Dubbel bioluminescens avbildning av tumörprogression och angiogenes

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll beskriver inrättandet av en tumör-bärande musmodell för att övervaka tumörprogression och angiogenes i realtid av Dual Mareld Imaging.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, K., Wang, C., Wang, R., Chen, S., Li, Z. Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (150), e59763, doi:10.3791/59763 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenes, som en avgörande process av tumör progression, har blivit en forskning hotspot och mål av anti-tumör terapi. Emellertid, det finns ingen tillförlitlig modell för att spåra tumör progression och angiogenes samtidigt på ett visuellt och känsligt sätt. Bioluminescence Imaging visar sin unika överlägsenhet i levande avbildning på grund av dess fördelar med hög känslighet, stark specificitet, och noggrann mätning. Presenteras här är ett protokoll för att upprätta en tumör-bärande musmodell genom att injicera en Renilla luciferas-märkt murina bröstcancer cell linje 4T1 in i transgena mus med angiogenes-inducerad Firefly luciferas uttryck. Denna musmodell ger ett värdefullt verktyg för att samtidigt övervaka tumörprogression och angiogenes i realtid av Dual Mareld Imaging i en enda mus. Denna modell kan vara allmänt tillämpas i anti-tumör Drug screening och onkologi forskning.

Introduction

Angiogenes är en viktig process i utvecklingen av cancer från små, lokaliserade neoplasmer till större, potentiellt metastaserande tumörer1,2. Sambandet mellan tumörtillväxt och angiogenes blir en av de punkter som betoningen i området onkologi forskning. Emellertid, traditionella metoder för att mäta morfologiska förändringar misslyckas med att övervaka tumörprogression och angiogenes samtidigt i levande djur med hjälp av en visualiserad metod.

Bioluminescence Imaging (bli) av tumörceller är en särskilt lämplig experimentell metod för att övervaka tumörtillväxt på grund av dess icke-invasivitet, känslighet, och specificitet3,4,5,6 . BLI-tekniken bygger på principen att luciferas kan katalysera oxidation av ett specifikt substrat samtidigt som det avger bioluminescens. Den luciferas uttrycks i implanterade tumörceller reagerar med det injicerade substratet, som kan upptäckas av ett levande avbildningssystem, och signaler indirekt återspeglar förändringarna i cell nummer eller cell lokalisering in vivo6,7.

Med undantag för tumörtillväxt, tumör angiogenes (det kritiska steget i cancer progression) kan också visualiseras genom bli-teknik med Vegfr2-Fluc-KI transgena möss8,9,10. Den vaskulära endoteliala tillväxtfaktorn (VEGF) receptor 2 (Vegfr2), en typ av VEGF-receptorn, uttrycks mestadels i de vaskulära endotelcellerna hos vuxna möss11. I Vegfr2-Fluc-KI transgena möss slås DNA-sekvensen av Firefly luciferas (Fluc) in i den första exon av den endogena Vegfr2 sekvensen. Som ett resultat uttrycks Fluc (som visas som BLI-signaler) på ett sätt som är identiskt med nivån av angiogenes hos möss. Att växa bortom några millimeter i storlek, tumören rekryterar nya vasculatures från befintliga blodkärl, som uttrycker mycket Vegfr2 utlöses av tillväxtfaktorer från tumörceller1. Detta öppnar möjligheten att använda Vegfr2-Fluc-KI transgena möss för att icke-invasivt övervaka tumör angiogenes av BLI.

I detta protokoll är en tumör-bärande musmodell inrättas för att övervaka tumörprogression och angiogenes i en enda mus genom Firefly luciferas (Fluc) och Renilla luciferas (rluc) Imaging, respektive (figur 1). En 4T1-celllinje (4T1-RR) skapas som stabilt uttrycker Rluc och Red fluorescerande protein (RFP) för att spåra celltillväxt av Rluc Imaging. För att ytterligare undersöka de dynamiska förändringarna av angiogenes i progression och regression av tumören, en annan 4T1 cellinjer (4T1-RRT) skapas som uttrycker självmord gen herpes simplex virus stympad tymidin Kinas (HSV-TTK), rluc, och RFP. Genom administrering av ganciklovir (GCV), de HSV-TTK uttrycker celler selektivt ableras. Baserat på dessa cellinjer, en tumör-bärande modell i Vegfr2-Fluc-KI möss är byggd som fungerar som en experimentell modell överbrygga tumör progression och tumör angiogenes in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experiment måste överensstämma med nationella och institutionella bestämmelser om användning av djur för forskningsändamål. Tillstånd att utföra experiment måste erhållas. Behandlingen av djur och experimentella procedurer i studien följer Nankai-universitetets djur vårds-och användnings kommitté riktlinjer som överensstämmer med de riktlinjer för djuromsorg som godkänts av National Institutes of Health (NIH).

1. LV-Rluc-RFP (RR) och LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral förpackning och produktion

Anmärkning: PLV-RR bär genen sekvenser av Renilla luciferas (rluc) och rött fluorescerande protein (RFP) under promotorn EF1α, medan PLV-RRT bär genen sekvenser kodning rluc, RFP, och herpes simplex virus stympade tymidin Kinas (HSV-TTK) ( Figur 2).

  1. Utsäde 1 x 106 av 293T celler per brunn in i en 6 väl tallrik och kultur över natten i en fuktad inkubator med 5% Co2 vid 37 ° c med Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10% foster bovin serum (FBS).
  2. Förbered Liposom suspensionen: blanda 7,5 μL av Liposom och 0,25 mL av minimal essentiell medium (MEM) i en 1,5 mL rör efter inkubering för 5 min vid rumstemperatur (RT) för att skingra liposomer lika.
  3. Förbered DNAs-lösningen (DNAs-RR): Lägg separat till pLV-RR-vektorn och hjälp plasmider till 0,25 mL MEM i en 1,5 mL tub enligt beskrivningen i tabell 1.
  4. Skaffa den Liposom/DNAs-RR förening: Tillsätt försiktigt DNAs-RR-lösningen i beredd Liposom suspension droppe för droppe och inkubera i 20 min vid RT så DNA-bindningar till lipidmembranet.
  5. Ersätt mediet för 293T-cellerna med 1 mL DMEM som innehåller 10% FBS och tillsätt Liposom/DNAs-RR-substansen till mediet för 293T-cellerna varsamt.
  6. Efter inkuberingen i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° c i 12 – 16 h, Byt ut den Liposom/DNAS-RR-förening som innehåller medel av 293T-cellerna med 1 ml DMEM innehållande 10% fbs och 100 U/ml penicillin − streptomycin.
  7. Fortsätt att odla 293T-cellerna i den befuktade inkubatorn för 48 h efter transfektion. Sedan samla supernatanten av 293T celler och centrifugera mediet på 300 x g för 5 min till pellet 293t celler. Överför lentivirus-RR (LV-RR)-innehåller supernatanten till 1,5 mL sterila polypropen lagring rör och förvara vid-80 ° c.
    Anmärkning: en biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) anläggning krävs för att arbeta med rekombinant lentivirus.
  8. Upprepa steg 1.1-1.7 och använda pLV-RRT vektor i stället för pLV-RR vektor i steg 1,3 för att få lentivirus-RRT (LV-RRT). Förvara LV-RRT vid-80 ° c.
    Obs: den icke-renade lentivirala beståndet kan hämma celltillväxt i vissa fall. Lentiviral lager kan behöva renas. Den lentivirala bestånd som innehåller LV-RR eller LV-RRT partiklar bör delas in i 1,5 mL rör (1 mL per tub) för lagring för att undvika flera fri-Tina cykler.

2. LV-RR och LV-RRT lentiviral transduktion för genuttryck i 4T1 celler

  1. Seed 4T1 celler i en 6-brunn tallrik (5 x 105 celler/brunn) och kultur med Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium innehållande 10% FBS över natten i en fuktad inkubator med 5% Co2 vid 37 ° c.
  2. Ta bort mediet från odlingsplattan och Ersätt det med 1 mL färskt RPMI 1640 medium samt 1 mL lentiviral Stock (LV-RR eller LV-RRT) till varje brunn. Tillsätt 8 μg/mL polybrene och blanda försiktigt mediet innehållande lentivirala partiklar genom att Pipettera upp och ner.
    Obs: Tänk på att mediet innehåller lentivirala partiklar, som kan transduce mänskliga celler.
  3. Spin signaltransduktion lösning i en centrifug på 1 000 × g för 60 min vid RT för att öka transduktionseffektiviteten. Efter centrifugering, kultur 4T1 celler för 4 – 12 h och underhålla i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° c.
    Anmärkning: för vissa cellinjer kan polybrene vara giftig för långsiktig kultur. Inkubationstiden för olika celler kan därför vara föränderlig. Kontrollera cell status flera gånger för att hitta lämplig inkubationstid.
  4. Uppdatera mediet för sensorik 4T1 celler med 2 ml RPMI 1640 medium innehållande 10% FBS och 100 U/ml penicillin − streptomycin för att avlägsna lentivirala partiklar och polybrene.

3. Drug screening och identifiering av LV-RR och LV-RRT sensorik 4T1 celler

  1. Välj sensorik celler med medium som innehåller blasticidin (BSD) enligt BSD-resistens gen transporteras av LV-RR eller LV-RRT som följande steg beskrivs.
    Anmärkning: Alternativt kan de sensorik celler som är RFP-positiva väljas genom flödescytometri enligt RFP-genen som bärs av LV-RR eller LV-RRT.
  2. 48 h efter transduktion, passage 4T1 celler vid förhållandet 1:3 till 1:4 med urvals medium (RPMI 1640 medium innehållande 10% FBS, 100 U/mL penicillin − streptomycin och 5 μg/mL BSD). Byt medium varje 2 eller 3 dagar.
    Obs: den optimala BSD-koncentrationen kan variera från cell linje till cellinjer. Därför bör ett pilotprojekt experiment av Kill kurva utföras för att bestämma den optimala koncentrationen av BSD före första försöket.
  3. 7 dagar efter Drug screening, Observera LV-RR sensorik 4T1 celler (4T1-RR) och LV-RRT sensorik 4T1 celler (4T1-RRT) under fluorescens inverterade fas-kontrast Mikroskop. Räkna antalet RFP+ 4T1-celler och alla 4T1-celler i tre synfält för att uppskatta RFP-positiva förhållandet, respektive (figur 2).
    Anm.: Alternativt kan den RFP-positiva kvoten av sensorik 4T1-celler identifieras med flödescytometri.
  4. Mät Renilla-signalerna från 4T1-RR-celler och 4T1-RRT-celler genom att använda ett levande avbildningssystem för att detektera det linjära sambandet mellan cell nummer och Renilla-signaler (figur 3).
  5. Expandera BSD-screening 4T1-RR och 4T1-RRT celler med urvals medium vid Split nyckeltal mellan 1:3 och 1:4 och lagra cellinjer lager i flytande kväve.

4. Vegfr2-Fluc-KI möss och tumör-bärande musmodell

Anmärkning: de transgena Vegfr2-Fluc-KI möss, 6-8 veckor gamla och kvinnliga, används i detta experiment för att inte invasivt övervaka angiogenes in vivo av BLI.

  1. Culture 4T1-RR-celler och 4T1-RRT-celler i 60 mm petriskålar i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° c, respektive. När cellerna är på 80% Confluence, ta bort mediet och skölj med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Ta bort PBS och tillsätt ytterligare 2 mL 0,25% trypsin-0,53 mM EDTA-lösning respektive. Förvara skålen vid RT (eller vid 37 ° c) tills cellerna lossnar.
  3. Tillsätt 5 – 10 mL färskt medium som innehåller 10% FBS, aspirera sedan och fördela cellerna för att resuspendera 4T1-RR-och 4T1-RRT-celler till 15 mL centrifugrör. Räkna två typer av 4T1 celler med hjälp av en räknekammare och förbereda cellsuspensioner vid en koncentration av 1 x 106 per 100 μl i rpmi 1640 medium.
  4. Anesthetize Vegfr2-Fluc-KI möss med 1%-3% isofluran i 100% syre vid anestesi induktion kammare med en flödeshastighet av 1 L/min. övervaka tå nypa svar på musen för att bekräfta status av anestesi. Sedan, tillämpa oftalmisk salva till ögonen på musen för att förhindra uttorkning.
  5. Ta bort musen från kammaren och placera i Nosecone. Helt ta bort håret på axeln av musen med hjälp av elektrisk rakapparat och hårborttagning grädde, vilket skulle kunna ge en bra bild av kirurgiska området och undvika att blockera BLI signaler i följande experiment.
  6. Subkutant injicera 4T1-RR celler (1 x 106 celler vid en 100 μl total volym) och 4T1-RRT celler (1 x 106 celler vid en 100 μl total volym) i vänster och höger axlar av varje mus, respektive (rekord som dag 0). Placera möss i återvinnings området med termiskt stöd tills den är helt återställd.
  7. Efter implantation av 4T1-RR och 4T1-RRT celler, vidrör tumör massorna för att kontrollera att mössen är tumör bär ande varje dag (figur S1). Vid dag 7 post-implantation, intraperitonealt injicera 50 mg/kg ganciklovir (GCV) till tumör-bärande möss två gånger per dag fram till slutet av experimentet.
    Anmärkning: före detta experiment ska cytotoxiska av GCV på 4T1-RRT celler upptäckas. Avlivnings effektiviteten hos GCV kan utvärderas genom cell räknings analys med olika koncentrationer av GCV (figur S2).
  8. På dag 0, 3, 7, 14 och 21 efter 4T1 implantation, övervaka tumörtillväxt och angiogenes av tumör-bärande möss och bedöma med både Rluc och Fluc Imaging (figur 4).

5. Dual Mareld avbildning av tumör (rluc) och angiogenes (Fluc)

  1. Öppna Living Imaging system, initiera levande Imaging programvara, och sedan initiera systemet.
    Obs: systeminitieringen tar några minuter att kyla ner laddning-kopplad enhet (CCD) kameran till-90 ° c innan du kan starta Imaging. Temperaturen blir grön när CCD-kameran kyls.
  2. Använd följande kamerainställningar:
    Kontrollera luminescence och fotografi.
    Kontrollera överlagringen.
    Inställningar för luminescence:
    Exponeringstiden ställer in AUTO under normala förhållanden.
    Binning-uppsättningar till 8.
    F/stopp-satser till 1.
    Utsläpps filter ställer öppna.
    Inställningar för fotografi:
    Binning-uppsättningar till medel.
    F/stopp-apparater till 8.
    Inställningar för IVIS-system:
    Synfält: C = 1 musvy, D = 5 möss Visa.
    Ämnes höjden ställer 1,5 cm.
  3. Väg och registrera mössen och beräkna volymen av coelenterazin (CTZ; 2,5 mg/kg) och D-Luciferin (150 mg/kg) behövs.
  4. Anesthetize tumör-bärande mus med 1%-3% isofluran i 100% syre vid anestesi induktion kammare med en flödeshastighet av 1 L/min. övervaka tå nypa svar på musen för att bekräfta status av anestesi. Fördela sedan en droppe smörj ögonsalva på båda ögonen för att undvika korneal skada.
  5. Injicera 2,5 mg CTZ (3,33 mg/mL) per kilogram kroppsvikt i retrobulbaren på musen (t. ex. för en 20 g-mus, injicera 15 μL för att leverera 50 μg CTZ) genom att använda en nål med insulinspruta.
  6. Flytta tumör-bärande mus i kameran kammaren med näsan i anestesi konen försiktigt och förvärva flera bilder av musen rygg omedelbart för att få Rluc signaler från 4T1 celler tills BLI signaler blekna bort.
    Obs: halveringstiden för CTZ är mycket kort och signalerna från Rluc Drop precipitously ~ 30 s. För att säkerställa att eventuell kvarstående Rluc-signal har försvunnit och intervallet mellan Rluc-och Fluc-avbildning bör vara mer än 10 min.
  7. Intraperitonealt injicera 150 mg/kg D-Luciferin (30 mg/mL) med en nål med insulinspruta (t. ex. för en 20 g-mus, injicera 100 μL för att leverera 3 mg D-Luciferin). Håll musen på RT i 10 min före Fluc Imaging.
  8. Flytta den här musen i kamera kammaren med näsan i anestesi konen igen och förvärva flera bilder av musen rygg för att få Fluc signaler från angiogenes.
    Obs: Fluc Kinetic Monitor bör utföras för varje mus tills signalerna når den maximala och sedan tona.
  9. Upprepa procedurerna steg 5.4 – 5.8 för varje mus.
  10. Efter avbildning, underhålla möss i en varm miljö tills djuren vaknar.
  11. Vid önskad tidpunkt (dag 3, 7, 14 och 21), upprepa ovanstående procedurer (steg 5.3 – 5.10) för att upptäcka tumörprogression och tumör angiogenes över tid.
  12. Analysera Rluc och Fluc signaler data för att undersöka sambandet mellan tumörtillväxt och angiogenes i tumörprogression.
    Obs: de regioner av intresse (ROI) som täcker BLI signal platsen används för att analysera data. Mät den totala utstrålning (fotoner) av ROI i enheten av fotoner/sekunder/cm2/steradian (p/s/cm2/SR) för varje timepoint.
  13. Analysera Rluc-och Fluc-signalerna från ROI genom att använda grafikprogramvara (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I detta experiment, en bröstcancer musmodell etablerades med hjälp av 4T1 celler för att undersöka sambandet mellan tumörtillväxt och tumör angiogenes (figur 1). För det första var två lentivirus förpackade, som bar gensekvenser som uttrycker Rluc/RFP (LV-RR) och Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), respektive, som tidigare rapporterats7. Sedan, två olika 4T1 cellinjer, som heter 4T1-RR och 4T1-RRT, skapades genom att transducing LV-RR och LV-RRT respektive. Efter läkemedels screening i 3 dagar observerades 4T1-RR och 4T1-RRT under ett fluorescensmikroskop för att detektera transduktionseffektiviteten. Som framgår av fluorescensbilden var mer än 99% av de 4T1-RR eller 4T1-RRT cellerna RFP positiva, vilket tydde på att 4T1-RR och 4T1-RRT cellinjer fastställdes genom LV-RR och LV-RRT transduktion (figur 2A, B). Under tiden fanns det inga skillnader som finns i cellmorfologi och tillväxt mellan vildtyp 4T1 och 4T1-RR eller 4T1-RRT under kultur tiden. Sammanfattnings, vi framgångsrikt byggt 4T1-RR och 4T1-RRT cellinjer utan att påverka cellulära stater. Därefter fångades Mareld Imaging (bli) av 4T1-RR och 4T1-RRT celler för att upptäcka rluc-signalerna. BLI-bilderna visade att både 4T1-RR-och 4T1-RRT-celler uppvisade starka bioluminescerande signaler med samma styrka (figur 3a). Dessutom observerades de linjära relationerna mellan Rluc-signaler och cell nummer i både 4T1-RR (R2 = 0,9974) och 4T1-RRT-celler (r2 = 0,9989), som föreslog att rluc-signalerna skulle kunna användas för att spegla tumörens tillväxt in vivo (figur 3b ).

På denna grundval, med hjälp av transgena Vegfr2-Fluc-KI möss, en tumör-bärande musmodell inrättades för att undersöka angiogenes som bröstcancer växer. Som ett resultat av knackar Fluc sekvens i den första exon av Vegfr2 sekvens i Murine, var Fluc uttryckt (som visas som bioluminescerande signaler) på ett sätt som är identiskt med angiogenes hos möss under tumörprogression. Efter subkutan injektion av 4T1-RR-och 4T1-RRT-celler övervakades celltillväxten av Rluc-signaler i närvaro av CTZ vid dag 0, 3, 7, 14 och 21 (figur 4a). Samtidigt, angiogenes induceras av tumörtillväxt utvärderades av Fluc signaler i närvaro av D-Luciferin i samma mus. På dag 7 post-implantation av 4T1-RR och 4T1-RRT, GCV administrerades till tumör-bärande möss, som ledde 4T1-RRT celler att dö. BLI-bilderna avslöjade att Rluc-signalerna från 4T1-RR och 4T1-RRT-celler ökade i samma takt före GCV-behandling. Rluc-signaler av 4T1-RRT-celler minskade dock kraftigt efter GCV-behandling. medan Rluc-signalerna från 4T1-RR fortfarande ökade försiktigt. Uppenbarligen fanns en betydande relativitet mellan Rluc signaler och tumörstorlek (figur S1).

Under tiden, enligt Fluc-bilderna, ökade Fluc-signalerna i enlighet med Rluc-ökningen och minskade efter Rluc-minskningen (figur 4b). Dessa resultat tyder på att det fanns ett direkt samband mellan tumör angiogenes och tumörtillväxt. Döden av tumörceller induceras av drogen GCV kan leda till hämning av tumör angiogenes (figur 4c). För att visa att Fluc signalen verkligen detekterar angiogenes inom tumörer, var djuren offras efter avslutad avbildning på dag 21 för att få histologiska bevis på kärl. Enligt bilder av anti-VEGFR2 immunofärgning, mikrovaskulära strukturer i 4T1-RR tumör vävnad var betydligt tydligare än i 4T1-RRT tumör vävnad, som överensstämde med Fluc signaler (figur 5). Sammanfattnings, denna dubbla Mareld Imaging strategi kan användas för att övervaka tumörprogression och angiogenes samt bedöma anti-tumör effekter av olika läkemedel på tumörtillväxt och angiogenes i tumören mikromiljö.

Figure 1
Figur 1: Schematisk karta över dubbel bioluminescens avbildning av tumörtillväxt och angiogenes. De 4T1-celler som omvandlades av LV-RR och LV-RRT implanterades i Vegfr2-Fluc-KI-transgena möss. Under tumörtillväxt, BLI av Rluc och Fluc utfördes samtidigt i en enda mus för att återspegla tumörtillväxt och angiogenes status, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Transduktionseffektiviteten hos 4T1-RR-och 4T1-RRT-celler identifierade med fluorescensavbildning. (A) den schematiska ritningen av pLV-RR visade att Rluc-och RFP-sekvenser uttrycktes under promotorn EF1α. Den ljusa och fluorescerande bilder av ett synfält avslöjade att 4T1-RR-celler var RFP-positiva. (B) diagram ritningen av PLV-RRT visade att den enda promotorn EF1α aktiverade rluc-, RFP-och HSV-TTK-gener. Den ljusa och fluorescerande bilder av ett synfält avslöjade att 4T1-RRT celler var RFP positiva. Scale bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: bioluminescence-avbildning av sensorik 4T1-RR-och 4T1-RRT-celler. A) bioluminescens-avbildning av 4T1-RR-och 4T1-RRT-celler i närvaro av CTZ. B de uppmätta rluc-signalerna från 4T1-RR-och 4T1-RRT-celler upprätthöll ett linjärt förhållande med cell nummer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: visualisering av de dynamiska processerna för tumörtillväxt och angiogenes hos ett levande djur. A) flödesschema över experimentet och dubbel upptäckt av Rluc och Fluc. B) representativa rluc-bilder av tumörprogression och Fluc-bilder av angiogenes under tumörutveckling i en transgen mus. (C) mätning av rluc-signaler visade att de implanterade tumörcellerna växte snabbt, medan 4T1-RRT-celler var signifikant regredierade efter GCV-administrering. (D) kvantifiering av Fluc-signaler visade att angiogenes inträffade efter tumör cells implantation, efter en parallell trend med tumörtillväxt och död orsakad av GCV. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: VEGFR2 immunofärgning av 4T1-RR och 4T1-RRT vävnader vid dag 21. Representativa bilder av tumör vävnader sektioner färgade för VEGFR2 (grön) på dag 21. De kärnor var motfärgas med DAPI (blå). Skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur S1: kurva av tumörstorlek under tumörprogression in vivo. Tumören storlek 4T1-RR och 4T1-RRT celler ökade efter implantation, men tumören storleken på 4T1-RRT celler började minska efter GCV behandling. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Figur S2: cytotoxisk effekt av GCV på 4T1-RRT-celler. Den 4T1-RRT celler dog med den förhöjda koncentrationen av GCV. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Figur S3: bli bild av 4T1-RR-celler i lungan. Efter svans venen injektion av 4T1-RR-celler, upptäcktes Rluc-signalen av celler av BLI. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

LV-RR och LV-RRT förpackningar villkor
Komponenter MEM medium 3-plasmid system 4-plasmid system
pLV-RR/pLV-RRT vektorA 0,25 mL 1,5 μg 1,5 μg
Gag-pol + rev Expression vektorB  1,0 μg
Gag-pol uttryck vektorC 0,75 μg
Rev Expression VectorD 0,3 μg
VSV-G uttryck vektorE 0,5 μg 0,45 μg
Liposom 0,25 mL 7,5 μL 7,5 μL

Tabell 1: transfektion villkor för lentivirala förpackningssystem för att producera LV-RR och LV-RRT virus bestånd i 293t celler. (A) pLV-cDNA-vektorn var PLV-RR respektive PLV-RRT. (B) gag-pol + rev Expression Vector kan vara antingen Pcmv-deltar 8.91 (TRC) eller PsPAX2 (addgene). (C) gag-pol Expression Vector kan välja någon av pMDLg/prre (addgene), PLP1 (Invitrogen), och pPACKH1-gag (SBI). (D) rev Expression Vector bör prsv-rev (addgene), PLP2 (Invitrogen), eller PPACKH1-rev (SBI). (E) VSV-g Expression Vector kan välja PMD. G (TRC), PMD2. g (addgene), PCMV-VSV-g (addgene), pvsv-g (SBI), eller PLP/Vsvg (Invitrogen). I detta protokoll användes tre-plasmid-systemet, inklusive psPAX2, pMD2. G och pLV-RR eller pLV-RRT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll beskrivs en icke-invasiv Dual BLI-metod för övervakning av tumörutveckling och angiogenes. BLI reporter systemet är först utvecklat, som innehåller HSV-TTK/GCV Suicide Gene för att spåra tumör progression och regression in vivo av Rluc Imaging. Samtidigt bedöms tumör angiogenes med hjälp av Vegfr2-Fluc-KI-möss via Fluc Imaging. Denna tumör-bärande musmodell kan ge en praktisk plattform för kontinuerlig och icke-invasiv spårning tumörutveckling och tumör angiogenes genom Dual BLI i en enda mus med hög relevans, reproducerbarhet, och translatability.

Angiogenes angår långsiktig tumörprogression och är därmed av kickbetydelse1. Det är nödvändigt att studera sambandet mellan tumörprogression och angiogenes. Ett ökande antal anti-angiogenes strategier har undersökts för cancerbehandling, som förlitar sig på visualiseras Monitor metoder för att noggrant bedöma behandlingsresultaten. Ytterligare, den kärlnybildning av tumör vävnad efter traditionell strålbehandling och kemoterapi är ett annat populärt område av onkologi forskning12,13,14. Dessa studier kräver en djurmodell som möjliggör övervakning av tumörtillväxt och angiogenes i realtid. De patologiska förändringarna av tumör vävnader i traditionella djurmodeller är oftast beroende av histopatologisk undersökning, vilket kräver djuroffer. Dessa dubbla BLI musmodeller bidra till att lösa problemen med större fel områden och högre kostnader från offret av djur.

I denna Dual BLI Mouse-modell, det mest kritiska steget är att använda två typer av luciferases, inklusive Fluc och Rluc, till respektive spår celler och angiogenes på samma gång. Substratet specificitet av dessa två luciferases gör det möjligt att utföra två typer av BLI i en enda värd. Dessutom är halveringstiden för coelenterazin (substratet av Rluc) mycket kort, vilket resulterar i Rluc signaler bleknar bort snabbt utan att påverka nästa Fluc signaldetektering15. I drift processen bör därför Rluc-avbildning implementeras före Fluc-avbildning på grund av den längre halveringstiden för D-Luciferin (substrat för Fluc). Dessutom är att räkna ut inkubationstiden för substrat är nyckeln till att förvärva perfekta BLI bilder. Metabolismen av substrat kan ändra koncentrationen av substrat in vivo, vilket leder till variation i BLI signalintensitet.

Att äga till framsteg inom teknik, andra Imaging modaliteter för in vivo spårning av vissa cellulära och subcellulära händelser har tillämpats i prekliniska och kliniska undersökningar, såsom fluorescerande avbildning, magnetisk resonanstomografi (MRI), och positron emissions tomografi (PET)16,17. Jämfört med dessa avbildnings strategier, Mareld Imaging har hög känslighet, stark specificitet, och noggrann mätning, visar sin unika överlägsenhet på området levande Imaging Studies15. Den Rluc Imaging används möjliggör tumörtillväxt och anti-tumör effekter av HSV-TTK/GCV prodrug system som visualiseras dynamiskt i ett levande djur. Med undantag för övervakning av subkutan vävnad har Rluc använts för att spåra celler i lungorna av BLI-teknik i annan forskning. Efter svans venen injektion av 4T1-RR i en mus, har vi flyttat den här musen i levande Imaging system för att upptäcka Rluc signaler efter administrering av CTZ. Bilden av Rluc signal visade att injicerade celler huvudsakligen var placerade i lungan (figur S3). Som nämnts ovan kan Rluc-rapportgenen spåra olika cancerceller på olika platser, vilket uppmuntrar till fullt utnyttjande av denna musmodell i cancerbiologi forskning.

Utöver dessa fördelar kan BLI-tekniken användas för att känna av uttrycksnivåerna för specifika molekyler. Tidigare har fluorophores reporter gener, som uttrycks under relevanta promotorer, använts för att mäta fartygs utveckling i subkutana tumörer. Under tumörprogression kan vaskulär struktur och molekyler observeras genom kirurgiskt implanterade fönster kammare i möss. Men denna metod har fortfarande begränsningar, inklusive oundviklig invasion, fluorophore släckning, och starka bakgrundsljud. Den tumör-bärande musmodell som fastställts i Vegfr2-Fluc-KI mus skapar en icke-invasiv observation av uttrycket nivå av Vegfr2, som är den viktigaste molekylen i tumör angiogenes. Under tiden visar BLI-bilderna stor specificitet utan brus. Dual BLI Mouse-modellen kan ha bredare tillämpningar för att studera de potentiella molekylära mekanismerna i tumörprogression och regression.

BLI-teknik, baserad på uttrycket Rluc (emission 480 nm) och Fluc (emission 562 nm), har antagits i ett antal in vivo-sjukdomsmodeller. Den utbredda användningen av BLI Technology in vivo har begränsats på grund av den låga känsligheten hos bioluminescens vid våglängder under 600 Nm för detektering av djup vävnad. Detta orsakas av absorption och spridning av ljus, vilket minskar den detekterbara signalen upp till tio gånger per centimeter vävnad. För att ta itu med denna fråga, har vissa forskare fokuserat studier på den röd-EMITTER varianter av Fluc som avger ljus över 600 Nm18. Eftersom absorption och spridning av ljus kan anmärkningsvärt reduceras med hjälp av dessa varianter av Fluc18,19, kommer tillämpningarna av luciferas varianter utvidga detta protokoll till ett större fält av onkologi forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av National Key R & D program i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation i Kina (81671734), och viktiga projekt i Tianjin Science and Technology support program (18YFZCSY00010), grundläggande forskningsmedel för de centrala universiteten (63191155). Vi erkänner Gloria Nance: s revideringar, som var värdefulla för att förbättra kvaliteten på vårt manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA Gibco 25200072
1.5 mL Tubes Axygen Scientific MCT-105-C-S
15 mL Tubes Corning Glass Works 601052-50
293T ATCC CRL-3216
4T1 ATCC CRL-2539
60 mm Dish Corning Glass Works 430166
6-well Plate Corning Glass Works 3516
Biosafety Cabinet Shanghai Lishen Scientific Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD) Sigma-Aldrich 15205
Cell Counting Kit-8 MedChem Express HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator Thermo Fisher Scientific 4111
Coelenterazine (CTZ) NanoLight Technology 479474
D-luciferin Potassium Salt Caliper Life Sciences 119222
DMEM Medium Gibco C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) BIOIND 04-001-1A
Fluorescence Microscope Nikon Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV) Sigma-Aldrich Y0001129
Graphics Software GraphPad Software Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles Becton Dickinson 328421
Isoflurane Baxter 691477H
Lentiviral Packaging System Biosettia cDNA-pLV03
Liposome Invitrogen 11668019
Living Imaging Software Caliper Life Sciences Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System Caliper Life Sciences IVIS Lumina II
MEM Medium Invitrogen 31985-070
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Glass Works R21031399
Polybrene Sigma-Aldrich H9268-1G
RPMI1640 Medium Gibco C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge Thermo Fisher Scientific Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator Haier DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System XENOGEN Corporation 7293

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
  2. Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
  3. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
  4. Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
  5. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
  7. Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
  8. Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
  9. Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 70-81 (2017).
  11. Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
  12. Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
  13. Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
  14. Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
  15. Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
  16. Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
  17. Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
  18. Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
  19. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics