Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

Neuroscience

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Summary

Este artigo apresenta um método para estudar o tráfico de receptores de glutamato (GluR) em culturas hipocampais primárias dissociadas. Usando uma abordagem de alimentação de anticorpos para rotular receptores endógenos ou superexpressos em combinação com abordagens farmacológicas, este método permite a identificação de mecanismos moleculares que regulam a expressão da superfície GluR modulando processos de internalização ou reciclagem.

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Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

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Abstract

Respostas celulares a estímulos externos dependem fortemente do conjunto de receptores expressos na superfície celular em um determinado momento. Assim, a população de receptores de superfície expressa está constantemente se adaptando e sujeita a rigorosos mecanismos de regulação. O exemplo paradigmático e um dos eventos de tráfico mais estudados em biologia é o controle regulado da expressão sináptica de receptores de glutamato (GluRs). Os GluRs mediam a grande maioria da neurotransmissão excitatória no sistema nervoso central e controlam mudanças funcionais e estruturais dependentes da atividade fisiológica nos níveis sinápticos e neuronais (por exemplo, plasticidade sináptica). As modificações no número, na posição, e na composição do subunidade de glurs expressados superfície afetam profundamente a função neuronal e, de facto, as alterações nestes fatores são associadas com os neuropathies diferentes. Aqui apresentamos um método para estudar o tráfico de GluR em neurônios primários hipocampais dissociados. Uma abordagem de "alimentação de anticorpos" é usada para visualizar diferencialmente as populações de GluR expressas na superfície e nas membranas internas. Ao rotular receptores de superfície em células ao vivo e fixá-los em momentos diferentes para permitir a endocitose e/ou reciclagem de receptores, esses processos de tráfico podem ser avaliados e seletivamente estudados. Este é um protocolo versátil que pode ser usado em combinação com abordagens farmacológicas ou superexpressão de receptores alterados para obter informações valiosas sobre estímulos e mecanismos moleculares que afetam o tráfico de GluR. Similarmente, pode facilmente ser adaptado para estudar outros receptores ou proteínas expressadas superfície.

Introduction

As células utilizam o processo ativo de tráfico para mobilizar proteínas para localizações subcelulares específicas e exercer rigorosa regulação espaciotemporal sobre sua função1. Esse processo é especialmente importante para os receptores transmembranares, pois as respostas celulares a diferentes estímulos ambientais dependem de cascatas intracelulares desencadeadas pela ativação do receptor. As células são capazes de modificar essas respostas alterando a densidade, localização e composição da subunidade de receptores expressos na superfície celular através da regulação do tráfico subcelular receptor2. A inserção de receptores recém-sintetizados na membrana plasmática, juntamente com a endocitose e a reciclagem de receptores existentes são exemplos de processos de tráfico que determinam o pool líquido de receptores expressos na superfície2. Muitos mecanismos moleculares cooperam para regular o tráfico de proteínas, incluindo interações proteína-proteína e modificações pós-translacionais, como fosforilação, ubiquitinação ou palmitilação2.

A regulação do tráfico de receptores é particularmente necessária em células fortemente polarizadas com estruturas altamente especializadas. O exemplo paradigmático é o controle da função neuronal pelo tráfico regulamentado de receptores de glutamato (glurs)3,4. O glutamato, o principal neurotransmissor excitatória, liga e ativa os GluRs expressos em superfície para controlar funções neuronais fisiológicas fundamentais, como neurotransmissão sináptica e plasticidade sináptica. O fato de que o tráfico de GluR alterado tem sido observado em um amplo espectro de neuropatias, variando de distúrbios do neurodesenvolvimento a doenças neurodegenerativas, destaca a importância desse processo5. Assim, compreender os acontecimentos moleculares que controlam o tráfico de GluR é de interesse em muitas áreas de pesquisa.

Neste protocolo, um método baseado anticorpo-alimentando é usado para quantificar o nível de GluRs superfície-expressados em neurônios hippocampal preliminares assim como para avaliar como as mudanças na internalização e na reciclagem resultam na expressão líquida observada da superfície. O uso de farmacologia e/ou superexpressão de receptores exógenos que abrigando mutações específicas torna este protocolo uma abordagem particularmente poderosa para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à adaptação neuronal a diferentes estímulos ambientais. Um exemplo final da utilidade deste protocolo é estudar como as mudanças multifatoriais no ambiente (como em modelos de uma doença) afetam o tráfico de GluR através do exame da expressão de superfície em tais modelos.

Usando exemplos específicos, é demonstrado inicialmente como uma manipulação farmacológica que imita a estimulação sináptica physiological [LTP químico (CLTP)] aumenta a expressão de superfície da subunidade endógena do GluA1 do AMPA-tipo de glurs (ampars) 6. o tráfico de uma forma fosfomimética superexpressa da subunidade GluN2B do NMDA-tipo de GluRs (NMDARs) também é analisado para exemplificar como esse protocolo pode ser usado para estudar a regulação do tráfico de GluR por Modificações. Embora estes exemplos específicos sejam usados, este protocolo pode facilmente ser aplicado a outros glurs e outros receptores e proteínas que possuem domínios extracelular antigénicos. No caso de não existirem anticorpos disponíveis para os domínios extracelulares, a superexpressão do epitope-etiquetado extracelular (por exemplo, as proteínas Flag-, Myc-, GFP-Tagged, etc.) podem auxiliar na rotulagem de proteínas.

O protocolo atual fornece instruções para quantificar a densidade específica do subtipo GluR e o tráfico usando anticorpos específicos. Este protocolo pode ser utilizado para estudar 1) expressão de superfície GluR total, 2) internalização GluR e 3) reciclagem de GluR. Para estudar cada processo individualmente, é aconselhável começar com as secções 1 e 2 e continuar com a secção 3, 4 ou 5. Em todos os casos, termine com as secções 6 e 8 (Figura 1).

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Protocol

O trabalho relativo à preparação da cultura preliminar hippocampal foi revisto e aprovado pelo Comitê do cuidado animal e do uso da Universidade de Northwestern (protocolo #IS00001151).

1. preparação antes da rotulagem

  1. Preparação e manutenção de culturas hipocampais primárias
    1. Prepare culturas hippocampal preliminares em uma densidade de 150.000 pilhas chapeadas em poli-D-lysine-revestido (0,1 mg/mL) 18 milímetros cobrem vidros. Excelentes guias para a preparação da cultura neuronal dissociada estão disponíveis7,8.
      Nota: Se necessário, as culturas podem ser tratadas com citosina arabinosídeo (ARA-C, 10 mM de DIV1) para evitar a proliferação glial na preparação.
      Nota: Reagentes de revestimento alternativos como fibronectina (1 mg/mL) ou laminina (5 mg/mL) podem ser usados em vez de poli-D-lisina.
    2. Manter culturas em uma incubadora de células a 37 ° c e 5% CO2 em 2 ml/poço de meios neurobasais suplementados com B27 e 2 mm L-glutamina.
      Nota: Substitutos para L-glutamina (por exemplo, Glutamax) pode ser usado, se desejado.
    3. Na base semanal, Remova metade do volume de mídia e substitua com o mesmo volume de meios neurobasais suplementados.
  2. Opcional: transfection de receptores mutado e/ou epítopo-etiquetados
    Nota:
    os neurônios devem ser transfected pelo menos 3 – 4 dias antes do ponto de tempo de análise para permitir a expressão do receptor. O uso de neurônios jovens [dias in vitro 6 – 9 (DIV6)] resulta em melhor eficiência de transfecção do que os neurônios mais velhos (DIV15 – 20), mas um número suficiente de células transfectadas (> 20) pode ser alcançada independentemente da DIV empregada.
    1. Para cada poço de uma placa de 12 poços, diluir 1,5 μg de plasmídeo contendo o construto de interesse em 100 μL de meios neurobasais frescos sem suplementação de B27 ou glutamina em um tubo de microcentrífuga e misturar por vortexing rapidamente.
      Nota: Para o transfection bem sucedido, é crítico que os meios neurobasal usados são tão frescos como possível, idealmente menos de 1 semana após a abertura da garrafa.
    2. Num segundo tubo de microcentrifugação, misture 1 μL de um reagente de lipofecção adequado em 100 μl de meios neurobasais frescos e misture suavemente.
      Nota: Não vórtice a mistura de reagente de lipofecção. O uso de reagentes frescos da lipofecção pode melhorar a eficiência do transfection.
    3. Incubar os tubos durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
    4. Adicione a mistura de reagente de lipofecção à mistura de DNA, misture suavemente e incubar durante 20 min em RT.
    5. Ajuste o volume de mídia em cada poço para 1 mL de mídia condicionada.
    6. Adicione o reagente de lipofecção-mistura de DNA gota gota para o poço.
    7. Retorne pilhas à incubadora e permita pelo menos 3 – 4 dias para a expressão da proteína.
      Nota: Para os propósitos dos protocolos de internalização e reciclagem descritos abaixo, os neurônios hipocampais foram transfectados em DIV11 – 12 com construções expressando GluN2B marcadas com GFP no domínio extracelular (GFP-GluN2B) e imaged em DIV15 – 16.
  3. OPCIONAL: incubação de células com fármacos (cronicamente ou agudamente) nos meios condicionados até a fixação.
    Nota:
    para o tratamento agudo, começar a tratar as células antes de rotulagem. Dependendo do protocolo de tratamento medicamentoso utilizado, as células podem ser mantidas em meios contendo medicamentos durante a seção 2. Em nosso exemplo, as células DIV21 estavam sujeitas a um protocolo de cLTP para aumentar a AMPAR de superfície expressa em9.
    1. Meios de comunicação condicionados para a solução extracelular (ECS).
    2. Trate as células com 300 μM de glicina em ECS durante 3 min em RT. Como um controle, tratar uma lamela irmã com ECS (sem glicina).
    3. Células de lavagem 3x com 37 ° c ECS e devolver as células em ECS (sem glicina) à incubadora de células durante 20 minutos antes de prosseguir com a secção 2.
      Nota: ECS (em mm): 150 NaCl, 2 CAcl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 glicose, 0, 1 TTX, 0, 1 estricnina e 0, 3 Picrotoxina em pH 7,4.

2. rotulagem ao vivo de receptores expressos na superfície

  1. Prepare coberturas para rotulagem
    1. Para conservar reagentes e facilitar a manipulação, transfira o lado da pilha dos COVERSLIP até uma bandeja película-coberta da parafina.
      Nota: É crítico nunca deixar as amostras secar.
    2. Guarde e mantenha suportes condicionados a 37 ° c para incubação e etapas de lavagem.
      Nota: Para uma lamínula de 18 mm, recomenda-se incubação com 75 – 100 μL de mídia para rotulagem de anticorpos e 120 – 150 μL para internalização/reciclagem.
  2. Rotulagem de receptores de superfície com anticorpo primário
    1. Incubar células com anticorpo primário diluído em meios condicionados por 15 min em RT.
      Nota: Para os receptores GFP-etiquetados, o anticorpo do anti-GFP do coelho em uma diluição de 1:1000 foi usado. Para o GluA1 endógeno, o mouse anti-GluA1 em uma diluição 1:200 foi usado.
    2. Aspirar com cuidado os meios decontenção usando uma pipeta do vácuo e as pilhas da lavagem três vezes com meios condicionados.
      Nota: Se a mídia condicionada não estiver disponível, todas as etapas de lavagem podem ser executadas usando PBS + [tampão fosfato salina (PBS) contendo 1 mM MgCl2 e 0,1 mm CAcl2]. A aspiração manual usando uma micropipeta pode ser executada se a aspiração suave do vácuo não está disponível.

3. expressão de superfície (Figura 2)

  1. Rotulagem de anticorpos secundários de receptores expressos na superfície
    1. Lave uma vez com PBS +.
    2. Fixar células incubando com paraformaldeído a 4% (PFA) e 4% de sacarose em PBS por 7 – 8 min.
      Nota: Diferentemente de outros métodos de fixação, como a incubação de metanol, a PFA não permeabiliza a membrana plasmática e, portanto, é adequada para a análise da expressão superficial. Para obter resultados ideais, use o PFA preparado na hora. O armazenamento a curto prazo de PFA no armazenamento de 4 ° c ou a longo prazo (até 30 dias) a-20 ° c é permissivo para a fixação adequada.
      Atenção: O PFA é um carcinógeno conhecido. Use equipamento de proteção pessoal adequado e um capuz de segurança ao manusear.
    3. Lave as células três vezes com PBS regular.
      Nota: Alternativamente, a glicina de 0,1 M pode ser usada lavando PFA em vez de PBS, porque a glicina extinguirá todo o fixador restante que pode aumentar o fundo na preparação.
    4. Bloqueie locais de ligação não específicos incubando com soro de cabra normal a 10% (NGS) em PBS por 30 min em RT.
      Nota: O tempo de bloqueio pode ser estendido sem efeitos adversos na rotulagem.
    5. Incubar com anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT para etiquetar os receptores anticorpo-etiquetados preliminares (isto é, superfície-expressado).
      Nota: Nestes exemplos, uma diluição 1:500 de anticorpos secundários de Alexa 555-conjugated: o anti-coelho da cabra para receptores GFP-etiquetados e o anti-rato da cabra para GluA1 foram usados.
    6. Lave as células com PBS 3x.
  2. Rotulagem de receptores intracelulares
    1. Células de permeabilização com 0,25% Triton X-100 em PBS por 5 – 10 min em RT.
      Nota: Para verificar que a rodada inicial de rotulagem de anticorpos ocupa todos os Epitopes de superfície, esta etapa de permeabilização pode ser ignorada em uma cultura irmã. Neste caso, não deve ser obtido nenhum sinal para receptores intracelulares. Adicionalmente, para verificar que nenhum receptor interno foi etiquetado na seção precedente 2 (isto é, mostrando a integridade das membranas do plasma na cultura), a etapa da permeabilização pode ser ignorada em uma cultura da irmã, e um anticorpo preliminar de encontro a um a proteína intracelular (por exemplo, PSD-95 ou MAP2) pode ser utilizada na etapa 2.2.1. Nenhum sinal deve ser obtido a partir deste primário nestas condições. Neste caso, foi utilizado um anticorpo anti-PSD-95 coelho (1:500).
    2. Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT.
    3. Rotule receptores intracelulares incubando células permeabilizadas com o mesmo anticorpo primário utilizado na seção 2,2 diluída em 3% NGS em PBS por 1 h em RT.
      Nota: A diluição do anticorpo para etiquetar receptores intracelular pode ser diferente do que aquela exigida para etiquetar receptores superfície-expressados. No exemplo de GluA1, a mesma diluição do anticorpo (1:200) foi usada.
    4. Lave as células 3x com PBS.
    5. Etiqueta com o segundo anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT.
      Nota: Nestes exemplos, uma diluição 1:500 do anticorpo secundário do Alexa 647-conjugated da cabra do rato (para GluA1) foi usada.
    6. Lave as células 3x com PBS.

4. internalização (Figura 3)

  1. Internalização de receptores de superfície rotulados por anticorpos
    1. Após a rotulagem de receptores de superfície-expressos e de lavagem do anticorpo (seção 2,2), mantenha pilhas em meios condicionados sem anticorpo e retorne-os à incubadora (37 ° c) para permitir o Internalization.
      Nota: Para os receptores NMDA, recomenda-se 30 min para internalização. Como controle, uma cultura irmã pode ser mantida com meios condicionados a 4 ° c durante o processo de internalização. A internalização mínima do receptor deve ocorrer nessas condições.
  2. Rotulagem de receptores de superfície
    1. Lave as células uma vez com PBS +.
    2. Fixar células com 4% de PFA e 4% de sacarose em PBS por 7 – 8 min.
      Atenção: Use o equipamento de proteção pessoal apropriado e uma capa de segurança ao segurar o PFA.
    3. Lave as células 3x com PBS regular.
    4. Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT para evitar ligação não específica.
    5. Incubar amostras com anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT para etiquetar receptores anticorpo-etiquetados preliminares (isto é, receptores superfície-expressados que não foram internalizados).
      Nota: Para este exemplo, foi utilizado o anticorpo secundário de cabra conjugada com Alexa 555 (1:500) para rotulagem.
    6. Lave as células 3x com PBS.
  3. Rotulagem de receptores internalizados
    1. Células de permeabilização com 0,25% Triton X-100 em PBS por 5 – 10 min.
    2. Bloqueie a ligação não específica por incubação com 10% de NGS em PBS por 30 min em RT.
    3. Incubar amostras com anticorpo secundário cDNAs etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT para etiquetar receptores anticorpo-etiquetados internalizado.
      Nota: Para este exemplo, Alexa 647-conjugado de cabra anti-coelho anticorpo secundário (1:500) é usado para a rotulagem.
    4. Lave as células 3x com PBS.

5. reciclagem (Figura 4)

  1. Internalização de receptores de superfície rotulados por anticorpos
    1. Após a rotulagem de receptores de superfície-expressos e de lavagem do anticorpo (seção 2,2), mantenha pilhas em meios condicionados sem anticorpo e retorne-os à incubadora (37 ° c) para permitir o Internalization.
      Nota: Para os receptores NMDA, recomenda-se 30 min para internalização.
  2. Bloqueio de receptores de superfície estáveis expressos
    1. Para obstruir os resumos no anticorpo preliminar Unido aos receptores superfície-expressados que não foram internalizados, incubar pilhas com os fragmentos não conjugada do anticorpo de fab anti-IgG (H + L) (de encontro ao preliminar usado na seção 2,2) diluído em meios condicionados ( 20 μg/mL) durante 20 min em RT. Este tratamento impede a interação futura com anticorpos secundários.
      Nota: Para este exemplo, foram utilizados fragmentos de cabra anti-coelho fab.
      Nota: Experimento de controle: para garantir que o bloqueio completo dos receptores expressos em superfície tenha ocorrido, as coberturas da irmã podem ser incubadas com e sem fab. As culturas devem ser fixadas imediatamente após o tratamento FAB, e ambas as culturas são incubadas com o anticorpo secundário de Alexa 555-conjugados. Nenhum sinal de Alexa 555 nas pilhas Fab-incubated indica o bloqueio apropriado do anticorpo.
    2. Lave as células 3x com mídia condicionada.
    3. Incubar pilhas com meios condicionados que contêm o dynasore de 80 μm para impedir mais internalização e pilhas do retorno à incubadora (° c 37) para permitir recicl de receptores internalizado. Dynasore é um inibidor de GTPase que inibe dynamin e, portanto, impede a internalização.
      Nota: 45 min para a reciclagem NMDAR é recomendado. Observe que Dynasore bloqueia exclusivamente o processo de internalização dependente de dynamin (por exemplo, internalização de NMDARs). Entretanto, a internalização de outra proteína sináptica (dynamin-Independent) ainda pode ocorrer na presença de Dynasore.
  3. Rotulagem de receptores reciclados
    1. Lave as células uma vez com PBS +.
    2. Fixar células com 4% de PFA e 4% de sacarose em PBS por 7 – 8 min.
      Atenção: Use o equipamento de proteção pessoal apropriado e uma capa de segurança ao segurar o PFA.
    3. Lave as células 3x com PBS.
    4. Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT para evitar ligação não específica.
    5. Células da etiqueta com o primeiro anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT.
      Nota: Para este exemplo, o anticorpo do anti-coelho da cabra de Alexa 555-conjugated (1:500) foi usado para etiquetar.
    6. Lave as células 3x com PBS.
      Nota: Lavas mais longas com PBS (5 – 10 min) podem ajudar a reduzir o fundo na preparação.
  4. Rotulagem de receptores internalizados
    1. Células de permeabilização com 0,25% Triton X-100 em PBS por 5 – 10 min.
    2. Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT.
    3. Etiqueta com o segundo anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT.
      Nota: Para este exemplo, o anticorpo do anti-coelho da cabra de Alexa 647-conjugated (1:500) foi usado para etiquetar.
    4. Lave as células 3x com PBS.

6. montagem e imagem latente das amostras

  1. Monte as células colocando suavemente o lado da célula de lamelas em 12 – 15 mL da mídia de montagem apropriada.
    Nota: A aspiração de suportes de montagem em excesso melhorará a qualidade das imagens.
  2. Células de imagem em um microscópio confocal apropriado.
    Nota: Recomenda-se a imagem de uma z-pilha em 60x ampliação com 0,35 μm passos, abrangendo toda a espessura do Neuron.

7. considerações de tempo

  1. Este é um protocolo longo que pode ser interrompido em vários pontos. Se desejado, realize a obstrução e as etapas preliminares da incubação do anticorpo durante a noite em 4 ° c em uma câmara húmida.
  2. Alternativamente, se desejado, use um processador do tecido da microonda para acelerar vastamente acima dos tempos da incubação da borne-fixação. Para todas as etapas, use 150 W a 30 ° c para configurações "on".
    1. Para bloquear, execute o processador em 2 min "on", 1 min "off" e 2 min "on".
    2. Para etapas de incubação de anticorpos primários e secundários, execute o processador em 3 min "on", 2 min "off" e 3 min "on".
      Nota: Não observamos diferença na qualidade ao fazer as alterações acima do protocolo.

8. análise de imagem

  1. É recomendável usar FIJI < https://Fiji.SC/> para realizar a análise de imagem, pois é compatível com vários formatos de arquivo. Para os nossos dados, as imagens no formato de arquivo Nikon ND2 foram adquiridas.
  2. Um script de macro é fornecido para a quantificação fácil de lotes de diferentes parâmetros pré-selecionados por FIJI. As etapas a seguir estão incluídas na macro:
    Nota: Para estes exemplos, a "intensidade integrada" foi medida.
  3. Abra os arquivos de imagem em FIJI e canais separados.
  4. Z-projetar cada pilha de canal como uma projeção de intensidade máxima.
  5. Defina um limite inferior para cada canal.
    Nota: Os limiares devem ser empiricamente determinados para cada conjunto de dados experimentais. Embora cada canal possa ter um valor de limite inferior separado, é crucial que os valores de limite de canal sejam consistentemente mantidos para todas as imagens do mesmo conjunto de dados.
  6. Selecione três a cinco dendritos secundários ou terciários e salve-os como regiões de interesse (ROIs).
  7. Meça a densidade integrada de cada ROI em canais superficiais e intracelulares.
  8. Normalize o sinal para cada ROI dividindo o valor de densidade integrado do canal de superfície pelo canal intracelular.
  9. Repita as medições para todas as imagens de controle e experimentais e normalizar valores experimentais para controlar valores (por exemplo, GluN2B WT ou condições de não-glicina).

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Representative Results

Este protocolo para estudar o tráfico de receptores de glutamato é baseado na rotulagem diferencial dos receptores expressos na superfície celular e naqueles expressos em membranas internas. A segregação é conseguida pela rotulagem dos receptores antes e após a permeabilização da membrana, utilizando o mesmo anticorpo primário, mas um anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo diferente. Como descrito pelas etapas opcionais incluíram o protocolo, trata-se de um método muito versátil para interrogar diferentes processos de tráfico de receptores, como internalização e reciclagem, podendo ser facilmente adaptado às necessidades do investigador (Figura 1) .

Primeiro, um método é fornecido para a quantificação dos receptores expressos na superfície neuronal. Este protocolo permite a quantificação da expressão superficial basal, bem como o estudo dos mecanismos moleculares pelos quais diferentes fármacos ou mutações alteram os níveis basais dos receptores expressos na superfície. Os receptores expressos em superfície foram primeiramente rotulados incubando-se com anticorpo primário e secundário antes da permeabilização. Após a permeabilização com 0,25% Triton X-100, o pool intracelular de receptores é acessível para rotulagem de anticorpos. Para ilustrar este protocolo, a superfície contra a mancha intracelular de receptores de AMPA (ampars) em culturas do controle e após a indução de CLTP foi conduzida. Especificamente, as pilhas ao vivo foram etiquetadas usando um anticorpo de encontro a um epítopo extracelular na subunidade GluA1 do Ampar, e as pilhas foram fixadas então etiquetadas com Alexa 555-conjugated secundário. As pilhas foram então costiveness e etiquetadas com o mesmo anticorpo de anti-Ampar e incubadas com um anticorpo secundário conjugado a Alexa 647. Esta rotulagem dupla permite a visualização clara das duas populações GluA1.

Após a aquisição de imagens confocais, o sinal fluorescente pode ser facilmente quantificado para mostrar um aumento na expressão superficial, em relação à população intracelular, seguindo a cLTP (Figura 2a, B). Como controle, a etapa de permeabilização foi ignorada (incubação com 0,25% Triton X-100) em uma lamínula irmã e um anticorpo primário foi usado contra PSD-95, um marcador intracelular padrão para sinapses excitatórias. Como mostrado na Figura 2C, nenhum sinal para PSD-95 pode ser obtido em células não permeabilizadas, demonstrando a integridade da membrana plasmática. Isto indica que o sinal obtido para a "superfície GluA1" corresponde realmente aos receptores superfície-expressados (isto é, o sinal para o GluA1 superfície-expressado não inclui receptores intracelular). Importante, um sinal mínimo para Internalized GluA1 pode ser observado circunstâncias da não-permeabilização, mostrando que todos os resumos de superfície estão ocupados pela rodada inicial da rotulagem do anticorpo (isto é, o sinal para o GluA1 intracelular não incluiu receptores expressos na superfície).

Um segundo processo que pode ser examinado utilizando este protocolo é a internalização de receptores expressos na superfície. Especificamente, os receptores de superfície são rotulados em uma célula viva, e os neurônios são devolvidos à incubadora por um determinado tempo para submeter-se a internalização do receptor por endocitose mediada por clathrin. Após esta etapa, as células são fixadas para preservar a expressão espacial de receptores de anticorpos primários (i.e., receptores de superfície-expressos e internalizados). Em seguida, os receptores de superfície (ou seja, aqueles que não foram internalizados no período de tempo de interesse), são rotulados com um anticorpo secundário antes da permeabilização. Após a permeabilização, os receptores que foram internalizados são rotulados por um anticorpo secundário com um fluoróforo diferente.

Neste protocolo, examinou-se como um fosforilação particular dentro do ligante de PDZ da subunidade GluN2B de NMDARs (em S1480) induz a internalização de NMDAR. Para tanto, as culturas primárias foram transfectadas com um receptor fosho-mimético, em que a Serina (S1480) havia sido substituída por glutamato (E). O mutante resultante, GluN2B S1480E, atua como uma forma "constitutivamente fosforilada" de GluN2B. Para facilitar a rotulagem de GluN2B e identificar o mutante fosse-mimético, GFP foi usado como um Tag do epítopo no lado extracelular de GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). Os receptores de superfície em células ao vivo foram rotulados com um anticorpo anti-GFP por 15 min em RT. Em seguida, o anticorpo excedente foi lavado com meios condicionados e retornou as pilhas a 37 ° c por 30 minutos para permitir o endocytosis. Em seguida, as células foram fixadas para congelar o movimento do receptor. Os receptores que permaneceram na superfície foram então rotulados com o anticorpo secundário de Alexa 555 conjugado antes da permeabilização.

Para identificar os receptores que haviam sido internalizados durante o período de incubação de 30 min, as células foram permeabilizadas, e os receptores internalizados (já rotulados com um anticorpo primário) foram então rotulados com o anticorpo de Alexa 647-conjugados. Novamente, essa estratégia de dupla rotulagem permite a quantificação da proporção de receptores internalizados. Este exemplo destaca que a fosforilação GluN2B em S1480 promove a internalização do receptor, uma vez que o mutante fosfomimetic S1480E exibiu uma relação de internalização muito maior em relação aos receptores de WT (Figura 3a, B). Como um controle, uma cultura da irmã em 4 ° c foi mantida em meios condicionados durante o internalização para retardar fortemente o processo. Como esperado, nenhum sinal foi obtido para receptores "internalizados" nessas condições (Figura 3C).

Por fim, este protocolo pode ser utilizado para examinar a reciclagem de receptores previamente internalizados. Esta variação do protocolo é uma continuação do protocolo da internalização, seguindo estes receptores para trás à superfície da pilha. Há dois componentes cruciais para essa variação. Em primeiro lugar, os receptores que permaneceram estavelmente expressos na superfície durante todo o protocolo (ou seja, receptores que não foram internalizados ou reciclados) devem ser "bloqueados" para que não sejam confundidos com receptores reciclados. Para fazer isso, antes de executar a etapa de reciclagem, os neurônios vivos são incubados com altas concentrações de fab que interagem com receptores de anticorpos primários, expressos na superfície para evitar a ligação adicional do secundário conjugado fluoróforo Anticorpo. Em segundo lugar, a internalização deve ser impedida durante a fase de reciclagem, de modo que os receptores reciclados não se repetem internalizados. Isso foi feito adicionando dynasore para a mídia durante a reciclagem como esta droga bloqueia processos dependentes de dynamin como a endocitose mediada por clathrin, como a internalização NMDAR. Neste protocolo, foi realizado o estudo do tráfico de mutantes GluN2B S1480E, bem como a rotulagem superficial de GFP-GluN2B em células ao vivo, o que permitiu a internalização durante um período de 30 min, como explicado anteriormente.

Após isso, os receptores de superfície que não foram internalizados durante este período foram bloqueados pela incubação das células com Fab por 20 min na RT. Em seguida, as pilhas foram incubadas outra vez em 37 ° c por 45 minutos para permitir que GluN2B previamente internalizado sejam recicl de volta à superfície da pilha. Dynasore estava presente na mídia durante a etapa de reciclagem. A fixação das células após esta etapa permite a identificação de receptores reciclados (ou seja, aqueles que são desbloqueados e expressos na superfície celular) e receptores internalizados (ou seja, aqueles que são anticorpos primários rotulados e intracelulares). Por 1) rotulagem de receptores reciclados com um Alexa 555-conjugado anticorpo secundário antes da permeabilização e 2) rotulagem internalizada, mas não reciclada, receptores com o anticorpo secundário de Alexa 647-conjugado, foi gerada uma razão de reciclagem para mostrar que GluN2B S1480E não tem qualquer efeito sobre a reciclagem NMDAR (figura 4a, B). Como controle, verificou-se que o bloqueio completo dos receptores expressos em superfície ocorreu por meio da incubação de coberturas irmãs na presença ou ausência de fab, seguida de fixação de PFA. Como mostrado na Figura 4C, um sinal forte pode ser observado para a superfície expressa GluN2B na ausência de bloqueio fab. Este sinal desaparece em culturas Fab-tratadas, demonstrando que o protocolo de bloqueio é suficiente para bloquear completamente os resumos expressos em superfície e que os sinais de superfície observados após a reciclagem de fato correspondem aos receptores traficadas de volta para a membrana plasmática.

Figure 1
Figura 1: esquema de variações de protocolo para estudo da expressão de superfície do receptor, internalização do receptor (endocitose) e reciclagem de receptores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: cLTP aumenta a expressão de superfície de GluA1. Os neurônios hippocampal preliminares em DIV21 foram sujeitados ao LTP químico (cLTP) incubando com o ECS contendo glicina. A rotulagem distinta de populações de superfície-expressas (vermelhas) versus intracelular (azul) GluA1 revela o aumento esperado na expressão de superfície de Ampar. (A) plano único e (B) Z-empilhadas (projeção de intensidade máxima) imagens confocais. Barras de escala = 50 μm (célula inteira) ou 5 μm (dendrite). O gráfico mostra a expressão de superfície aumentada de GluA1 após o protocolo cLTP. Índice de expressão superficial: receptores superficiais/intracelulares (n = 3; número de células: con = 7; cLTP = 7; os valores representam média ± SEM; * * * * p < 0, 1 utilizando o teste U de Mann-Whitney). (C) experimento de controle no qual a etapa de permeabilização foi ignorada. Além do que a superfície e o GluA1 interno, o marcador sináptica excitatórios intracelular PSD-95 foi avaliado. Barras de escala = 50 μm (célula inteira) ou 5 μm (dendrite). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: a fosforilação de GluN2B em S1480 promove a internalização da NMDAR. Os neurônios hippocampal preliminares foram transfected com o GFP-GluN2B WT ou o mutante phospho-mimmetic GFP-GluN2B S1480E em DIV11-12. Após 3-4 dias da expressão da proteína, a superfície GFP foi etiquetada em pilhas vivos com um anticorpo do anti-GFP do coelho e as pilhas foram retornadas então a 37 ° c para permitir a internalização do receptor pela endocytosis. Os receptores exógenos expressos em superfície foram visualizados com o anticorpo secundário conjugado com Alexa 555, e a população internalizada identificada após a permeabilização usando o anticorpo de Alexa 647-conjugados. Para maior clareza, o GFP-GluN2B de superfície é pseudocolorido em GFP-GluN2B verde e internalizado é pseudocolorido em branco. (A) plano único e (B) Z-empilhadas (projeção de intensidade máxima) imagens confocais. Barras de escala = 50 μm (célula inteira) ou 5 μm (dendrite). O gráfico mostra o internalização elevado indicado pelo mutante phospho-mimmetic GluN2B S1480E. Índice de internalização: receptores internalizados/receptores expressos em superfície (n = 6; número de células: WT = 34; S1480E = 28; valores representam média ± SEM; p < 0, 1 utilizando o teste U de Mann-Whitney). (C) experimento de controle no qual a etapa de internalização (Intenaliz.) foi realizada a 4 ° c. Barras de escala = 50 μm (célula inteira) ou 5 μm (dendrite). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: a fosforilação de GluN2B em S1480 não modifica a reciclagem NMDAR. Os neurônios hipocampais primários foram transfectados com o GFP-GluN2B WT ou com o mutante fosho-mimetic GFP-GluN2B S1480E em DIV11-12, como mostrado na Figura 3. Após 3-4 dias da expressão da proteína, a superfície GFP foi etiquetada em pilhas vivos com um anticorpo do anti-GFP do coelho e as pilhas foram retornadas então a 37 ° c para permitir a internalização do receptor pela endocytosis. Receptores de superfície-expressos restantes foram bloqueados por incubação Fab e reciclagem foi permitida para 45 min. os receptores exógenos expressos em superfície disponível (reciclados) foram visualizados com o anticorpo secundário conjugado com Alexa 555, e o população identificada após a permeabilização usando o anticorpo 647-conjugated de Alexa. Para a claridade, a superfície GFP-GluN2B é pseudocolored no GFP-GluN2B branco e internalizado é pseudocolored no verde.  (A) plano único e (B) Z-empilhadas (projeção de intensidade máxima) imagens confocais. Barras de escala = 50 μm (célula inteira) ou 5 μm (dendrite). O gráfico mostra a falta de efeito que a fosforilação GluN2B S1480 tem na reciclagem. Índice de reciclagem: receptores reciclados/receptores internalizados (n = 5; número de células: WT = 27; S1480E = 24; valores representam média ± SEM; n.s. = não significante utilizando o teste U de Mann-Whitney). (C) experimento de controle no qual a etapa de incubação Fab para bloquear resumos expressos em superfície foi ignorada. Barras de escala = 50 μm (célula inteira) ou 5 μm (dendrite). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A interação entre uma célula e seu ambiente (por exemplo, comunicação com outras células, resposta a diferentes estímulos, etc.), depende fortemente da expressão correta dos receptores na superfície celular. O Regulamento rápido e fino-ajustado no conteúdo superfície-expressado do receptor permite a resposta celular apropriada a um ambiente constantemente em mudança. No caso particular dos neurônios, alterações no número, localização, e composição subunidade de receptores sináticamente expressos influencia fortemente a comunicação sináptica, plasticidade sináptica, synaptogenesis, e poda sináptica3, 5,10. Conseqüentemente, a análise exata da expressão de superfície do receptor e do mecanismo que subjacente sua regulação é um tópico importante da pesquisa.

Um número de modalidades existe por que a expressão de superfície do receptor pode ser estudada. Em geral, estes se enquadram em três categorias principais: (i) isolamento bioquímico da população de receptores de superfície expressa, (II) técnicas de imagem para visualizar os receptores na superfície, e (III) técnicas funcionais para monitorar as conseqüências do receptor Ativação. Estas abordagens são complementares e podem ser utilizadas em conjunto para responder a perguntas específicas sobre a expressão superficial dos receptores.

Exemplos de isolamento bioquímico de receptores de superfície expressos incluem protocolos de biotinilação em células cultivadas ou fatias cerebrais e fraccionamento subcelular de células cultivadas ou tecido11. A biotinilação superficial baseia-se na rotulagem de receptores expressos em superfície com biotina, incubando as culturas com biotina ativada por éster. O grupo do éster reage com os grupos amino preliminares (-NH2) para dar forma a ligações estáveis do Amide. Porque este reagente é Cell-impermeable, somente as proteínas superfície-expressas são etiquetadas com a biotina. Após a lise celular usando detergentes, o receptor rotulado pode ser recuperado incubando o lisado da pilha com os grânulos de agarose conjugados ao avidina ou a suas variações que têm uma afinidade forte para a biotina, avaliada então por immunoblotting. O fracionamento subcelular é um protocolo bioquímico que utiliza várias etapas de centrifugação para isolar diferentes compartimentos membranosos celulares com base em suas diferentes densidades12. Ambas as técnicas são úteis para quantificar as alterações na expressão superficial das proteínas endógenas e podem ser usadas em conjunto com abordagens farmacológicas (tanto in vivo quanto em cultura) para determinar como as manipulações moleculares afetam a expressão superficial de receptores. Eles são particularmente úteis porque as mudanças em múltiplos receptores endógenos, em relação a um padrão, podem ser quantificadas simultaneamente. Entretanto, ao contrário das modalidades da imagem latente, como aquela descrita neste protocolo, a definição espacial é perdida com o processamento bioquímico das amostras.

O protocolo aqui descrito pertence à categoria de técnicas de imagem. Este grupo de aproximações (tais como a rotulagem de superfície e a imagem latente da vivo-pilha de proteínas overexpressadas cDNAs marcadas) são úteis dar a definição armazenamento à expressão de superfície dos receptores. Por exemplo, examinando a expressão superficial versus intracelular da AMPAR, como exemplificada anteriormente, pode-se examinar como as alterações na expressão são pronunciadas nos dendritos (o compartimento biológico de interesse para esta aplicação em particular). Como o fraccionamento bioquímico, as drogas podem ser usadas com técnicas da imagem latente para determinar os efeitos de uma droga na expressão de superfície. Além, o transfection dos neurônios com os receptores que contêm modificações (mutações ou tag) elabora mais as possibilidades para a imagem latente. O transfection com receptores do mutante pode delinear os efeitos de uma mutação particular na expressão de superfície.

Uma outra aproximação útil para visualizar o tráfico do receptor é microscopia viva da imagem latente após o transfection de culturas preliminares com os constructos cDNAs etiquetados, tais como o phluorin superecliptic (SEP)-ou outros constructos fluorophore-etiquetados13. Os receptores marcados com Sep podem ser particularmente úteis para estudar receptores expressos na superfície, pois este fluoróforo só fluorescência quando exposto ao meio extracelular. Como exemplos precedentes, as aproximações farmacológicas podem ser usadas, ou as mutações feitas no receptor, para determinar se estas mudam as características da expressão de superfície do receptor. No caso das drogas, a imagem latente da vivo-pilha pode ser usada para monitorar as modificações na expressão de superfície no tempo real. Uma limitação à imagem latente viva é a falta da introspecção mecanicista em mudanças na expressão de superfície. Por exemplo, uma expressão de superfície diminuída pode ser um resultado de uma maior internalização do receptor, redução da reciclagem de receptores ou ambos.

Para responder a esta pergunta, o protocolo descrito acima pode ser usado. Outro importante evento de tráfico que pode ser monitoria por meio de abordagens de imagem ao vivo é a difusão lateral de receptores entre diferentes compartimentos na membrana plasmática (por exemplo, entre sítios sinápticos e extrasynapóticos). Neste caso, a técnica de escolha é o uso de abordagens de rastreamento de partículas únicas em que um nanocristais de semicondutores de fluorescência [i.e., Quantum dot (QD)] é anexado a um anticorpo contra um epítopo extracelular na proteína de interesse. Os QDs são caracterizados pela estabilidade notável (permitindo muito menos photobranqueamento do que as proteínas fluorescentes tradicionais), brilho forte, e a alternância entre o status de ligar/desligar ("piscar"). Usando as configurações de microscópio apropriadas, é possível rastrear o movimento de um único QD (e, portanto, uma única proteína de interesse) através da membrana plasmática celular14.

O protocolo atual fornece uma examinação dos receptores na população de superfície, na população internalizada, e na população recicl, permitindo o cálculo das relações determinar como estes processos controlam a expressão de superfície total. Além disso, interromper os processos de internalização ou reciclagem em diferentes temporais acrescenta resolução temporal. Esse método, portanto, permite estudos de expressão de superfície espaciotemporal. Diferentemente das outras técnicas de imagem, os níveis de expressão endógena da superfície também podem ser estudados (por exemplo, AMPAR), desde que exista um anticorpo contra a porção extracelular do receptor. No entanto, como esse método requer a fixação de células, ele não é compatível com imagens de célula ao vivo e, portanto, não pode fornecer informações em tempo real.

Finalmente, as abordagens funcionais como a eletrofisiologia15 ou a imagem latente do cálcio16 são poderosas, embora frequentemente indiretas, maneiras de estudar a expressão de superfície dos receptores. Estes métodos baseiam-se na quantificação de alterações funcionais na célula após a ativação do receptor (por exemplo, alteração no potencial de membrana ou concentração de cálcio). Usando a farmacologia para isolar a resposta de um determinado receptor, esses métodos permitem estimar os receptores expressos na superfície celular de forma precisa e espaciotemporal. Estes métodos são versáteis e permitem o estudo de células em cultura e em condições mais fisiológicas ex vivo (por exemplo, fatias cerebrais agudas) e in vivo. No entanto, como no caso das abordagens de imagem ao vivo, a informação mecanicista é muitas vezes perdida ao usar abordagens funcionais.

Em resumo, uma combinação de técnicas para estudar a expressão de superfície do receptor pode ser empregada para compreender completamente como a expressão de superfície é controlada. O protocolo aqui apresentado é particularmente poderoso, pois fornece uma compreensão mecanicista da expressão de superfície espaciotemporal dos receptores em culturas primárias dissociadas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao centro noroeste de microscopia avançada para o uso do microscópio Nikon a1 confocal e sua assistência no planejamento e análise dos experimentos. Esta pesquisa foi apoiada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e um jovem investigador NARSAD Grant do cérebro & Fundação de pesquisa do comportamento (#24133) (A. S.-C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

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References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

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