été exprimées sous le promoteur EF1. Les images lumineuses et fluorescentes d'un champ de vision ont révélé que les cellules 4T1-RR étaient RFP-positives. (B) Le dessin de diagramme de pLV-RRT a montré que le promoteur unique EF1 a activé les gènes Rluc, RFP et HSV-ttk. Les images lumineuses et fluorescentes d'un champ de vision ont révélé que les cellules 4T1-RRT étaient positives à la DP. Barre d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Imagerie par bioluminescence des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT transdulées. (A) Imagerie par bioluminescence des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT en présence de CTZ. (B) Les signaux Rluc mesurés des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT ont maintenu une relation linéaire avec des nombres de cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Visualisation des processus dynamiques de croissance tumorale et d'angiogenèse chez un animal vivant. (A) Diagramme de flux de l'expérience et double détection BLI de Rluc et Fluc. (B) Images représentatives de Rluc de la progression de tumeur et des images fluc de l'angiogenèse pendant le développement de tumeur dans une souris transgénique. (C) La mesure des signaux de Rluc a démontré que les cellules de tumeur implantées ont augmenté rapidement, alors que les cellules 4T1-RRT ont été sensiblement régressées après administration de GCV. (D) La quantification des signaux fluoc s'est produite que l'angiogenèse s'est produite après l'implantation de cellules de tumeur, suivant une tendance parallèle avec la croissance et la mort de tumeur induites par GCV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : immunostaining VEGFR2 des tissus 4T1-RR et 4T1-RRT au jour 21. Images représentatives des sections de tissus de tumeur souillées pour VEGFR2 (vert) au jour 21. Les noyaux ont été contrecarrés avec DAPI (bleu). Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure S1 : Courbe de la taille de tumeur pendant la progression de tumeur in vivo. La taille de tumeur des cellules 4T1-RR et 4T1-RRT a augmenté après l'implantation, mais la taille de tumeur des cellules 4T1-RRT a commencé à diminuer le traitement post-GCV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S2 : Effet cytotoxique du VMC sur les cellules 4T1-RRT. Les cellules 4T1-RRT sont mortes avec la concentration élevée de GCV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S3 : Image BLI des cellules 4T1-RR dans le poumon. Après l'injection de veine de queue des cellules 4T1-RR, le signal de Rluc des cellules a été détecté par BLI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Conditions d'emballage LV-RR et LV-RRT
Composants MeM moyen Système 3-plasmides Système 4 plasmides
pLV-RR/pLV-RRT vecteurA 0,25 ml 1,5 g 1,5 g
Gag-Pol - Rev expression vectorB  1,0 g
Vecteur d'expression Gag-PolC 0,75 g
Rev expression vectorD 0,3 g
Vecteur d'expression VSV-GE 0,5 g 0,45 g
Liposome 0,25 ml 7,5 l 7,5 l

Tableau 1: Conditions de transfection du système d'emballage lentiviral pour la production de stocks viraux LV-RR et LV-RRT dans des cellules 293T. (A) Le vecteur pLV-cDNA était pLV-RR et pLV-RRT, respectivement. (B) Le vecteur d'expression Gag-Pol et Rev peut être soit pCMV-deltaR8.91 (TRC) ou psPAX2 (Addgene). (C) Le vecteur d'expression Gag-Pol peut sélectionner n'importe lequel des pMDLg/pRRE (Addgene), pLP1 (Invitrogen) et pPACKH1-GAG (SBI). (D) Le vecteur d'expression Rev doit être pRSV-REV (Addgene), pLP2 (Invitrogen), ou pPACKH1-REV (SBI). (E) Le vecteur d'expression VSV-G peut sélectionner pMD.G (TRC), pMD2.G (Addgene), pCMV-VSV-G (Addgene), pVSV-G (SBI), ou pLP/VSVG (Invitrogen). Dans ce protocole, le système à trois plasmides a été utilisé, y compris psPAX2, pMD2.G, et pLV-RR ou pLV-RRT.

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Discussion

Dans ce protocole, une approche double BLI non-invasive est décrite pour surveiller le développement de tumeur et l'angiogenèse. Le système de journaliste BLI est d'abord développé, contenant le gène de suicide DeSV-ttk/GCV pour suivre la progression et la régression de tumeur in vivo par l'imagerie de Rluc. Pendant ce temps, l'angiogenèse tumorale est évaluée à l'aide de souris Vegfr2-Fluc-KI via l'imagerie Fluc. Ce modèle de souris tumeur-portant est capable de fournir une plate-forme pratique pour le développement continu et non-invasif de tumeur de suivi et l'angiogenèse de tumeur par BLI double dans une souris simple avec la pertinence élevée, la reproductibilité, et la traduisibilité.

L'angiogenèse concerne la progression àlong terme de tumeur et est ainsi d'une importance élevée 1. Il est nécessaire d'étudier la relation entre la progression tumorale et l'angiogenèse. Un nombre croissant de stratégies anti-angiogenèse ont été étudiées pour le traitement du cancer, qui s'appuient sur des approches de moniteur visualisées pour évaluer avec précision les résultats du traitement. En outre, la néovascularisation du tissu tumoral après la radiothérapie et la chimiothérapie traditionnelles est un autre domaine populaire de la recherche en oncologie12,13,14. Ces études nécessitent un modèle animal qui permet de surveiller la croissance tumorale et l'angiogenèse en temps réel. Les changements pathologiques des tissus tumoraux dans les modèles animaux traditionnels dépendent généralement de l'examen histopathologique, qui nécessite des sacrifices animaux. Ces modèles de souris BLI double aider à résoudre les problèmes de plus grandes gammes d'erreurs et des coûts plus élevés du sacrifice des animaux.

Dans ce modèle de souris BLI double, l'étape la plus critique est d'utiliser deux types de luciferases, y compris Fluc et Rluc, pour tracer respectivement les cellules et l'angiogenèse en même temps. La spécificité du substrat de ces deux luciferases permet d'effectuer deux types de BLI dans un seul hôte. En outre, la demi-vie de la coelenterazine (le substrat de Rluc) est très courte, ce qui entraîne la décoloration rapide des signaux Rluc sans influencer la prochaine détection de signal Fluc15. Par conséquent, dans le processus d'exploitation, l'imagerie Rluc devrait être mis en œuvre avant l'imagerie Fluc en raison de la demi-vie plus longue de D-luciferin (le substrat de Fluc). En outre, déterminer le temps d'incubation des substrats est la clé pour acquérir des images BLI parfaites. Le métabolisme des substrats peut modifier la concentration des substrats in vivo, ce qui entraîne une variation de l'intensité du signal BLI.

En ce qui concerne les progrès technologiques, d'autres modalités d'imagerie pour le suivi in vivo de certains événements cellulaires et subcellulaires ont été appliquées dans des recherches précliniques et cliniques, telles que l'imagerie fluorescente, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et le positron. tomographie par émission (PET)16,17. Par rapport à ces stratégies d'imagerie, l'imagerie par bioluminescence a une sensibilité élevée, une forte spécificité et une mesure précise, ce qui montre sa supériorité unique dans le domaine des études d'imagerie vivante15. L'imagerie Rluc utilisée permet de visualiser dynamiquement la croissance tumorale et les effets antitumorals du système prodrug HSV-ttk/GCV chez un animal vivant. À l'exception de la surveillance des tissus sous-cutanés, Rluc a été utilisé pour tracer des cellules dans les poumons par la technologie BLI dans d'autres recherches. Après l'injection de veine de queue de 4T1-RR dans une souris, nous avons déplacé cette souris dans le système d'imagerie vivante pour détecter les signaux DeLuc après administration de CTZ. L'image du signal DeLuc a montré que les cellules injectées étaient principalement situées dans le poumon (figure S3). Comme mentionné ci-dessus, le gène de rapport de Rluc peut tracer diverses cellules cancéreuses dans différents endroits, qui encourage l'utilisation complète de ce modèle de souris dans la recherche de biologie de cancer.

En plus de ces avantages, la technologie BLI peut être utilisée pour détecter les niveaux d'expression de molécules spécifiques. Auparavant, les gènes de reporter de fluorophores, qui sont exprimés sous les promoteurs pertinents, ont été employés pour mesurer le développement de navire dans les tumeurs sous-cutanées. Pendant la progression de tumeur, la structure vasculaire et les molécules peuvent être observées par les chambres chirurgicalement implantées de fenêtre chez les souris. Cependant, cette méthode a encore des limites, y compris l'invasion inévitable, l'étanchéité de fluorophore, et le bruit fort de fond. Le modèle de souris tumeur-portant établi dans la souris de Vegfr2-Fluc-KI crée une observation non-invasive du niveau d'expression de Vegfr2, qui est la molécule la plus importante dans l'angiogenèse de tumeur. Pendant ce temps, les images BLI affichent une grande spécificité sans bruit. Le modèle de souris de double BLI peut avoir des applications plus larges en étudiant les mécanismes moléculaires potentiels dans la progression et la régression de tumeur.

La technologie BLI, basée sur l'expression de Rluc (émission 480 nm) et fluc (émission 562 nm), a été adoptée dans un certain nombre de modèles de maladies in vivo. L'utilisation répandue de la technologie BLI in vivo a été limitée en raison de la faible sensibilité de la bioluminescence à des longueurs d'onde inférieures à 600 nm dans la détection des tissus profonds. Ceci est causé par l'absorption et la diffusion de la lumière, qui diminue le signal détectable jusqu'à dix fois par centimètre de tissu. Pour répondre à cette question, certains chercheurs ont concentré des études sur les variantes de Fluc qui émettent de la lumière au-dessus de 600 nm18. Parce que l'absorption et la diffusion de la lumière peuvent être remarquablement réduites en utilisant ces variantes de Fluc18,19, les applications de variantes de luciferase va étendre ce protocole à un plus grand domaine de recherche en oncologie.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été appuyée par le National Key R-D Program of China (2017YFA0103200), la National Natural Science Foundation of China (81671734) et les principaux projets du Programme de soutien scientifique et technologique de Tianjin (18YFZCSY00010), les fonds de recherche fondamentale pour les Universités centrales (63191155). Nous reconnaissons les révisions de Gloria Nance, qui ont été utiles pour améliorer la qualité de notre manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA Gibco 25200072
1.5 mL Tubes Axygen Scientific MCT-105-C-S
15 mL Tubes Corning Glass Works 601052-50
293T ATCC CRL-3216
4T1 ATCC CRL-2539
60 mm Dish Corning Glass Works 430166
6-well Plate Corning Glass Works 3516
Biosafety Cabinet Shanghai Lishen Scientific Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) Sigma-Aldrich 15205
Cell Counting Kit-8 MedChem Express HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator Thermo Fisher Scientific 4111
Coelenterazine (CTZ) NanoLight Technology 479474
D-luciferin Potassium Salt Caliper Life Sciences 119222
DMEM Medium Gibco C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) BIOIND 04-001-1A
Fluorescence Microscope Nikon Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV) Sigma-Aldrich Y0001129
Graphics Software GraphPad Software Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles Becton Dickinson 328421
Isoflurane Baxter 691477H
Lentiviral Packaging System Biosettia cDNA-pLV03
Liposome Invitrogen 11668019
Living Imaging Software Caliper Life Sciences Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Lumina II
MEM Medium Invitrogen 31985-070
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Glass Works R21031399
Polybrene Sigma-Aldrich H9268-1G
RPMI1640 Medium Gibco C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge Thermo Fisher Scientific Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator Haier DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System XENOGEN Corporation 7293

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References

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