Isolering av saliv epitelceller från mänskliga spottkörtlar för in vitro-tillväxt som Salispheres eller Monolayers

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterar en metod för att isolera och odla primära mänskliga Saliv körtel-härledda epitelceller. Dessa celler uppvisar gen uttrycksmönster som överensstämmer med dem är av saliv epitelial ursprung och kan odlas som salispheres på basalmembran matriser som härrör från engelbreth-Holm-Swarm tumörceller eller som enskiktslager på behandlade kultur rätter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beucler, M. J., Miller, W. E. Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers. J. Vis. Exp. (149), e59868, doi:10.3791/59868 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spottkörtlarna är en plats av stort intresse för forskare som är intresserade av flera aspekter av mänskliga sjukdomar. Ett mål för forskarna är att återställa funktionen av körtlar som skadats av strålbehandling eller på grund av patologier i samband med Sjögrens syndrom. Ett andra mål för forskare är att definiera de mekanismer genom vilka virus replikerar inom körtelvävnad där de sedan kan få tillgång till saliv vätskor viktiga för horisontell transmission. Dessa mål belyser behovet av en robust och tillgänglig in vitro-Saliv körtel modell som kan utnyttjas av forskare som är intresserade av ovan nämnda samt relaterade forskningsområden. Här diskuterar vi ett enkelt protokoll för att isolera epitelceller från mänskliga spottkörtlar och propagera dem in vitro. Vårt protokoll kan optimeras ytterligare för att tillgodose behoven hos enskilda studier. Kortfattat, saliv vävnad är mekaniskt och enzymatiskt separeras för att isolera enstaka celler eller små kluster av celler. Val för epitelceller sker genom plätering på en basalmembran matris i närvaro av media optimerad för att främja epitelial celltillväxt. Dessa resulterande kulturer kan upprätthållas som tredimensionella kluster, kallas "salispheres", eller odlas som en enskiktslager på behandlade plast vävnad kultur rätter. Detta protokoll resulterar i utväxt av en heterogen population av främst epitelceller som kan spridas för 5-8 passager (15-20 populations dubbleringar) innan de genomgår cellulära senescence.

Introduction

Hos däggdjur är spottkörtlarna organiserade i 3 par stora spottkörtlar: parotis, submandibular, och sublinguala körtlar. Det finns också en serie av mindre körtlar ligger på tungan och spridda över hela munhålan1. De huvudsakliga körtlarna är ansvariga för bulk volymen av saliv producerat2. Förutom att ge antimikrobiellt skydd genom utsöndras faktorer, saliv är viktigt i processen att tugga och smörjande mat när den passerar genom matstrupen2. Som sådan, Saliv körtel dysfunktion representerar en medicinsk fråga där drabbade som inte kan producera tillräckligt saliv är mer benägna att utveckla sjukdomar såsom tand håligheter eller oral candidiasis3. Dessutom, minskad saliv resulterar i större svårigheter att äta och smälta mat som har en betydande inverkan på livskvaliteten.

Saliv körtel dysfunktion återfinns främst hos patienter som lider av Sjögrens syndrom, en autoimmun sjukdom eller hos patienter med huvud-och halscancer som genomgått strålbehandling3,4,5, 6. Skadade sekretoriska vindruvor i körtlar som en följd av autoimmunitet eller strålbehandling inte genomgår självförnyelse, vilket resulterar i en patient som lever med oåterkallelig skada6. Studiet av spottkörtlar har också samlat uppmärksamheten eller forskare intresserade av mekanismer för viral patogenes. Vissa patogener, såsom humant cytomegalovirus (HCMV), envist replikerar inom spottkörtlarna, som sedan möjliggör överföring av begynnande virus till en ny värd via saliv7,8. Sålunda, det finns ett ouppträffat behov av att utveckla robusta och reproducerbara in vitro-modeller av spottkörtel vävnad att ta itu med och förstå en mängd olika medicinska problem.

Flera modeller av murina saliv körtelsystemet har använts som utgångspunkt för att förstå och karakterisera de olika epitelceller som bildar spottkörtlarna9,10. Det finns uppenbara och stora skillnader mellan människa och murina spottkörtlar11. Framför allt den mänskliga öronspottkörteln är större i förhållande till submandibular körtel medan musen submandibular och parotis är mycket lika i storlek1,2,11. Medan förevigade mänskliga submandibular cellinjer finns, det finns stora farhågor om att förevigade celler inte korrekt bibehålla fenotyp av primär vävnad och sekundära farhågor att de förevigade cellerna faktiskt inte härrör från saliv-epitel sig själv12. Av dessa skäl finns det ett intresse och ett behov av att studera primär saliv vävnad från människor.

Här beskriver vi ett protokoll för att isolera primära epitelceller från mänskliga spottkörtlar för vävnadsodling. Vårt protokoll är baserat på verk av Pringle et al. och Tran et al. med modifieringar som gjorts för att i allmänhet förenkla sina förfaranden13,14. Först, medan Tran et al.: s protokoll kräver en lång fem timmars inkubation för enzymatiskt smälta spott vävnad, har vår modifierade protokollet varit framgångsrikt med så lite som en timmes inkubation, liknande den i Pringle et al. För det andra använder vi olika enzymer för vävnadsnedbrytning, framför allt vi inte använder trypsin som används i den ursprungliga Tran et al. protokoll, utan istället använda en blandning av dispas och kollagenase. Vi föredrar att undvika trypsin i den initiala digestionssteg som en nyligen studie föreslog att initial nedbrytning av spott vävnad genom trypsin resulterar i minskad cell lönsamhet, möjligen genom förlusten av en sällsynt stamcells population15. Slutligen, Vi odlar salisfärer på ytan av basalmembran Matrix (BMM) med hjälp av en kommersiellt tillgänglig Media ursprungligen formulerats för spridning av bronkial epitelceller. Vårt protokoll kan användas för att isolera spott celler från parotis, submandibular, och sublinguala körtlar. Dessa celler uttrycker saliv amylas och andra saliv specifika gener som indikerar att de upprätthåller en fenotyp liknande den i saliv acinar epitelceller7. Vi har framgångsrikt genererat saliv kulturer från > 50 primära mänskliga vävnadsprover med hjälp av denna metod. Dessutom kan de primära saliv cellerna lätt fryses för användning vid en senare tidpunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dessa protokoll och studier har granskats och godkänts av den institutionella Granskningsnämnden vid University of Cincinnati (Federal-wide Assurance #00003152, IRB protokoll 2016-4183). Saliv vävnad är ofta resected i många huvud och hals kirurgiska ingrepp och är oftast oengagerade av den maligna processen. Typiskt, nyresected spottkörtel vävnad används inom 2-4 h efter avlägsnande från patienten (figur 1a).

1. beredning av reagens

  1. Bronkial epitelial celltillväxt medium (BEGM)
    1. Lägg till komponenter från kitet som tillhandahålls av tillverkaren (se tabell över material).
    2. Tvätta varje tub en gång med bas mediet för att säkerställa full överföring av komponenter. Tillsätt sedan kol strippad foster bovint serum för att göra en slutlig koncentration av 4% serum.
  2. Lysis buffert för röda blodkroppar (RBC)
    1. För att göra 10X lager, tillsätt 40,15 g NH4Cl, 5,0 g NaHCO3, och 0,186 g etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och ta upp till en slutlig volym av 200 ml med DH2O. Filtrera sedan sterilisera och förvara vid 4 ° c.
    2. Späd till en arbets koncentration av 1x i steril dH2O före användning.
  3. Dissociation lösning
    1. Till en 100 ml flaska dispas lösning (se tabellen av material) tillsätt 0,15 g kollagenastyp III. Efter kollagenase har helt upplöst, filter sterilisera den nya lösningen och alikvot. Förvaras vid-20 ° c.

2. vävnadsnedbrytning

  1. Med hjälp av en 100 mm vävnad kultur plattan, mechanicallymince vävnaden i fina bitar ~ 1-2 mm i storlek med autoklav-steriliserad dissekera sax och kirurgiska pincett (figur 1b,C). Bindväv mellan bitar bör skäras för att säkerställa korrekt separation och lätthet i ytterligare steg.
  2. Tillsätt 6 mL av dispase/kollagenaslösningen till den malda vävnaden. Inkubera sedan vid 37 ° c i cirka 30 min till 1 h.
  3. Störa vävnaden genom att Pipettera med en 5 mL serologisk pipett 15-20 gånger.
  4. Inkubera vid 37 ° c i ytterligare 30 min till 1 h.
  5. Upprepa steg 2,3 och 2,4 två-tre gånger eller tills vävnaden liknar en flytgödsel och kan lätt passera genom pipetten öppningen (figur 1d).
    Anmärkning: Start storleken på vävnaden prov och hur finhalt av vävnaden malning kommer att avgöra hur många gånger man behöver upprepa steg 2,3 och 2,4. Typiskt, vi får vävnad ca 1 cm x 1 cm i storlek. Dessutom kan man övervaka vävnads dissociation med hjälp av en standard inverterad vävnad kultur Mikroskop för att spåra utvecklingen av cell dissociation från vävnaden. Små kluster av celler är idealiska för inledande utväxt av saliv celler som salispheres.

3. beläggning brunnar med basalmembran matris

Anmärkning: basalmembran Matrix (BMM) bör Tinas över natten vid 4 ° c dagen innan den kommer att användas. Efter upptinning ska BMM ständigt underhållas på is eller vid 4 ° c, eftersom det snabbt stelnar (dvs. bildar en gel) vid varmare temperaturer. Dessutom bör försiktighet iakttas om proverna har kylts på is före plätering på BMM som kallprover kommer att "smälta" BMM och exponera celler till plast skålen.

  1. Pipettera långsamt BMM (se tabellen av material) i varje brunn som ska beläggas. Jämnt och långsamt fördela BMM över brunnen.
    Anmärkning: i allmänhet använder vi 500 μL per varje brunn av en sex-bra tallrik, men denna volym kan justeras för användning på andra varianter av plattor som 12-brunn eller 24-brunn, eller som önskas för tjockare eller tunnare hydrogels.
  2. Inkubera de belagda plattorna vid 37 ° c i minst 15 min före användning så att BMM-tiden kan stelna.

4. filtrering av osmält vävnad, RBC Lys och cellplätering

  1. Överför vävnad homogeniate från steg 2,5 till ett 15 mL koniskt rör. Tvätta plattan en gång med 6 mL av Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) för att överföra kvarvarande celler.
  2. Filtrera homogena i en 50 mL koniskt rör genom en 70 μm nylon mesh cell SIL att ta bort osmält vävnad. Centrifugera spända celler i 5 min vid 500 x g.
  3. Späd 10X RBC lysis buffert i steril dH2O för att göra en 1x arbetslösning.
  4. Aspirera på supernatanten. Sedan Omsuspendera cellpelleten i 10 mL 1x RBC-lysbuffert. Inkubera i 5 min vid 37 ° c.
  5. Tillsätt 20-25 mL DPBS för att neutralisera RBC lyseringsbufferten och minimera lys av spott celler. Centrifugera i 5 min vid 500 x g.
    Anmärkning: efter behandling med RBC lyseringsbuffert ska cellpelleten vara vit. Röd färg i pelleten indikerar att inte alla RBC har helt lysed. Upprepa steg 4,4 till 4,5 om det behövs för fullständig lys av alla RBC.
  6. Aspirera på supernatanten. Omsuspendera pelleten i 1-2 mL av BEGM per brunn och placera sedan de återupphängda cellerna på BMM-belagda brunnar. Inkubera vid 37 ° c.
  7. En gång pläterad på BMM, celler kommer att bildas i sfäriska strukturer eller "salispheres" under en 2-3-dagars period. Celler kan bibehållas som salispheres för ca 5-7 dagar innan BMM börjar försämras så att cellerna att komma åt och hålla sig till plasten och växa som en monolayer.

5. subculturing den salispheres och underhåll på BMM

  1. Aspirera media från brunnar och tillsätt sedan 1 mL dispase/kollagenaslösning till varje brunn och inkubera vid 37 ° c i ~ 15 min eller tills BMM oftast har lösts upp.
  2. Överför celler till ett 15 mL koniskt rör och tvätta brunnar en gång med DPBS för att få kvarvarande celler. Centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  3. Aspirera på supernatanten. Omsuspendera pelleten i 2 mL trypsin och inkubera vid 37 ° c i 15 minuter.
  4. Neutralisera trypsin med hjälp av alla kompletta medier som innehåller 10% serum. Centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  5. Aspirera på supernatanten. Omsuspendera cellerna i DPBS för att ta bort kvarvarande media, trypsin och serum. Centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  6. Aspirera på supernatanten. Resuspend i BEGM och platta de återsuspenderade cellerna på stelnat BMM-belagda kultur rätter. Återsuspenderade celler kan också pläteras direkt på cellkulturer behandlade rätter för spridning som en monolayer. För mer information om tillväxt av saliv-celler som en monolayer, se avsnitt 6. Celler som odlas på BMM eller på plast bör matas med färska BEGM varje 2 – 3 dagar.
  7. Odla cellerna i en fuktad inkubator som hålls vid 37 ° c med 5% CO2.

6. subculturing den salispheres på behandlade plast vävnad kultur rätter

Om du underhåller celler som ett enskiktslager på plast börjar du med det här steget. Följande protokoll gäller för celler som växer i en 100 mm maträtt.

  1. Aspirera medierna. Tvätta en gång med DPBS för att ta bort kvarvarande material.
  2. Tillsätt 2 mL trypsin och inkubera vid 37 ° c i 15 min, eller tills cellerna har helt lossnat.
  3. Neutraliserar trypsin med 4 mL av alla kompletta medier som innehåller 10% serum. Överför celler till ett 15 mL koniskt rör.
  4. Tvätta plattan en gång med ca 5 mL DPBS för att samla upp kvarvarande celler. Centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  5. Aspirera på supernatanten. Omsuspendera cellerna i 6-10 mL DPBS för att avlägsna kvarvarande material.
  6. Centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  7. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera i BEGM. Plattceller på behandlade plast vävnad kultur rätter. Foder med färsk BEGM varje 2-3 dagar.
  8. Odla cellerna i en fuktad inkubator som hålls vid 37 ° c med 5% CO2.

7. cryopreservation av celler

Anmärkning: cryopreservation av celler kan åstadkommas från en enda cellsuspension som härrör från antingen salisphere eller enskiktslager odlade celler.

  1. Räkna cellerna på en hematokytometer för att beräkna den totala mängden celler som finns.
  2. Centrifugera i 5 min vid 500 x g.
  3. Aspirera på supernatanten. Omsuspendera pelleten i BEGM med 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Koncentrationen av celler bör vara 2 x 106 celler/ml till 10 x 106 celler/ml.
  4. Till sterila kryogena förvarings rör. Placera rören i ett isolerat skum rack och inkubera vid-80 ° c över natten för att sakta frysa cellerna.
  5. På nästa dag, placera rören i flytande kväve för långtidslagring.
    Notera: cellerna ska snabbt Tinas vid 37 ° c. Vid upptining ska celler pelleteras vid 500 x g och de DMSO-innehållande medierna avlägsnas före pläteringen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Två-tre dagar efter plätering celler från smält vävnad på BMM, celler kommer lätt bilda små kluster som kommer att fortsätta att expandera i storlek upp till 15-20 celler per kluster (figur 2A). Cellulär skräp och fristående döda celler ses vanligtvis och bör avlägsnas genom aspirering och påfyllning med färska medier. Celler kommer att fortsätta att förökar sig som salisfärer för ca 3-10 dagar, eller så länge BMM skiktet förblir intakt. Ibland, på grund av partiell nedbrytning av BMM, celler kommer att bli knutna till den underliggande plasten och börjar förökar sig som en monolayer. Salisfärer som odlas på BMM kommer att uppvisa variation i storlek och strukturell komplexitet. Salisfärer kan upprätthållas genom att passera dem på nyberedd BMM som beskrivs i protokollet. Inom 2-3 dagar efter att ha passerat på färska BMM, cellerna kommer att reformera i sfärer. Salisfärceller kan också pläteras på cellodling-behandlad plast och odlas som en enskiktslager där de uppvisar morfologi överensstämmer med celler av epitelial ursprung som visas i figur 2b. Medan salisfär celler som odlas på BMM som salispheres är benägna att upprätthålla en fenotyp mer kännetecknande för saliv vävnad, de celler som odlas som en enskiktslager kan vara fördelaktigt för vissa experimentella protokoll. Mer omfattande karakterisering kommer att behöva utföras för att avgöra i vilken utsträckning cellerna upprätthåller en saliv fenotyp när de odlas på en enskiktslager jämfört med celler som odlas som salisfärer.

Figure 1
Figur 1 : Initial behandling av mänskliga submandibular körtlar för salisphere beredning. Excised spottkörtel vävnad ca 1 cm i diameter (a) är mekaniskt hackad i mindre bitar med vassa sax (B) tills körteln är uppdelad i smältbara bitar av cirka 1-2 mm i storlek (C). De körtel bitarna inkuberas sedan i dispase/kollagenase lösning för 30-90 min med periodisk passage genom serologiska pipetter tills provet är smält till mestadels enstaka celler eller små klumpar av celler (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Primära mänskliga salisfär celler kan odlas som sfärer på basalmembran matris eller som en enskiktslager på behandlade celler kultur rätter. Efter initial nedbrytning av saliv vävnad, smält körtlar är pläterade direkt på BMM och odlade för 3-10 dagar. Celler matas varje 2-3 dagar för att ge färska näringsämnen. När de primära salisfärerna utvecklas, kan matriserna smältas i dispase/kollagenase lösning, trypsinized att generera enstaka celler, och re-pläterad på färska BMM där de reformera i sfärer (A) eller pläterade på cellkultur rätter där de lätt bildar en kullersten morfologi typiskt för en epitelial enskiktslager (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Saliv dysfunktion är ett bekymmer för livskvaliteten för dem som lider av Sjögrens syndrom, liksom de som genomgår strålbehandling för cancer i anslutning till spottkörtlarna3,4,5, 16. En föreslagen behandling för att behandla dessa patienter är att odla funktionella spott stamceller eller organoider in vitro, som sedan kan sättas in i skadade spottkörtel att ersätta drabbade vävnad9. Dessutom, spottkörtlar är ofta en plats för uthållighet och överföring av mänskliga patogener. Till exempel, mänskliga herpesviruses som humant cytomegalovirus (HCMV) är kända för att infektera och använda spottkörtlar och saliv att överföra virus till nya värdar7,8,17. De molekylära mekanismerna bakom viral persistens i spottkörtlarna och rörelsen till saliv är fortfarande okända. Utvecklingen av in vitro-system saliv cell kommer att ge ett viktigt modellsystem för att utforska denna mekanistiska information.

Vi rapporterar här ett robust protokoll för att generera primära saliv "salispheres" som kan odlas in vitro antingen som kluster på BMM eller som enskiktslager på plast. Förmågan att odla och propagera primära mänskliga Saliv körtel epitelceller utgör en viktig plattform som forskarna kan (1) potentiellt utveckla substitutions terapier för patienter med saliv körtel brister för vilka inga andra alternativ finns (2) bättre förstå grundläggande fysiologi underliggande Saliv körtel utveckling, proliferation, sekretion, etc.; och (3) definiera mekanismer som används av patogener för att replikera och sprida till nya värdar.

Med hjälp av dessa spott celler cellkulturer, har vi rapporterat att HCMV kräver pentamer glykoprotein komplex för primär infektion och även att viruset kvarstår under en längre tid, som påminner om vad som händer med HCMV in vivo7. Dessutom, våra funktionella studier visade att saliv kulturer inte innehåller kontaminerande fibroblaster som fibroblast Tropic, Lab anpassade virus misslyckas med att infektera och replikera i den primära saliv härledda celler7. Även om vi har använt detta protokoll för att generera celler för utvärdering av HCMV-replikering och sprids i ett primärt saliv-system, kan detta protokoll lätt anpassas för att generera saliv celler användbara för det breda spektrum av forskningsämnen som nämns ovan. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att passa varje enskild forskares behov och budget. Medan vi inte har validerat andra villkor själva, andra har rapporterat framgång växande saliv epitelceller under olika medier villkor. Till exempel, Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM): F12 blandning kompletteras med Epidermal tillväxtfaktor och fibroblast tillväxtfaktor-2 har rapporterats att främja robust tillväxt av spott celler18. Alternativt, Nam et al. använda minimal väsentlig median kompletterat med fetal bovin serum framför flyttande den cellerna till en serum-fri version av en keratinocyter växten median och har rapportera robust växten av saliv cellerna på plast15. Sålunda, det verkar inte som om saliv epitelcellerna uppvisar ett absolut krav för en viss medietyp, men snarare verkar växa och föröka sig på ett antal kommersiellt tillgängliga medietyper.

Förutom Media formulering, olika basalmembran formuleringar kan utvärderas för deras förmåga att stödja robust saliv epitelial celltillväxt. Tillväxt av celler på kommersiellt tillgängliga basalmembran innehållande matriser lätt avkastning salispheres och ger en enkel, om än dyra odlingssystem7,19. Liknande den som diskuterats ovan om val av media för celltillväxt, forskare har rapporterat tillväxt och utveckling av salispheres på ett antal olika matriser och hydrogel system. Hydrogels gjorda av hyaluronsyra har den extra fördelen att skapa en extracellulär matris tvärbunden med önskade kemiska beståndsdelar för att studera deras interaktioner och effekter på celler. Med hjälp av primära mänskliga vävnader härledda saliv celler, Srinivasan et al. rapporterade framgång i tillväxt och underhåll av en saliv stamcells population i hyaluronsyra hydrogels; ökad progenitorceller celltillväxt observerades ytterligare när hydrogeler inkorporerades med peptider som härrör från basalmembran proteiner såsom perlecan och laminin20. Ett annat system som nyligen utvecklats av foraida et al. rapport med "electrospinning" att utveckla en från byggnadsställning gjord av poly (mjölk-Co-glykolsyra) (PLGA). Den PLGA hydrogeler med tillsatt elastin hittades för att lätt främja utvecklingen av en polariserad submandibular cellsystem, som kan vara användbara för att fastställa hur cellpolarisering påverkar saliv bio logi och biokemi21.

I detta protokoll har vi presenterat en enkel metod för isolering och tillväxt av primära Saliv körtel-härledda epitelceller. Detta protokoll resulterar i en snabb utväxt av en epitelial cellpopulation som kan bibehållas i genomsnitt för 5-8 passager. Det är viktigt att övervaka vävnaden under behandling med dispase/kollagenas för att säkerställa lämplig matsmältning som nämns i protokollet. Ofullständig matsmältning kommer att kraftigt minska antalet salispheres som överlever. Det är också viktigt att övervaka kulturerna för utväxt av fibroblaster som har en långsträckt form och är mycket skilda från de polygonala epitelceller som normalt växer i diskreta fläckar eller klumpar. Vi har använt detta protokoll för isolering av epitelceller från människor och möss, men det verkar troligt att det kan anpassas för användning med andra däggdjurs system. Dessutom kan detta protokoll ändras ytterligare genom att använda ytterligare reningssteg baserade på cellens yta markör uttryck och flödescytometri som kan leda till generering av mer homogena initiala cellpopulationer. På samma sätt kan detta protokoll användas för att avgöra hur olika medier eller Matrix/hydrogels formulering leder till utväxt av specifika celltyper när de först genererar salisfärerna. Sammanfattningsvis bör detta protokoll fungera som en robust start plattform för isolering och tillväxt av primära saliv celler som lätt kan anpassas för en mängd olika experimentella protokoll och forskningsområden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapporterar ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka James P. Bridges för att ha gett betydande vägledning om de metoder som är involverade för odling av primära celler. Matthew J. Beucler stöddes av nationella institut för hälsoutbildning Grant T32-ES007250. Detta arbete stöddes också av nationella institut för hälso bidrag R01-AI121028 och R21-DE026267 tilldelas William E. Miller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm culture dishes Thermo Scientific 172931
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339651
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media Lonza CC-3171 Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh Fisher 22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum Gibco 12676-029
Collagenase type III Worthington LS004182 Store at 4 °C.
Cryogenic Tube Fisher 5000-0020
Dispase Cell Applications 07923 Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors Fisher 08-940
Dulbecco phosphate buffered saline Corning 55-031-PC
General Chemicals Sigma
PathClear Basement membrane extract Cultrex 3432-005-01 Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes Falcon 353046
Surgical forceps Fisher 22-079-742
Trypsin-EDTA solution Corning 25-052-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
  2. Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
  3. Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
  4. Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
  5. Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. (2018).
  6. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
  7. Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. (2018).
  8. Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
  9. Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
  10. Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
  11. Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. (2018).
  12. Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
  13. Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
  14. Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (2011).
  15. Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
  16. Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
  17. Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
  18. Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
  19. Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
  20. Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
  21. Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics