In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

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Neuroscience

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Summary

A imagem latente ótica de Transcranial permite a imagem latente do largo-campo do transporte do líquido cerebrospinal no córtice de ratos vivos através de um crânio intacto.

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Sweeney, A. M., Plá, V., Du, T., Liu, G., Sun, Q., Peng, S., Plog, B. A., Kress, B. T., Wang, X., Mestre, H., Nedergaard, M. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59774, doi:10.3791/59774 (2019).

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Abstract

O fluxo de líquido cefalorraquidiano (LCR) em roedores tem sido largamente estudado com quantificação ex vivo de Traçadores. As técnicas tais como a microscopia do dois-fotão e a imagem latente de ressonância magnética (MRI) permitiram in vivo a quantificação do fluxo do CSF mas são limitadas por volumes reduzidos da imagem latente e pela baixa definição espacial, respectivamente. O trabalho recente constatou que o LCR entra no parênquima cerebral através de uma rede de espaços perivasculares em torno das artérias piais e penetrantes do córtex do roedor. Esta entrada perivascular do CSF é um excitador preliminar do sistema glymphatic, um caminho implicado no afastamento de solutos metabólicos tóxicos (por exemplo, amyloid-β). Aqui, nós ilustramos uma técnica macroscópica nova da imagem latente que permita o tempo real, imagem latente mesoscópicos de traçadores fluorescentes do CSF através do crânio intacto de ratos vivos. Este método minimamente invasivo facilita uma infinidade de experimentos experimentais e permite o teste único ou repetido da dinâmica do LCR. Os macroscópios têm alta resolução espacial e temporal e seu grande pórtico e distância de trabalho permitem a criação de imagens durante a execução de tarefas em dispositivos comportamentais. Esta aproximação da imagem latente foi validada usando a imagem latente do dois-fotão e as medidas da fluorescência obtidas desta técnica correlacionam fortemente com a fluorescência ex vivo e a quantificação de Tracers rádio-etiquetados. Neste protocolo, nós descrevemos como a imagem latente macroscópica Transcranial pode ser usada para avaliar o transporte glymphatic em ratos vivos, oferecendo uma alternativa acessível às modalidades mais caras da imagem latente.

Introduction

O líquido cefalorraquidiano (LCR) Bane o cérebro e a medula espinhal e está envolvido na manutenção da homeostase, fornecendo nutrientes e regulando a pressão intracraniana1. O CSF no espaço subarachnoid entra no cérebro através de uma rede de espaços perivasculares (PVS) que cercam artérias pial corticais e flui então para baixo ao longo das arteríolas penetrantes2. Uma vez no parênquima, as trocas de LCR com fluido intersticial (ISF), transportando metabólitos nocivos como amiloide-β (aβ) e proteínas tau agregam fora do cérebro através de intervalos de matéria branca de baixa resistência e espaços perivenosos2,3 . Este caminho é dependente de astroglial Aquaporin-4 (AQP4) canais e, portanto, tem sido denominado o glial-linfático (glymphatic) sistema4. Os produtos waste do neurópilo são cancelados finalmente do CSF-ISF através dos vasos linfáticos perto dos nervos cranianos e nas meninges para fora para os nós de linfa cervicais5. A falha deste sistema foi implicada em diversas doenças neurológicas tais como a doença de Alzheimer6,7, ferimento de cérebro traumático3, e curso isquêmico e hemorrágico8.

O transporte do CSF pode ser visualizado pela infusão de traçadores na cisterna magna (cm)9,10 e os estudos glicmfáticos no passado utilizaram principalmente a microscopia de dois fótons4,11,12, 12, 13, ressonância magnética (RM)14,15,16,17e ex vivo Imaging3,6,11, 18 para avaliar a cinética do traçador. A microscopia do dois-fotão é um método apropriado para a imagem latente detalhada de traçadores do CSF nos PVSs e o parênquima devido a sua definição espacial elevada, entretanto, tem um campo de visão estreito e exige uma janela craniana invasora ou um afinamento do crânio. A imagem latente ex vivo, em combinação com Immunohistochemistry, permite análises multinível que variam das únicas pilhas até o cérebro inteiro19. No entanto, o processo de fixação da perfusão que é necessário para observar o tecido pós-morte produz profundas mudanças na direção do fluxo do LCR e colapsa o PVS, alterando significativamente a distribuição e a localização dos traçadores12. Finalmente, quando MRI puder controlar o fluxo do CSF durante todo o cérebro murino e humano inteiro, falta a definição espacial e temporal do fluxo perivascular.

Uma técnica nova, imagem latente macroscópica transcraniana, resolve algumas destas limitações permitindo a imagem latente do largo-campo do transporte perivascular do CSF no córtice dorsal inteiro de ratos vivos. Este tipo de imagem é feito com um Macroscópio epifluorescente usando um cubo de filtro multibanda, fonte de luz LED sintonável, e câmera CMOS de alta eficiência10. Estes set-ups são capazes de resolver PVSs até 1-2 mm abaixo da superfície do crânio e pode detectar fluoróforos até 5-6 mm abaixo da superfície cortical, deixando o crânio totalmente intacto10. Os filtros e os diodos emissores de luz Multiband que podem rapidamente ajustar o comprimento de onda da excitação permitem o uso de fluoróforos múltiplos permitindo que o CSF seja etiquetado com os traçadores de pesos moleculars e de propriedades químicas diferentes na mesma experiência.

Este procedimento requer uma cirurgia simples, minimamente invasiva para expor o crânio e colocar uma placa de cabeça de peso leve para estabilizar a cabeça durante a sessão de imagem. Os traçadores podem ser entregues no cm sem perfurar no crânio ou penetrar o tecido cortical com pipetas ou cânulas9,20. Ambas as cânulas CM e placas de cabeça permanecem estáveis por vários dias a semanas e facilitam projetos experimentais mais complexos em comparação com a visualização clássica do ponto final. Este protocolo descreve como a imagem latente macroscópica Transcranial é usada para estudar a função glymphatic do sistema que segue a injeção aguda ou crônica do Tracer fluorescente do CSF no CM de ratos anestesiados/dormindo ou acordados.

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Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê universitário de recursos animais (UCAR, protocolo n º 2011-023) da Universidade de Rochester e realizados de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. preparando a cânula da cisterna magna, a placa principal, e o suporte principal

  1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e placas de cabeça antes da cirurgia.
    Nota: os traçadores fluorescentes são entregados diretamente no CSF através de um cannulation do Magna do cisterna. Para instruções detalhadas sobre este procedimento, por favor consulte Xavier et al9.
  2. Momentaneamente, usando um excitador da agulha, quebre a ponta de uma agulha de 30G x 12,7 milímetro (1/2 polegadas), 3/4 da maneira para baixo, e coloc a extremidade sem corte da agulha em uma extremidade da tubulação do polietileno 10 (PE10) (aproximadamente 45 cm de comprimento). Certifique-se de que somente o chanfro está salientes fora da borda da tubulação PE10.
  3. Quebre 1/4 da extremidade chanfrada de uma outra agulha 30G e coloc a extremidade sem corte da agulha restante na outra extremidade da tubulação PE10, com o luer-fechamento plástico ainda Unido.
  4. Encha uma seringa de vidro de 100 μL com o CSF estéril, artificial (aCSF: 126 milímetros NaCl, 2,5 milímetros KCl, 1,25 milímetros NaH2po4, 2 milímetros MgSO4, 2 milímetro CAcl2, 10 milímetros de glicose, e 26 milímetros NaHCO3).
  5. Prenda a seringa até ao fim da linha e encha-a com aCSF até atingir a ponta da agulha chanfrada. É importante que a seringa é preenchida com aCSF e não ar, como uma coluna de ar é mais propensos a volumes de infusão variável.
  6. Para experimentos crônicos, deixe a linha preenchida com aCSF e pule a etapa 1,7.
  7. Para experimentos agudos, coloque a seringa em uma bomba de infusão e retire aproximadamente 5 mm de ar, o que impedirá a mistura. Em seguida, retire o volume total de traçador (s) que é desejado para o experimento (20% extra é recomendado devido a perdas de espaço morto).
    Nota: a tubagem PE10 deve ser suficientemente longa para que a bolha de ar não introduza o manguito plástico da seringa de vidro ao carregar o traçador. Para um experimento típico, o protocolo utiliza 10 μL de albumina sérica bovina conjugada para Alexa fluor 647 (BSA-647) diluída em aCSF a 0,5%.
  8. Confirme que a placa de cabeça cabe no suporte da cabeça e que é o tamanho certo para o mouse que está sendo usado. Os marcadores anatômicos para assegurar isto são: a beira superior da janela alinha com a linha interocular e a beira do posterior cai rostral à crista occipital.
    Nota: as placas de cabeça de aço inoxidável podem ser esterilizadas e reutilizadas. A maioria das misturas de cianoacrilato pode ser removida com uma solução de acetona.

2. procedimento cirúrgico

  1. Pesar e anestesiizar o rato (por exemplo, cetamina/xilazina; 100 mg/kg de cetamina, 10 mg/kg de xilazina; i.p.).
  2. Uma vez que o rato já não responde a uma pitada do dedo do pé, umedecer a garganta e a cabeça com água estéril e raspar usando tosquiadeiras. Uma vez que a área é raspada, limpe a área com um cotonete de álcool novamente para remover qualquer cabelo residual.
    Nota: umedecendo a pele antes que o grampeamento reduza dramàtica a quantidade de cabelo na janela da imagem latente após a incisão.
  3. Coloc o rato em um frame stereotactic sobre uma almofada temperatura-controlada e aplique a pomada oftálmica do petróleo aos olhos do rato para assegurar-se de que não seque para fora.
  4. Limpe a pele exposta com um cotonete de clorexidina. Após 2 min, retire a clorexidina com uma limpeza de álcool. Finalmente, aplique uma solução de iodo que pode ser deixada para secar.
  5. Injetar analgesia subcutânea (0,25% bupivacaína HCl) para o topo do crânio e do pescoço.
  6. Começando pela parte do pescoço que cobre a crista occipital, faça um corte da linha média na pele sobrejacente e continue rostralmente em direção à linha interorbital. Incise lateralmente para a fronteira onde o músculo temporal insere no crânio. Remova toda a pele da incisão fusiforme para expor os ossos frontais e parietal.
    Cuidado: a cavidade retroorbital encontra-se caudal aos olhos e as grandes filiais da mentira facial da veia do posterior rostral ao Pinna. Tenha cuidado ao fazer a incisão para poupar essas estruturas. Se isso ocorrer, pare de sangrar Mantendo a hemostasia com um cotonete estéril por vários minutos e continue.
  7. Irrigar o crânio com soro fisiológico estéril e limpar a superfície usando cotonetes de algodão para que ele está livre de detritos e pêlos, uma vez que estes irão interferir com a qualidade da imagem. A transparência do crânio é melhor preservada deixando o periósteo e a fáscia sobrejacente intacta.
    Nota: se estas estruturas são removidas acidentalmente, o crânio pode tornar-se seco e opaco ao longo do tempo. Re-umedecer com aCSF ou usar uma mistura de óleo de parafina e glicerol para reduzir a reflectância do crânio em experimentos agudos21.
  8. Proceder à inserção da cânula cisterna magna-para detalhes cirúrgicos deste procedimento, consulte Xavier et al9.
  9. Depois de inserir a cânula CM, aplique uma mistura de cimento dentário com cola de cianoacrilato no lado ventral da placa de cabeça ao redor da borda e coloque-a no crânio para que a borda anterior da placa principal se alinhe com a ponta posterior do osso nasal e o po a borda do esterior alinha-se com o aspecto anterior do osso interparietal, certificando-se de que a sutura sagital (linha média) é centrada e reta em relação à janela (Figura 1b).
  10. Fixar a posição da placa de cabeça usando algumas gotas de acelerador de cola. Encha todas as lacunas restantes com a mistura de cimento e cure-a com acelerador.
    Atenção: Certifique-se de que o cianoacrilato não entra em contacto com os olhos do rato ou bloqueie a janela de imagem.
  11. Cole a cânula CM na placa de cabeça para garantir que estas não fiquem desanexadas durante o transporte ou quando o rato acordar.
  12. Para experimentos agudos, avance para o passo 2,16.
  13. Para experimentos crônicos, aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato de secagem clara ao crânio exposto, tendo cuidado para não criar bolhas, pois elas interferirão na imagem. A colagem fornece a proteção para o crânio e não interferirá com a imagem latente. Certifique-se de que a cola cobre o crânio exposto todo o caminho para a pele na borda da incisão.
  14. Use uma braçadeira do hemostat para prender a tubulação aCSF-enchida de PE10 2-3 cm do CM e para cortar a linha com uma ponta de cauterização de alta temperatura. Uma vez que é separado, aplainam a tubulação PE10 derretida para selar a cânula.
    PRECAUÇÃO: Certifique-se de que não liberta o grampo até que a cânula tenha sido selada e confirme que não existem fugas na tubagem para evitar uma fístula LIQUÓRICA.
  15. Administrar carprofeno (5 mg/kg a cada 24 h durante 3 dias; i.p. ou s.c.) e devolver o rato a uma gaiola controlada por temperatura, única e permitir-lhe recuperar durante pelo menos 24 h antes da imagem. Não deixe o rato desacompanhado até que recupere a consciência suficiente para manter o recumbency esternal. As janelas cranianas intactas permanecem estáveis por várias semanas.
    Nota: o experimento crônico pode ser pausado aqui.
    Cuidado: algumas complicações postoperative são: cephalohematoma/hematomas subgaleal, fístula do CSF, e infecção.
  16. Para experimentos agudos, coloque o mouse no suporte da cabeça usando a placa de cabeça para que o crânio esteja em uma posição fixa. Certifique-se de verificar o nível de anestesia e colocar uma almofada de aquecimento o mouse. O rato está agora pronto para ser levado para o Macroscópio.
    Atenção: transportar cuidadosamente o rato juntamente com a bomba de perfusão num carrinho. Se o canulação do cm se tornar desalojado, causará uma gota na pressão intracranial e todos os escapes do CSF alterarão os resultados experimentais.

3. preparando o mouse para a imagem

Observação: o protocolo varia dependendo se o experimento de imagem será executado em um mouse anestesiado (iniciar no passo 3,1) ou acordado (iniciar no passo 3,2).

  1. Ratos anestesiados
    1. Coloque o suporte da cabeça no palco do Macroscópio, certificando-se de que não há dobras na linha da bomba da seringa para a cânula CM e que não é tenso, uma vez que isso pode afetar a infusão de traçador.
    2. Observar a frequência respiratória e coloração rosa das membranas mucosas, indicando boa oxigenação. Injetar soro fisiológico por via subcutânea para garantir o nível de hidratação, se necessário. Verifique se o animal está suficientemente anestesiado e redose, se necessário.
    3. Ligue a câmara de Macroscópio e o LED e inicie o modo LIVE.
    4. Confirme a ampliação do campo de imagem para que a sutura nasofrontal na parte superior do campo e a sutura lambdóide na parte inferior possam ser claramente visualizadas, com a sutura sagital paralela e centrada no meio da imagem (Figura 1C). Uma vez no lugar, prenda o suporte principal ao estágio do Macroscópio com fita.
    5. Concentre o Macroscópio no crânio exposto. Apesar dos macroscópios terem uma profundidade de campo relativamente grande, a curvatura do crânio do mouse só permite que uma área específica esteja em foco. Os melhores resultados são obtidos quando o plano focal está localizado nos lados laterais dos ossos parietal posteriores às suturas coronais.
      Nota: esta é a localização das artérias cerebrais médias (MCA), onde ocorre a maior parte do fluxo de LCR (Figura 1D, E)10.
  2. Camundongos acordados
    1. Antes da sessão da imagem latente, deixe os animais recuperar pelo menos 24 h da cirurgia da placa principal. Períodos de recuperação mais longos (5-7 dias) também são recomendados. Durante este tempo, treinar o mouse para ser cabeça fixada no palco no tubo de retenção para 0.5-1 h por dia para a duração do período de recuperação.
      Nota: habituação permite que o mouse para ser anexado ao suporte da cabeça sem anestesia e reduz o stress e ansiedade durante o experimento real. Se isso não for viável e a anestesia não interferir com o experimento, uma dose de indução de um anestésico inalatório (por exemplo, isoflurano 2% a 1-2 L/min O2 vazão) pode ser usada para anexar rapidamente o mouse ao estágio principal.
    2. Uma vez que o rato é fixado ao suporte principal e no tubo de retenção, siga os passos 3.1.1-3.1.5.

4. infusão de traçadores fluorescentes do CSF

  1. Cannulation agudo do CM
    1. Uma vez que o traçador já foi carregado na cânula antes de ser colocado na cisterna magna na etapa 1,6, defina a bomba de infusão para a taxa desejada e volume. Os paradigmas da infusão usados rotineiramente são 5-10 μL em 1-2 μL/min, mas estes parâmetros podem ser ajustados dependendo do experimento particular, ou do tamanho e da idade do animal.
  2. Cannulation crônico do CM
    1. Antes de iniciar a sessão de imagem, siga as etapas 1.2-1.7 para experimentos agudos para preparar a linha de infusão para entregar os traçadores.
    2. Uma vez que a linha é preparada, usando uma braçadeira do hemostat cortou a extremidade selada da cânula crônica do CM. Retire a agulha da linha preparada no passo 4.2.1 e insira-a suavemente na cânula. Solte o grampo e usando a bomba da seringa, avance o traçador CSF na taxa de infusão desejada (por exemplo, 2 μL/min) para o experimento até que o traçador atinja a agulha implantada no CM.
      Atenção: se a agulha perfurar através da tubagem ao ligar a linha, retire a agulha, corte o segmento perfurado e repita este passo. Qualquer rasgo na tubulação PE10 causará um vazamento e afetará os resultados do experimento.

5. Configurando a sessão de imagem

  1. Baseado no Tracer fluorescente que está sendo infundido, determine o comprimento de onda da excitação e o tempo da exposição para cada canaleta. Escolha o tempo de exposição o mais curto necessário para visualizar o Tracer a fim maximizar a definição temporal da imagem latente do lapso de tempo. Este tempo de exposição será utilizado para todos os experimentos subsequentes com o objetivo de comparar o transporte do LCR entre diferentes animais.
    Nota: uma dica é usar o traçador na linha CM para ajustar o tempo de exposição. Embora esta seja uma primeira abordagem útil, isso deve ser otimizado ao longo do tempo.
  2. Escolha a duração do experimento e os intervalos nos quais as imagens serão adquiridas. Experimentos duram normalmente entre 30-60 min, dependendo de qual fase do transporte glicmfático é de interesse. Taxas de quadros de 1 frame/min e mais rápido são suficientes para a maioria dos experimentos.
  3. Defina o nome do arquivo e o diretório de salvamento.
  4. Se a imagem será coletada além da aquisição simultânea de outras variáveis (por exemplo, eletrocardiograma, pressão arterial, eletrofisiologia), o Macroscópio e a bomba podem ser programados para serem acionados com o software de aquisição de dados. Verifique se a função de disparo no Macroscópio está correta antes de passar para a próxima etapa.

6. experimento de imagem óptica transcraniana

  1. Inicie a infusão do traçador e a imagem ao mesmo tempo.
  2. Verific rotineiramente a cânula do CM e a tubulação PE10 para todos os sinais de um escape. Se houver qualquer vazamento de traçador no CM, os resultados deste experimento devem ser excluídos.
    Nota: se o traçador começar a acumular-se no cerebelo e não percorrer a via glicmfática da MCA, é provável que a cânula CM tenha sido injetada no cerebelo. Esses dados não devem ser incluídos.
  3. Para experimentos agudos, após a conclusão do experimento, retire o mouse do microscópio e verifique se ele ainda está adequadamente anestesiado. Rapidamente decapitar o mouse e colher o tecido cerebral. Imersão-fixar o cérebro em 4% paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° c.
    1. Para experimentos crônicos, uma vez que a imagem é concluída, retire a linha CM da cânula, lave com aCSF estéril e reseal a cânula CM com uma ponta de cauterização de alta temperatura. Retire o mouse do suporte da cabeça e devolvê-lo à sua gaiola. Repita esse processo até que outras imagens não sejam necessárias e siga a etapa 6,3.

7. análise de dados

Observação: as análises baseadas em MATLAB, como o rastreamento frontal do CSF, podem extrair grandes quantidades de dados quantitativos das frentes de traçador nesses conjuntos de dados de imagens10,22. No entanto, esses tipos de arquivos também podem ser facilmente importados e analisados em software de análise de imagem de código aberto como Fiji23.

  1. Importe as pilhas de imagens para Fiji usando a ferramenta de importação de bio-formats. Essa função preservará os metadados de arquivo que inclui a resolução de tempo e pixel. Salve a pilha de imagens como um arquivo. TIFF.
  2. Desenhe manualmente uma região de interesse (ROI) ao redor do crânio ou da área de interesse usando a ferramenta de seleção de polígono. Por exemplo, na Figura 1G um ROI foi desenhado separadamente para o hemisfério ipsilateral e contralateral após uma lesão cerebral traumática. Certifique-se de adicionar o ROI no Gerenciador de ROI (Analyze > Tools > ROI Manager) e salvá-lo.
    Nota: o transporte do LCR pode ser quantificado de duas formas principais: 1) intensidade média de fluorescência ao longo do tempo ou 2) área de influxo expressa em percentagem do ROI ou área total (mm2) após ter aplicado um limiar. O último método (Figura 1h) será descrito nas próximas etapas.
  3. Defina o limiar no quadro com fluorescência máxima (Selecione Image ≫ ajustar ≫ Threshold...). Os métodos automatizados do limiar tais como Otsu são normalmente bons em detectar o Tracer do CSF. Aplique o limiar.
  4. Antes de ir para a frente, certifique-se de que em analisar ≫ definir medições, a área de opções e a fração de área são selecionadas. Em seguida, no Gerenciadorde ROI , selecione mais > multimedida.
  5. Converta o valor de área% em mm2 usando o valor de área do ROI do output. Os valores da área% refletem a porcentagem da superfície cortical dorsal com o traçador do LCR.
  6. Plotar o influxo do traçador CSF em mm2 em função do tempo.

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Representative Results

O afluxo do CSF é imaged em um Macroscópio epifluorescente (Figura 1a), que permita a imagem latente mesoscópicos do transporte do Tracer do CSF no córtice murino. A placa da cabeça do inteiro-crânio permite o visualização dos ossos nasais rostral, dos ossos frontais e parietal no centro, e da parcela rostral do osso interparietal caudalmente (Figura 1b). Durante a imagem, as suturas nasofrontal, sagital, coronal e lambdóide podem ser prontamente identificadas (Figura 1C). Uma vez iniciada a infusão de traçador de LCR no CM (Figura 1D), a fluorescência traçada é vista pela primeira em grandes POOLS de LCR subaracnóidea na cisterna basal, na cisterna olfactofrontal e na cisterna quadrigeminal perto do recesso pineal (Figura 1e , à esquerda). Os traçadores do CSF entram então o cérebro ao longo dos espaços perivascular dos ramos pial corticais da artéria cerebral média (MCA) (Figura 1e, direita).

A imagem latente ótica de Transcranial pode ser usada para estudar a função glymphatic após ferimento de cérebro traumático (TBI)3. Os ratos receberam um TBI moderado e imediatamente mais tarde um Tracer fluorescente do CSF (BSA-647) foi injetado no CM24. O transporte do CSF foi imaged por 60 minutos após TBI (Figura 1F). A imagem latente macroscópica mostra que o Tracer está visto primeiramente na cisterna olfactofrontal mas o afluxo glymphatic ao longo dos pvss corticais é abolido completamente no lado do TBI (Figura 1G, Supp. filme 1). O efeito inibitório do TCE sobre a função glicmfática tem sido demonstrado por vários outros métodos de quantificação do traçador e pode estar subjacente à relação entre o TCE e o acúmulo de Aβ e Tau observados após a lesão3. A análise quantitativa das imagens in vivo mostra que a área de influxo ipsilateral diminui quase um terço em relação ao hemisfério contralateral (Figura 1h).

Figure 1
Figura 1. Imagem latente macroscópica transcraniana. (A) esquema da imagem macroscópica configurada. (B) vista dorsal da posição da placa de cabeça no crânio. O osso interparietal e os ossos nasais, frontais e parietais são todos visíveis. (C) um crânio exposto do rato durante a imagem latente antes que o Tracer do CSF aparecesse, mostrando claramente todas as suturas cranianas do crânio intacto. Barra da escala: 1 milímetro (D) esquemático de uma vista lateral do Tracer do CSF que entra no Magna do cisterna (cm) e que viaja da cisterna basal ao longo da via glymphatic. (E, painel esquerdo) A imagem latente macroscópica do influxo glymphatic em um rato tipo selvagem anestesiado Ketamine-xylazine em 20 minutos após a injeção do cm (BSA-647; 10 μL em 2 μl/min). O Tracer do CSF é visto na cisterna olfactofrontal em torno da veia rostral do rhinal abaixo da sutura nasofrontal, ao longo de algumas partes do seio sagital superior abaixo da sutura sagital, e no recesso pineal que circunda o seio transversal abaixo do lambdóide Sutura. (E, painel direito) A ampliação digital da imagem à esquerda mostra a alta resolução espacial obtida com estes microscópios. O traçador do LCR viaja dentro dos espaços perivasculares da artéria cerebral média (MCA)10. Barra de escala: 0,5 mm (F) cronograma experimental. Um rato tipo selvagem anestesiado recebeu um ferimento de cérebro traumático moderado (TBI)24 e imediatamente depois que uma injeção do cm (BSA-647; 10 μL em 2 μl/min), seguida por 60 minutos da imagem latente macroscópica. (G) imagens de lapso de tempo do transporte de traçador CSF após TBI (linha tracejada). Barra da escala: 1 milímetro (H) área do influx (milímetro2) sobre cada hemisfério durante o experimento 60-min, quantificado dos Rois em (G), o hemisfério que recebeu TBI (ipsilateral) e o hemisfério que não (contralateral). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Figura 1. Modelo da placa principal feita encomenda. (A, B) medidas exatas (no milímetro) da placa principal feita encomenda usada no protocolo macroscópico transcraniano da imagem latente. esquemas 3D de uma placa principal escavada (C) e uma placa principal inteira (D). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Filme suplementar 1. Imagem latente do tempo-lapso do transporte do CSF após ferimento de cérebro traumático moderado ao osso parietal esquerdo. Duração: 60 min. barra de escala: 1 mm por favor clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Nós descrevemos um protocolo detalhado para executar a imagem latente Transcranial do CSF em ratos vivos usando macroscópios e traçadores fluorescentes comercialmente-disponíveis. Esta técnica é simples e minimamente invasiva, mas quantitativa. A imagem latente in vivo correlaciona bem com os métodos sensíveis tais como a contagem líquida do cintilação de traçadores rádio-etiquetados que incluem 3H-Dextran e 14C-Inulin após a entrega do cm, e com a quantificação ex vivo da seção coronal10, de 18 anos. A validação com microscopia do dois-fotão demonstra que os traçadores do CSF vistos ao longo dos vasos sanguíneos corticais o Macroscópio são situados primeiramente dentro dos espaços perivascular do MCA e de suas filiais10. Essas vias de fluxo de LCR são um componente crítico do sistema glicmfático19. Embora não seja abordado neste protocolo, esses set-ups também podem ser utilizados para a imagem de vias de depuração do LCR, como o linfonorpo meningeal e cervical25,26.

As melhorias no projeto da placa principal permitem a imagem latente crônica, estável, do largo-campo do mesmo rato sobre o tempo. A forma, o tamanho, e o peso da placa principal podem ser costurados para cada aplicação específica. Com avanços no corte do laser e na impressão 3D, há poucas limitações a respeito das especificações. O chapeamento principal igualmente permite a imagem latente longitudinal de animais anestesiados ou acordados e a habilidade à imagem através de um crânio intacto evita o neuroinflammation e o edema associados com a colocação de janelas cranianas ou finas do crânio27, 28 anos de , 29. esta é uma vantagem importante desde que a entrega Stereotaxic de traçadores fluorescentes através do córtice no estriado ou nos ventrículos laterais usando um furo craniano da rebarba reduz extremamente a função glymphatic20,26. O grande pórtico e as distâncias de trabalho da maioria dos macroscópios comerciais permitem que os camundongos sejam fixados no palco em várias configurações, incluindo rodas em funcionamento ou labirintos flutuantes. Os camundongos podem ser treinados e habituados a ser cabeça fixada ao estágio do microscópio durante o período de recuperação de 5-7 dias para facilitar a imagem latente acordada30.

Uma das principais limitações deste método é a baixa profundidade de penetração do Macroscópio em comparação com a microscopia de dois fótons10. Este dispositivo é capaz de resolver apenas alguns milímetros da superfície cortical abaixo do crânio intacto. Entretanto, quando isto limita a imagem latente dos processos que ocorrem mais profundamente para baixo no tecido, não é geralmente um problema para análises glymphatic desde que as rotas principais da entrada são situadas primeiramente em torno das artérias principais da superfície cortical dorsal. Apesar de ser incapaz de resolver estruturas mais profundas, os macroscópios com câmeras científicas do CMOS da eficiência elevada têm a grande deteção da fluorescência; Apesar do traçador não estar localizado na superfície do cérebro, a intensidade total da fluorescência correlaciona-se com a quantidade de traçador encontrado no cérebro em cada ponto de tempo após o início da injeção de CM10. Estes parâmetros são melhorados pelo uso de traçadores far-Red, do infravermelho próximo, ou do infravermelho desde que a imagem latente nestes comprimentos de onda mais longos reduz a auto-fluorescência do tecido e o espalhamento da luz, e tem uma relação sinal-à-ruído superior do que uma mais baixa emissão fluoróforos de comprimento de onda. O Macroscópio padrão permite a imagem latente de mais de um Tracer no mesmo experimento. Dependendo da configuração do Macroscópio, a torre do filtro tem que girar entre aquisições, reduzindo drasticamente a resolução temporal que pode ser obtida. Isso pode ser melhorado com o uso de LEDs ajustáveis e um cubo de filtro multibanda. Apesar desta melhoria, a imagem multicanal não é verdadeiramente simultânea, uma vez que há um atraso na aquisição, enquanto o LED alterna entre comprimentos de onda de excitação. É possível conseguir a imagem latente simultânea do canal duplo usando o sistema ótico de divisão de imagens que são compatíveis com a maioria de set-ups macroscópicos; no entanto, estes sacrificam a resolução espacial dividindo a resolução completa da câmera CMOS (2048 x 2048 pixel) em dois campos de visão com metade da resolução (1024 x 1024 Pixel). Enquanto as câmeras CMOS são bastante adequadas para esta utilização, o uso de uma câmera CCD pode ser aplicado a esta aplicação também. Um fator adicional que reduz a resolução temporal é o tempo de exposição necessário para a excitação adequada do fluoróforo escolhido, que normalmente varia entre 50-1000 MS. isso pode ser otimizado ainda mais usando a binning de pixel 2x2 ou 4x4, o que reduz o tempo de exposição e aumenta a taxa de quadros, em detrimento da resolução espacial. Apesar destas limitações, a imagem latente multicanal macroscópica Transcranial é capaz de conseguir taxas de frame entre 10-20 Hertz com definição espacial elevada.

Os exemplos recentes na imagem latente macroscópica transcraniana usaram Aquaporin-4 (AQP4) batem para fora os ratos10,20 e o fator de crescimento derivado plaqueta b (PDGF-b) ratos do knockout do motivo da retenção22 para demonstrar a importância de AQP4 e PDGF-B no sistema glymphatic. Os estudos usaram C57Bl6 camundongos tipo selvagem para comparar com as linhas do mouse knockout. Eles transcranialmente imaged os camundongos por uma duração de 30 min usando traçadores fluorescentes e os resultados concluíram que as linhas de nocaute tinha drasticamente reduziu o influxo do LCR em comparação com wildtypes.

Estas propriedades fazem a imagem latente ótica Transcranial uma técnica ideal para estudar o transporte do CSF, especial entre 2 ou mais coortes dos animais. Permite medidas da cinética intracisternal do Tracer em ratos vivos em uma definição da escala do mícron, em uma fração do custo de outras modalidades in vivo da imagem latente. Esta técnica permite o estudo do sistema glicmfático de forma fisiológica, não invasiva, e tem sido útil para ajudar a elucidar alguns dos fatores que regulam sua função na saúde e na doença10,20,25 . No entanto, o seu atributo mais excitante é o seu potencial para responder a perguntas futuras sobre a hidrodinâmica do LCR.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e pelo Instituto Nacional de envelhecimento (institutos nacionais de saúde dos EUA; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), o programa de redes de excelência transatlântica Fondation Leducq e o programa de investigação e inovação da UE Horizon 2020 (subvenção n. º 666881; SVDs @ Target). Também gostaríamos de agradecer a Dan Xue pela assistência especializada com ilustrações gráficas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Bupivacaine HCl University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81020
A-M Systems Dental Cement Powder Fisher Scientific NC9991371
Carprofen University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine Prevantics B10800
CMOS Camera Hammamatsu ORCA Flash 4.0
Head Plate University of Rochester No catalog # Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery Bovie Medical Corporation AA01
Insta-set Accelerator Bob Smith Industries BSI-151
Isoflurane - Fluriso Vet One 502017 University of Rochester Vivarium
Ketamine Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue Elmer's Products, Inc No catalog #, see link in comments https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape Fisher Scientific 19-027-761
Paraformaldehyde Sigma-aldrich P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous Braintree Scientific PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe Harvard Apparatus 70-4501
PURALUBE VET OINTMENT Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks Fisher Scientific 22-029-553
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice) Narishige International USA Inc MAG-1
Single-use Needles, BD Medical VWR BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 22-363-750
Tunable LED PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine University of Rochester Vivarium

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