Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Et antistoff fôring tilnærming til studier glutamat reseptor smugling i dissosiert primær hippocampus kulturer
Chapters
Summary August 2nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikkelen presenterer en metode for å studere glutamat reseptor (GluR) smugling i dissosiert primære hippocampus kulturer. Ved hjelp av en antistoff-fôring tilnærming til etiketten endogene eller overexpressed reseptorer i kombinasjon med farmakologiske tilnærminger, gjør denne metoden for identifisering av molekylære mekanismer som regulerer GluR overflate uttrykk ved modulerende internalisering eller resirkulerings prosesser.
Transcript
Cellulære responser på ytre stimuli er sterkt avhengige av settet med proteiner som uttrykkes på celleoverflaten i et gitt øyeblikk. Ifølge, antall, sub-cellulær lokalisering, og underenhet sammensetningen av disse proteinene er dynamisk kontrollert. Her vil vi bruke en antistofffôringstilnærming for å kvantifisere nivået av overflate uttryktreseptorer i cellekulturer, så lenge internalisering og resirkulering gjenopptas.
Dette er en svært allsidig protokoll, som gir mekanistisk informasjon om regulering av overflate uttryktproteiner. I vårt eksempel vil vi studere glutaminreseptorer i primære hippocampale nevroner. Denne protokollen kan tilpasses ethvert protein som har en anagen ekstracellulær epitop, hvis antistoffer ikke er tilgjengelige, kan transveksjon av merkede konstruksjoner være nyttig for både merking og studier av spesifikke mutasjoner.
I våre eksempler bruker vi antistoffer mot endogene GluA1, og tagget Glu12 B.To begynne denne prosedyren, overføre dekselet slips celle side opp til en parafin film dekket brett, for å lagre reagenser, og lette manipulasjon. Lagre og vedlikehold behold beholdte medier ved 37 grader Celsius for inkubasjon og vasketrinn. Inkuber cellene med primære antistoffer fortynnet i betinget media, ved romtemperatur, i 15 minutter.
Etter dette, bruk en vakuumpipette til å forsiktig aspirere av antistoffet som inneholder medier, og vask cellene tre ganger med betinget medium. Hvis du studerer overflate versus intracellulær reseptoruttrykk, fikser cellene med paraformaldehyd etter dette trinnet, som beskrevet i tekstprotokollen. Opprettholde cellene i betinget media uten antistoffer, og returnere dem til inkubatoren ved 37 grader Celsius for å tillate internalisering.
Hvis du studerer internaliseringsprosessen, må du fikse cellene med paraformaldehyd etter dette trinnet, som beskrevet i tekstprotokollen. For å blokkere epitopene på det primære antistoffet festet til overflaten uttryktreseptorer som ikke har blitt internalisert, inkubere celler med ukonjugert Fab anti-IgG antistofffragmenter fortynnet i betinget media, i 20 minutter ved romtemperatur. Etter dette vasker du cellene tre ganger med betinget medium.
Inkuber de vasket brønnene med besamte medier som inneholder 80 mikromolar Dynasore, ved 37 grader Celsius, for å tillate resirkulering av internaliserte reseptorer. Etter å ha fullført endringene på levende celler, vask cellene en gang med PBS pluss. Legg til en løsning på 4% paraformaldehyd og 4% sukrose i PBS til cellene, og inkuber i en røykhette ved romtemperatur i syv til åtte minutter, for å fikse cellene.
Vask deretter cellene tre ganger med vanlig PBS. Legg til en løsning på 10% Normal Goat Serum i PBS til cellene, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter, for å blokkere ikke-spesifikke bindingssteder. Deretter inkubere cellene med fluorescerende merket sekundært antistoff fortynnet i 3% NGS i PBS ved romtemperatur i en time, for å merke primære antistoffetikettreseptorer.
Etter dette vasker du cellene tre ganger med PBS. For å begynne å merke de intracellulære reseptorene, legg til en løsning på 0,25% TritonX i PBS, og inkuber ved romtemperatur i fem til 10 minutter, for å gjennomsyre cellene. Deretter blokkeres med 10% NGS ved romtemperatur i 30 minutter.
Hvis du studerer overflate versus total, inkuber cellene med samme primære antistoff som brukes tidligere, fortynnet med 3% NGS i PBS, ved romtemperatur i en time, for å merke intracellulære reseptorer. Deretter vasker du cellene tre ganger med PBS. Etikett med andre fluorescerende merket sekundært antistoff, fortynnet i 3% NGS i PBS, ved romtemperatur i en time.
Etter dette vask cellene tre ganger med PBS. Plasser først dekselslippene, cellesiden ned, på 12 til 15 mikroliter av riktig monteringsmedie for å montere cellene. Deretter bilde cellene på riktig confocal mikroskop, og analysere cellene som beskrevet i tekstprotokollen.
Denne protokollen for å studere glutamat reseptorhandel er basert på differensialmerking av reseptorer, uttrykt på celleoverflaten, og de som uttrykkes i interne membraner. Etter å ha fått konfokale bilder, kan det fluorescerende signalet enkelt kvantifiseres for å vise en økning i overflateuttrykk, i forhold til intracellulær populasjon, etter kjemisk LTP. Ingen signal for PSD-95 kan oppnås i ikke-permeabiliserte celler, noe som viser integriteten til plasmamembranen.
Dette indikerer at signalet oppnådd for overflaten GluA1 faktisk tilsvarer overflaten uttryktreseptorer. Viktigere, et minimalt signal for internalisert GluA1 kan observeres under ikke-permeabiliseringsforhold, noe som viser at alle overflateepiltoper er okkupert av den første runden med antistoffmerking. Reseptorer som er internalisert, identifiseres deretter.
Dette eksemplet fremhever at GluN2B fosforylering ved S1480 fremmer reseptor internalisering. Som fosfomimetisk mutant S1480E viste en mye høyere internalisering forholdet sammenlignet med vill-type reseptorer. Som forventet oppnås det ikke noe signal for internaliserte reseptorer i kontrollen.
Deretter identifiseres resirkulerte reseptorer og internaliserte reseptorer. Det genererte resirkuleringsforholdet viser at GluN2B S1480E ikke har noen effekt på NMDAR-resirkulering. I kontrollen kan et sterkt signal observeres for overflate uttrykt GluN2B i fravær av Fab blokkering.
Dette signalet forsvinner i Fab-behandlede kulturer, noe som viser at blokkeringsprotokollen er tilstrekkelig til å blokkere overflaten som uttrykkes fullstendig, og at overflatesignalene observert etter resirkulering faktisk tilsvarer reseptorer som er smuglet tilbake til plasmamembranen. Den nåværende protokollen er bare en av metodene som er tilgjengelige for å studere regulering av overflate uttryktproteiner. Andre tilnærminger kan tas for å utvide eller verifisere dataene som er innhentet her.
Disse inkluderer biokjemiske metoder, som biotinylering, livsavbildningsteknikker eller funksjonelle tilnærminger, som elektrofysiologi eller kalsiumavbildning. Vi bruker PFA til å fryse lokaliseringen av reseptorer, men PFA er et kjent kreftfremkallende stoff, så det er viktig å utføre trinn ved hjelp av PFA under en røykhette, mens du bruker passende PPE.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
