Dual bioluminescens billeddannelse af tumor progression og Angiogenesis

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver etableringen af en tumor-bærende musemodel til at overvåge tumorprogression og angiogenese i realtid ved Dual bioluminescens Imaging.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, K., Wang, C., Wang, R., Chen, S., Li, Z. Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (150), e59763, doi:10.3791/59763 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenesis, som en afgørende proces af tumorprogression, er blevet en forskning hotspot og mål for anti-tumor terapi. Men, der er ingen pålidelig model til sporing af tumorprogression og angiogenese samtidig på en visuel og følsom måde. Bioluminescens Imaging viser sin unikke overlegenhed i levende billeddannelse på grund af sine fordele ved høj følsomhed, stærk specificitet og nøjagtig måling. Præsenteret her er en protokol til at etablere en tumor-bærende musemodel ved at injicere en renilla der-mærket murine brystkræft cellelinje 4t1 ind i den Transgene mus med angiogenesis-induceret Firefly der udtryk. Denne musemodel giver et værdifuldt værktøj til samtidig at overvåge tumorprogression og angiogenese i realtid ved Dual bioluminescens Imaging i en enkelt mus. Denne model kan være almindeligt anvendt i anti-tumor Drug screening og onkologiske forskning.

Introduction

Angiogenese er en vigtig proces i progression af kræft fra små, lokaliserede neoplasmer til større, potentielt metastaserende tumorer1,2. Sammenhængen mellem tumorvækst og angiogenese bliver et af de punkter af vægt på området onkologiske forskning. Men, traditionelle metoder til måling morfologiske ændringer undlader at overvåge tumorprogression og angiogenese samtidig i levende dyr ved hjælp af en visualiseret tilgang.

Bioluminescens Imaging (bli) af tumorceller er en særlig hensigtsmæssig Eksperimentel metode til at overvåge tumorvækst på grund af dens ikke-invasivitet, følsomhed, og specificitet3,4,5,6 . BLI-teknologien er baseret på princippet om, at der kan katalysere oxidation af et specifikt substrat, mens det udsender bioluminescens. Der udtrykt i implanterede tumorceller reagerer med det injicerede substrat, som kan påvises ved en levende billeddannelse system, og signaler indirekte afspejler ændringerne i celle nummer eller celle lokalisering i vivo6,7.

Bortset fra tumorvækst, tumor angiogenese (det kritiske trin i kræft progression) kan også visualiseres gennem bli-teknologi ved hjælp af Vegfr2-fluc-ki Transgene mus8,9,10. Den vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) receptor 2 (Vegfr2), en type VEGF-receptor, er for det meste udtrykt i de vaskulære endotelceller af voksne mus11. I Vegfr2-fluc-ki Transgene mus, er DNA-sekvensen af Firefly der (fluc) slået ind i den første exon af den endogene Vegfr2 sekvens. Som følge heraf udtrykkes fluc (som optræder som bli-signaler) på en måde, der er identisk med niveauet af angiogenese i mus. At vokse ud over et par millimeter i størrelse, tumoren rekruttorer nye vasculatures fra eksisterende blodkar, som stærkt udtrykker Vegfr2 udløst af vækstfaktorer fra tumorceller1. Dette åbner mulighed for at bruge Vegfr2-fluc-ki Transgene mus til ikke-invasivt overvåge tumor angiogenese af bli.

I denne protokol, en tumor-bærende musemodel er etableret for at overvåge tumorprogression og angiogenese i en enkelt mus gennem Firefly der (fluc) og renilla der (rluc) Imaging, henholdsvis (figur 1). En 4T1 cellelinje (4T1-RR) er skabt, der stabilt udtrykker Rluc og rødt fluorescerende protein (RFP) til at spore cellevækst ved Rluc Imaging. For yderligere at undersøge de dynamiske ændringer af angiogenese i progression og regression af tumoren, er en anden 4T1 cellelinje (4T1-RRT) skabt, der udtrykker selvmords genet herpes simplex virus trunkeret thymidinkinase (HSV-TTK), Rluc, og RFP. Ved administration af ganciclovir (GCV) er HSV-TTK-ekspor tcellerne selektivt. Baseret på disse cellelinjer, en tumor-bærende model i Vegfr2-fluc-ki mus er bygget, der fungerer som en eksperimentel model bridging tumorprogression og tumor angiogenese in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøgene skal være i overensstemmelse med nationale og institutionelle bestemmelser om anvendelse af dyr til forskningsformål. Der skal indhentes tilladelser til at udføre eksperimenter. Behandlingen af dyr og eksperimentelle procedurer i undersøgelsen overholde Nankai University Animal Care og brug Komité retningslinjer, der er i overensstemmelse med de retningslinjer for dyrepleje godkendt af National Institutes of Health (NIH).

1. LV-Rluc-RFP (RR) og LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral emballage og produktion

Bemærk: PLV-RR bærer gensekvenserne af renilla der (rluc) og rødt fluorescerende protein (RFP) under arrangøren EF1α, mens PLV-RRT bærer gensekvenserne, der koder rluc, RFP og herpes simplex virus trunkeret thymidinkinase (HSV-TTK) ( Figur 2).

  1. Frø 1 x 106 af 293T celler pr brønd ind i en 6 brønd plade og Kulturnatten over i en befuret inkubator med 5% Co2 ved 37 °C med dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% FØTAL kvægserum (FBS).
  2. Forbered liposomsuspensionen: Bland 7,5 μl Liposom og 0,25 ml minimal essentiel medium (MEM) i et 1,5 ml rør efter inkubation i 5 min ved stuetemperatur (RT) for at sprede Liposomer ligeligt.
  3. Forbered DNAs-opløsningen (DNAs-RR): Tilsæt separat pLV-RR-vektoren og hjælpe plasmiderne til 0,25 mL af MEM i et 1,5 mL-rør som beskrevet i tabel 1.
  4. Få Liposom/DNAS-RR-forbindelsen: Tilsæt forsigtigt DNAS-RR-opløsningen til forberedt Liposom suspension dråbe ved dråbe og Inkuber i 20 minutter ved rt, så DNA-obligationerne til lipid-membranen.
  5. Udskift mediet med de 293T celler med 1 mL DMEM, der indeholder 10% FBS, og tilsæt liposome/DNAs-RR-forbindelsen til mediet for de 293T celler forsigtigt.
  6. Efter inkubering i en befuret inkubator med 5% CO2 ved 37 °c i 12 – 16 timer, Udskift liposome/DNAS-RR-forbindelsen indeholdende medium for de 293T celler med 1 ml DMEM indeholdende 10% FBS og 100 U/ml penicillin − streptomycin.
  7. Fortsæt med at culturere de 293T celler i den befugdede inkubator for 48 h efter transfection. Derefter opsamles supernatanten af de 293T celler og centrifugeres mediet ved 300 x g i 5 minutter for at pille de 293t celler. Den lentivirus-RR (LV-RR)-holdige supernatanten overføres til 1,5 mL sterile opbevarings slanger af polypropylen og opbevares ved-80 °C.
    Bemærk: en biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) facilitet er nødvendig for at arbejde med rekombinant lentivirus.
  8. Gentag trin 1.1 – 1.7, og brug pLV-RRT-vektoren i stedet for pLV-RR-vektor i trin 1,3 til at hente lentivirus-RRT (LV-RRT). Opbevar LV-RRT ved-80 °C.
    Bemærk: den ikke-rensede lentiviral bestand kan hæmme cellevækst i nogle tilfælde. Det kan være nødvendigt at rengøre lentiviral bestanden. De lentivirale bestande, der indeholder LV-RR-eller LV-RRT-partikler, bør opdeles i 1,5 mL-rør (1 mL pr. rør) til opbevaring for at undgå flere frie tø-cyklusser.

2. LV-RR og LV-RRT lentiviral transduktion for genekspression i 4T1-celler

  1. Frø 4T1 celler i en 6-brønd plade (5 x 105 celler/brønd) og kultur med Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium indeholdende 10% FBS natten over i en befuret inkubator med 5% Co2 ved 37 °c.
  2. Fjern mediet fra kultur pladen, og Udskift det med 1 mL frisk RPMI 1640 medium samt 1 mL lentiviral bestand (LV-RR eller LV-RRT) til hver brønd. Tilsæt 8 μg/mL polybrene og blend forsigtigt mediet indeholdende lentiviral partikler ved pipettering op og ned.
    Bemærk: Vær opmærksom på, at mediet indeholder lentiviral partikler, som kan Trans gøre humane celler.
  3. Spin transduktionsopløsning i en centrifuge ved 1.000 × g for 60 min ved rt for at øge transduktiviteten. Efter centrifugering, kultur 4T1 celler for 4 – 12 h og vedligeholde i en befuret inkubator med 5% CO2 ved 37 °c.
    Bemærk: for nogle cellelinjer kan polybrene være giftige for langsigtet kultur. Derfor kan inkubationstiden for transducere forskellige celler være udskiftelige. Kontroller celle status flere gange for at finde passende inkubationstid.
  4. Genopfrisk mediet af transducerede 4T1-celler med 2 mL RPMI 1640-medium indeholdende 10% FBS og 100 U/mL penicillin − streptomycin til at fjerne lentiviral partikler og polybrene.

3. lægemiddel screening og identifikation af LV-RR-og LV-RRT-transducerede 4T1-celler

  1. Vælg transducerede celler med medium indeholdende blasticidin (BSD) i henhold til BSD-Resistance genet båret af LV-RR eller LV-RRT som følgende trin beskrevet.
    Bemærk: Alternativt kan de transducerede celler, som er RFP-positive, udvælges ved flowcytometri i henhold til RFP-genet, der bæres af LV-RR eller LV-RRT.
  2. 48 h efter transduktion, passage 4T1 celler i forholdet 1:3 til 1:4 med selektions medium (RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS, 100 U/mL penicillin − streptomycin, og 5 μg/mL BSD). Skift medium hver 2 eller 3 dage.
    Bemærk: den optimale BSD-koncentration kan variere fra cellelinje til cellelinje. Derfor skal der udføres et piloteksperiment med Kill-kurve for at bestemme den optimale koncentration af BSD før det indledende eksperiment.
  3. 7 dage efter lægemiddel screening, overhold LV-RR-transducerede 4T1-celler (4T1-RR) og LV-RRT-transducerede 4T1-celler (4T1-RRT) under fluorescens inverterede fasekontrast-mikroskop. Tæl antallet af RFP+ 4t1-celler og alle 4T1-celler i tre synsfelter for henholdsvis at ESTIMERE RFP-positive ratio (figur 2).
    Bemærk: Alternativt kan det RFP-positive forhold mellem transducerede 4T1-celler identificeres ved flow cytometri.
  4. Mål renilla-signalerne fra 4T1-RR-celler og 4T1-RRT-celler ved hjælp af et levende billedbehandlingssystem til påvisning af det lineære forhold mellem cellenumre og renilla-signaler (figur 3).
  5. Udvid BSD-afskærmede 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler med markerings medium ved split ratio mellem 1:3 og 1:4, og opbevar cellelinje lagrene i flydende nitrogen.

4. Vegfr2-Fluc-KI mus og tumor-bærende musemodel

Bemærk: de transgene Vegfr2-fluc-ki-mus, 6-8 uger gamle og kvindelige, anvendes i dette eksperiment til ikke-invasivt Monitor angiogenese in vivo af bli.

  1. Kultur 4T1-RR-celler og 4T1-RRT-celler i 60 mm Petri skåle i en befuret inkubator med henholdsvis 5% CO2 ved 37 °c. Når cellerne er på 80% sammenløbet, Fjern mediet og skyl med fosfat bufferet saltvand (PBS).
  2. Fjern PBS og tilsæt yderligere 2 mL 0,25% trypsin-0,53 mM EDTA opløsning. Opbevar skålen ved RT (eller ved 37 °C), indtil cellerne løsnes.
  3. Der tilsættes 5 – 10 mL frisk medium indeholdende 10% FBS, hvorefter cellerne udsugning og dispenserer for at resuspendere 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler i henholdsvis 15 mL centrifugeglas. Tæl to typer af 4T1-celler ved hjælp af et tælle kammer og Forbered celle suspensionerne i en koncentration på 1 x 106 pr. 100 ΜL i rpmi 1640 medium.
  4. Bedøm Vegfr2-Fluc-KI-musene med 1% – 3% isofluran i 100% ilt ved anæstesi induktions kammeret med en strømningshastighed på 1 L/min. Overvåg tåen knivspids respons af musen for at bekræfte status for anæstesi. Derefter, anvende oftalmologiske salve til øjnene af musen for at forhindre dehydrering.
  5. Fjern musen fra kammer og position i nosecone. Helt fjerne håret af skulderen af musen ved hjælp af elektrisk barbermaskine og hårfjerning creme, som kunne give en god udsigt over kirurgisk område og undgå at blokere BLI signaler i opfølgende eksperimenter.
  6. Subkutant injicere 4T1-RR celler (1 x 106 celler ved en 100 μl total volumen) og 4T1-RRT celler (1 x 106 celler ved en 100 μl total volumen) i venstre og højre skuldre af hver mus, henholdsvis (record som dag 0). Placer mus i Recovery område med termisk støtte indtil fuldt genvundet.
  7. Efter implantation af 4T1-RR og 4T1-RRT celler, røre tumor masserne for at kontrollere, at musene er tumor-bærende hver dag (figur S1). På dag 7 efter implantation injicerer intraperitonealt 50 mg/kg ganciclovir (GCV) til de tumor bærende mus to gange dagligt indtil afslutningen af forsøget.
    Bemærk: før dette eksperiment skal det cytotoksiske i GCV på 4T1-RRT-celler detekteres. GCV'S dræbende effektivitet kan evalueres ved celle optællings analyse med forskellig koncentration af GCV (figur S2).
  8. På dagen 0, 3, 7, 14 og 21 efter 4T1 implantation, overvåge tumorvækst og angiogenese af tumor-bærende mus og vurdere af både Rluc og Fluc Imaging (figur 4).

5. Dual bioluminescens billeddannelse af tumor (rluc) og angiogenese (fluc)

  1. Åbn Living Imaging-systemet, Initialiser den levende billedbehandlingssoftware, og Initialiser derefter systemet.
    Bemærk: systeminitialisering vil tage nogle minutter at køle ned den Charge-koblede Device (CCD) kamera til-90 °C før i stand til at starte Imaging. Temperaturen vil blive grøn, når CCD-kameraet afkøles.
  2. Brug følgende kameraindstillinger:
    Kontroller luminescens og fotografiet.
    Tjek overlay.
    Indstillinger for luminescens:
    Eksponeringstid indstiller AUTO under normale forhold.
    Binning sæt til 8.
    F/stop sæt til 1.
    Emissions filtersæt åben.
    Indstillinger for fotografi:
    Binning sæt til medium.
    F/stop indstiller til 8.
    IVIS-Systemindstillinger:
    Synsfelt: C = 1 mus visning, D = 5 mus visning.
    Motiv højde sæt 1,5 cm.
  3. Veje og registrere musene og beregne mængden af coelenterazin (CTZ; 2,5 mg/kg) og D-luciferin (150 mg/kg) nødvendig.
  4. Bedøvelsesmiddel tumor bærende mus med 1% – 3% isofluran i 100% ilt ved anæstesi induktions kammeret med en strømningshastighed på 1 L/min. Overvåg tåen knivspids respons af musen for at bekræfte status for anæstesi. Derefter dispenserer en dråbe smøre øjensalve på begge øjne for at undgå beskadigelse af cornea.
  5. Injicer 2,5 mg CTZ (3,33 mg/mL) pr. kg legemsvægt i retrobulbar af musen (f. eks. for en 20 g mus indsprøjtes 15 μL for at levere 50 μg CTZ) ved hjælp af en insulin sprøjte kanyle.
  6. Flyt den tumor bærende mus ind i kamera kammeret med sin næse i anæstesi keglen forsigtigt og erhverve flere billeder af musen dorsale straks at få Rluc signaler fra 4T1 celler, indtil BLI signaler fade væk.
    Bemærk: halveringstiden for CTZ er meget kort, og signalerne fra Rluc drop fremskyndet ~ 30 s. For at sikre, at resterende Rluc signal er forsvundet, og intervallet mellem Rluc og Fluc Imaging bør være mere end 10 min.
  7. Intraperitonealt injicerer 150 mg/kg D-luciferin (30 mg/mL) ved hjælp af en insulin sprøjte kanyle (f. eks. indsprøjtes 100 μL i en 20 g mus for at levere 3 mg D-luciferin). Hold musen på RT i 10 min før Fluc Imaging.
  8. Flyt denne mus ind i kamera kammeret med næsen i anæstesi keglen igen og erhverve flere billeder af musen dorsale at få Fluc signaler fra angiogenesis.
    Bemærk: den fluc kinetiske Monitor skal udføres for hver mus, indtil signalerne når det maksimale og derefter fade.
  9. Gentag procedurerne trin 5.4 – 5.8 for hver mus.
  10. Efter billeddannelse, vedligeholde musene i et varmt miljø, indtil dyrene vågner op.
  11. På det ønskede tidspunkt (dag 3, 7, 14 og 21) gentages ovenstående procedurer (trin 5.3 – 5.10) for at påvise tumorprogression og tumor angiogenese over tid.
  12. Analysere Rluc og Fluc signaler data til at undersøge forholdet mellem tumorvækst og angiogenese i tumorprogression.
    Bemærk: de regioner af interesse (ROI), der dækker BLI-signal-webstedet, bruges til at analysere dataene. Mål den totale Radiance (fotoner) af ROI i enheden af fotoner/sekunder/cm2/steradian (p/s/cm2/SR) for hvert tidspunkt.
  13. Analysér Rluc-og Fluc-signalerne fra ROI ved hjælp af grafik software (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette eksperiment, en brystkræft musemodel blev etableret ved hjælp af 4T1 celler til at undersøge forholdet mellem tumorvækst og tumor angiogenese (figur 1). For det første blev to lentivirus pakket, som førte gensekvenser, der udtrykker henholdsvis Rluc/RFP (LV-RR) og Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), som tidligere rapporteret7. Derefter blev to forskellige 4T1-cellelinjer, der hedder 4T1-RR og 4T1-RRT, oprettet ved at transducere henholdsvis LV-RR og LV-RRT. Efter lægemiddel screening i 3 dage blev 4T1-RR og 4T1-RRT observeret under et fluorescens mikroskop for at påvise transduktiviteten. Som påvist i fluorescens Imaging var mere end 99% af 4T1-RR-eller 4T1-RRT-cellerne RFP-positive, hvilket tydede på, at 4T1-RR-og 4T1-RRT-celle linjerne blev fastlagt af LV-RR og LV-RRT-transduktion (figur 2a, B). I mellemtiden var der ingen forskelle fundet i celle morfologi og vækst mellem Wild-type 4T1 og 4T1-RR eller 4T1-RRT i løbet af kulturtid. Sammenfattende, vi med succes bygget 4T1-RR og 4T1-RRT cellelinjer uden at påvirke de cellulære stater. Efterfølgende blev bioluminescens Imaging (BLI) af 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler taget til fange for at detektere Rluc-signalerne. BLI-billederne afslørede, at både 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler udsendte stærke bioluminescerende signaler af samme styrke (figur 3a). Udover, de lineære relationer mellem Rluc signaler og cellenumre blev observeret i både 4T1-RR (R2 = 0,9974) og 4T1-RRT celler (r2 = 0,9989), som foreslog rluc signaler kan bruges til at spejle tumorvækst in vivo (figur 3b ).

På dette grundlag, ved hjælp af transgene Vegfr2-Fluc-KI mus, en tumor-bærende musemodel blev etableret for at undersøge angiogenese som brystkræft vokser. Som et resultat af banke fluc sekvens i den første exon af Vegfr2 sekvens i murine, fluc blev udtrykt (der vises som bioluminescerende signaler) på en måde identisk med angiogenese i mus under tumorprogression. Efter subkutan injektion af 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler blev cellevækst overvåget af Rluc-signaler ved tilstedeværelse af CTZ på dag 0, 3, 7, 14 og 21 (figur 4a). På samme tid, angiogenese induceret af tumorvækst blev evalueret af fluc signaler i nærværelse af D-luciferin i samme mus. På dag 7 efter implantation af 4T1-RR og 4T1-RRT blev GCV administreret til de tumor bærende mus, hvilket førte 4T1-RRT-cellerne til at dø. BLI-billederne afslørede, at Rluc-signaler fra 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler steg med samme hastighed før GCV-behandling; Rluc-signaler fra 4T1-RRT-celler faldt imidlertid kraftigt efter GCV-behandling. mens Rluc signaler af 4T1-RR stadig steg forsigtigt. Naturligvis eksisterede en signifikant relativitetsteori mellem Rluc signaler og tumorstørrelse (figur S1).

I mellemtiden, ifølge de Fluc billeder, Fluc signaler steg i overensstemmelse med Rluc stigning og faldt efter Rluc tilbagegang (figur 4b). Disse resultater tyder på, at der var en direkte sammenhæng mellem tumor angiogenese og tumorvækst. Død af tumorceller induceret af Drug GCV kan føre til hæmning af tumor angiogenese (figur 4c). For at påvise, at Fluc-signalet faktisk detekterer angiogenese inden for tumorer, blev dyrene ofret efter endt billeddannelse på dag 21 for at opnå histologiske tegn på Vaskulaturen. Ifølge billederne af anti-VEGFR2 immunofarvning, mikrovaskulære strukturer i 4T1-RR tumor væv var betydeligt tydeligere end i 4T1-RRT tumor væv, som var i overensstemmelse med Fluc signaler (figur 5). Sammenfattende, denne dobbelte bioluminescens Imaging strategi kan bruges til at overvåge tumorprogression og angiogenese samt vurdere anti-tumor effekter af forskellige lægemidler på tumorvækst og angiogenese i tumor mikromiljø.

Figure 1
Figur 1: skematisk kort over Dual bioluminescens billeddannelse af tumorvækst og angiogenese. 4T1-cellerne transduceret af LV-RR og LV-RRT blev implanteret i Vegfr2-Fluc-KI-Transgene mus. Under tumorvækst, bli af rluc og fluc blev samtidig udført i en enkelt mus til at afspejle tumorvækst og angiogenese status, hhv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Transduktionseffektivitet af 4t1-RR-og 4T1-RRT-celler identificeret ved fluorescens Imaging. A) den diagrammatiske tegning af pLV-RR viste, at Rluc-og RFP-sekvenser blev udtrykt under arrangøren EF1α. De lyse og fluorescerende billeder af et synsfelt afslørede, at 4T1-RR celler var RFP-positive. (B) diagram tegningen af PLV-RRT viste, at single Promoter EF1α aktiverede rluc-, RFP-og HSV-TTK-gener. De lyse og fluorescerende billeder af et synsfelt afslørede, at 4T1-RRT-celler var RFP-positive. Scale bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: bioluminescens billeddannelse af Transducerede 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler. A) bioluminescens afbildning af 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler i tilstedeværelse af ctz. B) de målte rluc-signaler for 4T1-RR-og 4T1-RRT-celler opretholdt et lineært forhold til celle numrene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: visualisering af de dynamiske processer af tumorvækst og angiogenese i et levende dyr. A) flowdiagram over eksperimentet og Dual bli-påvisning af Rluc og fluc. (B) repræsentative rluc billeder af tumorprogression og fluc billeder af angiogenese under tumor udvikling i en Transgene mus. C) måling af rluc-signaler viste, at de implanterede tumorceller voksede hurtigt, mens 4T1-RRT-celler blev signifikant regresseret efter gcv-administration. (D) kvantificering af fluc-signaler viste, at angiogenese forekom efter tumor celle implantation, efter en parallel tendens med tumorvækst og død induceret af gcv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: VEGFR2 immunofarvning af 4t1-RR og 4T1-RRT-væv på dag 21. Repræsentative billeder af tumor væv sektioner farves for VEGFR2 (grøn) på dag 21. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur S1: kurve af tumorstørrelse under tumorprogression in vivo. Tumor størrelsen af 4T1-RR og 4T1-RRT celler steg efter implantation, men tumor størrelsen af 4T1-RRT celler begyndte at falde efter GCV behandling. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Figur S2: cytotoksisk effekt af GCV på 4T1-RRT-celler. 4T1-RRT-cellerne døde med den forhøjede koncentration af GCV. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Figur S3: bli billede af 4T1-RR-celler i lungerne. Efter en hale vene injektion af 4T1-RR-celler blev Rluc-signalet fra celler detekteret af BLI. Venligst klik her for at downloade denne fil.

LV-RR og LV-RRT emballage betingelser
Komponenter MEM medium 3-plasmid system 4-plasmid system
pLV-RR/pLV-RRT vektorA 0,25 mL 1,5 μg 1,5 μg
Gag-pol + rev, udtryk, vektorB  1,0 μg
Gag-pol, udtryk VectorC 0,75 μg
Rev, udtryk, vektor,D 0,3 μg
VSV-G, udtryk VectorE 0,5 μg 0,45 μg
Liposom 0,25 mL 7,5 μL 7,5 μL

Tabel 1: transfection betingelser for lentiviral emballeringssystem til fremstilling af LV-RR og LV-RRT viral bestande i 293t celler. A) PLV-cDNA-vektoren var henholdsvis PLV-RR og PLV-RRT. (B) gag-pol + rev-ekspressions vektoren kan enten være pcmv-deltar 8.91 (TRC) eller PsPAX2 (addgene). (C) gag-pol-udtryks vektor kan vælge en af pMDLg/prre (addgene), PLP1 (Invitrogen) og PPACKH1-gag (SBI). (D) rev-ekspressions vektor skal være prsv-rev (addgene), PLP2 (Invitrogen) eller PPACKH1-rev (SBI). (E) VSV-g-udtryks vektor kan vælge PMD. G (TRC), PMD2. g (addgene), PCMV-VSV-g (addgene), Pvsv-g (SBI) eller PLP/Vsvg (Invitrogen). I denne protokol blev det tre-plasmid-system anvendt, herunder psPAX2, pMD2. G og pLV-RR eller pLV-RRT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol er der beskrevet en ikke-invasiv Dual BLI-tilgang til overvågning af tumor udvikling og angiogenese. BLI reporter-systemet er først udviklet og indeholder HSV-TTK/GCV-selvmords genet til sporing af tumorprogression og regression i vivo af Rluc Imaging. I mellemtiden, tumor angiogenese er vurderet ved hjælp af Vegfr2-Fluc-KI mus via Fluc Imaging. Denne tumor-bærende musemodel er i stand til at give en praktisk platform for kontinuerlig og ikke-invasiv sporing tumor udvikling og tumor angiogenese af Dual BLI i en enkelt mus med høj relevans, reproducerbarhed, og translatability.

Angiogenesis vedrører langsigtet tumorprogression og er dermed af stor betydning1. Det er nødvendigt at studere forholdet mellem tumorprogression og angiogenese. Et stigende antal anti-angiogenesis strategier er blevet undersøgt for kræftbehandling, som er afhængige af visualiseret Monitor tilgange til præcist at vurdere behandlingsresultater. Yderligere, neovascularization af tumor væv efter traditionel strålebehandling og kemoterapi er et andet populært område af onkologiske forskning12,13,14. Disse undersøgelser kræver en dyremodel, der tillader overvågning af tumorvækst og angiogenese i realtid. De patologiske ændringer af tumor væv i traditionelle dyremodeller er normalt afhængige af histopatologiske undersøgelse, som kræver dyre offer. Disse dobbelte BLI-musemodeller hjælper med at løse problemerne med større fejl intervaller og højere omkostninger ved at ofre dyrene.

I denne dobbelte BLI-musemodel er det mest kritiske trin at bruge to typer af luciferaser, herunder Fluc og Rluc, til henholdsvis sporings celler og angiogenese på samme tid. Disse to luciferases substratspecificitet gør det muligt at udføre to typer BLI i en enkelt vært. Desuden halveringstiden for coelenterazin (substratet af Rluc) er meget kort, hvilket resulterer i Rluc signaler Falmende væk hurtigt uden at påvirke den næste Fluc signal detektion15. I drifts processen bør Rluc Imaging derfor gennemføres før Fluc Imaging på grund af den længere halveringstid af D-luciferin (substratet for Fluc). Derudover er det nøglen til at erhverve perfekte BLI-billeder at finde ud af inkubationstiden for substrater. Metabolismen af substrater kan ændre koncentrationen af substrater in vivo, hvilket fører til variation i BLI-signalintensitet.

At eje til fremskridt inden for teknologi, andre Imaging metoder til in vivo sporing af visse cellulære og subcellulære hændelser er blevet anvendt i prækliniske og kliniske undersøgelser, såsom fluorescerende billeddannelse, magnetisk resonans imaging (MRI), og Positron emission tomografi (PET)16,17. Sammenlignet med disse billeddiagnostiske strategier, bioluminescens Imaging har høj følsomhed, stærk specificitet, og nøjagtig måling, viser sin unikke overlegenhed i området for levende billeddannelse undersøgelser15. Den Rluc Imaging ansat giver mulighed for tumorvækst og anti-tumor effekter af HSV-TTK/GCV prodrug system, der skal visualiseres dynamisk i et levende dyr. Bortset fra overvågning af subkutane væv, Rluc er blevet brugt til at spore celler i lunger ved BLI-teknologi i anden forskning. Efter hale vene injektion af 4T1-RR i en mus, har vi flyttet denne mus ind i Living Imaging system til at detektere Rluc signaler efter administration af CTZ. Billedet af Rluc signal viste, at injicerede celler hovedsageligt var placeret i lungerne (figur S3). Som nævnt ovenfor, den Rluc rapport genet kan spore forskellige kræftceller i forskellige steder, som tilskynder til fuld udnyttelse af denne musemodel i kræft biologi forskning.

Ud over disse fordele kan BLI Technology bruges til at fornemme udtryks niveauerne for specifikke molekyler. Tidligere er fluorophores reporter-gener, som udtrykkes under relevante promotorer, blevet brugt til at måle fartøjets udvikling i subkutane tumorer. Under tumorprogression kan den vaskulære struktur og molekyler observeres gennem de kirurgisk implanterede vindues kamre i mus. Men denne metode har stadig begrænsninger, herunder uundgåelig invasion, fluoroforet quenching, og stærk baggrundsstøj. Den tumor-bærende musemodel etableret i Vegfr2-Fluc-KI musen skaber en ikke-invasiv observation af udtrykket niveau af Vegfr2, som er det vigtigste molekyle i tumor angiogenese. I mellemtiden viser BLI-billederne stor specificitet uden støj. Dual BLI Mouse-modellen kan have bredere anvendelsesmuligheder til at studere de potentielle molekylære mekanismer i tumorprogression og regression.

BLI-teknologien, der er baseret på ekspression af Rluc (emission 480 nm) og Fluc (emission 562 nm), er blevet vedtaget i en række in vivo-sygdomsmodeller. Den udbredte brug af BLI-teknologi in vivo er blevet begrænset på grund af den lave følsomhed af bioluminescens ved bølgelængder under 600 nm i påvisning af dybe væv. Dette er forårsaget af absorption og spredning af lys, som nedsætter det detekterbare signal op til ti gange pr centimeter af væv. For at løse dette spørgsmål, nogle forskere har fokuseret undersøgelser på rød-emitter varianter af Fluc, der udsender lys over 600 nm18. Fordi absorption og spredning af lys kan være bemærkelsesværdigt reduceret ved hjælp af disse varianter af fluc18,19, ansøgningerne af der varianter vil udvide denne protokol til et større felt af onkologiske forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af National Key R & D program i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation of China (81671734), og centrale projekter i Tianjin Science and Technology support program (18YFZCSY00010), grundlæggende forskningsmidler til de centrale universiteter (63191155). Vi anerkender Gloria Nance revisioner, som var værdifulde for at forbedre kvaliteten af vores manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA Gibco 25200072
1.5 mL Tubes Axygen Scientific MCT-105-C-S
15 mL Tubes Corning Glass Works 601052-50
293T ATCC CRL-3216
4T1 ATCC CRL-2539
60 mm Dish Corning Glass Works 430166
6-well Plate Corning Glass Works 3516
Biosafety Cabinet Shanghai Lishen Scientific Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) Sigma-Aldrich 15205
Cell Counting Kit-8 MedChem Express HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator Thermo Fisher Scientific 4111
Coelenterazine (CTZ) NanoLight Technology 479474
D-luciferin Potassium Salt Caliper Life Sciences 119222
DMEM Medium Gibco C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) BIOIND 04-001-1A
Fluorescence Microscope Nikon Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV) Sigma-Aldrich Y0001129
Graphics Software GraphPad Software Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles Becton Dickinson 328421
Isoflurane Baxter 691477H
Lentiviral Packaging System Biosettia cDNA-pLV03
Liposome Invitrogen 11668019
Living Imaging Software Caliper Life Sciences Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Lumina II
MEM Medium Invitrogen 31985-070
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Glass Works R21031399
Polybrene Sigma-Aldrich H9268-1G
RPMI1640 Medium Gibco C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge Thermo Fisher Scientific Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator Haier DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System XENOGEN Corporation 7293

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
  2. Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
  3. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
  4. Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
  5. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
  7. Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
  8. Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
  9. Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 70-81 (2017).
  11. Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
  12. Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
  13. Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
  14. Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
  15. Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
  16. Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
  17. Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
  18. Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
  19. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics