מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Svec, K. V., Patterson, J. B., Naim, N., Howe, A. K. Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events. J. Vis. Exp. (150), e59995, doi:10.3791/59995 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Durotaxis היא התהליך שבו התאים חשים ולהגיב מעברי מדרגות של מתח. כדי ללמוד את התהליך הזה בתוך מבחנה, הנוקשות של המצע שבבסיס תא חייב להיות מניפולציות. בעוד הידרוג'לים עם נוקשות מדורגת הגירה ארוכת טווח הוכיחה הוכיחו שימושי במחקרים durotaxis, מיידית, התגובות אקוטי שינויים מקומיים במתח המצע לאפשר מחקר ממוקד של תנועות תאים בודדים ו subcellular האירועים איתות. כדי לבחון באופן מובן מאליו את היכולת של תאים לחוש ולהגיב קשיות המצע הבסיסי, שיטה שונה עבור יישום של מעברי צבע חריפה של מתח מוגבר לתאים בודדים תרבותי על deformable הידרוג'לים משמש אשר מאפשר בזמן אמת מניפולציה של כוח וכיוון של מעברי צבע נוקשות הנחיתעל התאים המדובר. בנוסף, בסדר כוונון הפרטים והפרמטרים של המילוי, כגון הצורה והממדים של המיקרופיפטה או המיקום היחסי, המיקום והכיוון של הדרגתי המוחל, ניתן למטב את האפשרות למחקר של כל מכני סוג תא ומערכת רגישים. פרמטרים אלה ניתנים לשינוי כדי לשנות באופן אמין את הגירוי שהוחל ולהרחיב את הפונקציונליות ואת הרב-תכליתיות של התיקון. שיטה זו מאפשרת בדיקה של תנועת durotactic ארוכת טווח, כמו גם שינויים מיידיים יותר של איתות סלולרי ודינמיקה מורפולוגית בתגובה נוקשות שינוי.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, חשיבותו של התכונות המכאניות של סביבת התא צברה הכרה גוברת בביולוגיה של התא. רקמות שונות מטריצות מסחטות יש מאפיינים שונים היחסיים, כמו תאים להעביר ברחבי הגוף, הם מנווטים שינויים אלה, באמצעות תכונות מכניות אלה כדי להנחות אותם1,2,3 , ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. תאים להשתמש הנוקשות של רקמה נתונה כדי להודיע על התנהגות נעים שלהם במהלך תהליכים כגון פיתוח, פצע ריפוי, סרטן גרורות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המאפשרים תחושת ותגובה לתשומות המכאניות הללו נותרו בעיקר בלתי ידועים1,2,3,4,5, מיכל בן 6 , 7. לאחר מכן

על מנת ללמוד את המנגנונים שדרכם תאים להגיב לרמזים סביבתיים פיזיים, קשיחות או נוקשות של המצע התאים המשמשים לטיפול בתאי מטופל חייב להיות מניפולציות. בשנת 2000, Chun-Min Lo, יו-לי וואנג ועמיתיו פיתחו שיטת הפעולה8 לפיה התגובה של תא בודד מורצפת לשינוי רמזים מכניים יכול להיבדק ישירות על ידי מתיחת מטריצה deformable המגולוון (ecm) מצופה אלקטרופורזה הידרוג'לים שבהם התאים היו מצופים. התאים מוצגים בהעדפה משמעותית למעבר לכיוון מצעים של סטיפר, תופעה שכונתה "דורוקמוניות".

מאז הדו ח המקורי ב 2000, טכניקות רבות אחרות המועסקים לחקר durotaxis. מעברי הקשיות הקשים מיוצרים על ידי השלכת ג'לים על תכונות נוקשות כגון פוליסטירן חרוזים9 או הודעות פולימר נוקשה10 או על ידי פולימריות המצע סביב הקצוות של שמיכות זכוכית11 כדי ליצור מכני ' צעד-גבולות '. לחילופין, הידרוג'לים עם רדודים אבל מעברי קשיות קבוע כבר מפוברק על ידי מגוון של שיטות כגון מעברי החוצה של crosslinker קשר שנוצר על ידי התקנים microfluidic12,13 או זה לצד-ידי צד הידרוג פתרון טיפות של נוקשות שונים8, או הידרוג ' ו עם פוטוראקטיבית crosslinker קשר מטופלים עם חשיפה אור UV מדורגים ליצור קשיות ליניארי מעבר הצבע14,15. טכניקות אלה שימשו השפעה רבה כדי לחקור את התנועה התאית durotactic en המסה לאורך זמן. עם זאת, בדרך כלל תכונות אלה מפוברק מראש של ציפוי התא המאפיינים שלהם נשארים עקביים במהלך הניסוי, הסתמכות על תנועה אקראית אקראי לדיגום של מעברי צבע מכניים. אף אחת מהשיטות הללו אינה קלה להתבוננות בשינויים מהירים בהתנהגות התאית בתגובה לגירוי מכני חריף.

כדי להתבונן בתגובות הסלולר לשינויים חריפים בסביבה המכנית, היחידה הניידת מציעה מספר יתרונות. בעלי התכונות האלה, תאים בודדים מקבלים גירוי מכני חריף על ידי משיכת המצע הבסיסי הרחק מתא עם מיקרופיפטה זכוכית, ובכך מציג מעבר כווני של מתח תא מטריקס. שינויים בהתנהגות המוליכה, כגון מהירות או כיוון הגירה, נצפו לאחר מכן על-ידי מיקרוסקופ ניגודיות בפאזה חיה. גישה זו מקלה על התבוננות ישירה של הגורם וההשפעה בין גירויים מכניים להעברת תאים, כיוון שהיא מאפשרת מניפולציה מהירה ואיטרטיבית של הכיוון והגודל של המתח הדרגתי והערכת הסוגר תגובות הסלולר בזמן אמת. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש גם לעירור מכני התאים המבטא היתוך פלורסנט חלבונים או אנלייזרים להמחיש שינויים בכמות, פעילות, או לוקליזציה subcellular של חלבונים החשודים להיות מעורבים בתהליך המכונה ו . מונית מדבר

טכניקה זו הועסק על ידי קבוצות אשר לומדים durotaxis8,16 והוא מתואר כאן כפי שהוא הותאם על ידי המעבדה האו ללמוד את ההתנהגות durotaxis של סקוב-3 תאים סרטניים בשחלות ואת המנגנונים המולקולריים ש מוניות מתחתלגיל 17 בנוסף, שיטה ששונתה מתוארת לייצור הידרוג'לים עם שכבה אחת, אפילו של מיקרוספירות פלורסנט ליד פני השטח של תרבות התא; זה מקל על ויזואליזציה ואופטימיזציה של מיקרופיפטה שנוצר מעברי הלחץ והוא עשוי לאפשר הערכה של הקונקטיקות התא על ידי כוח המתיחה מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור פוליאקרילאמיד הידרולים עם מיקרוספירות פלורסנט מוטבעות

הערה: כיוונים מתארים פולימריזציה של 25 kPa הידרוג'ל כי הוא 22 יקרומטר קוטר ו כ 66 יקרומטר עבה. כל אחד או כל הפרמטרים האלה יכול להיות שונה והוראות לעשות זאת ניתן למצוא בטבלה 1 ובהערות17.

  1. הפעלת מנות בתחתית זכוכית או שמיכות
    1. הכן את פתרון העבודה לאגד silane להפעלה של צלחת הדמיה זכוכית התחתון או שמיכות המתאים לתוך תא חי הדמיה. לערבב 950 μL של 95% אתנול, 50 μL של חומצה אצטית קרחוני, ו 5 μL של איגוד silane (y-מתיונין מתיונין).
      הערה: באמצעות שמיכות תחתון גדול יותר בהשוואה coverslip העליון ייתן מקום נוסף לעבוד בעת הכנת ג'ל ויקל על מיקום מיקרופיפטה זכוכית בשלבים מאוחרים יותר. כמו כן, אם באמצעות שמיכות במקום צלחת הדמיה זכוכית בתחתית, לנקות את שמיכות כפי שמתואר בסעיף הבא.
    2. הפעל את פני השטח של הזכוכית עבור 20 s עם שרביט קורונה ומיד כיסוי 50 μL של פתרון העבודה לאגד silane. אפשר לפתרון להתייבש במשך 10 דקות.
    3. לשטוף פעמיים עם 95% אתנול, ולאחר מכן פעמיים עם איזופנול ולאחר מכן לאפשר את שמיכות כדי airdry עבור כ 20 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן זכוכית מופעלת עד שבוע אחד בdesiccator.
  2. ניקוי כיסוי עליון
    1. נקיון 22 מ"מ שמיכות top על-ידי דגירה ב 2% HCl ב 70 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב-ddH2O עבור 10 דקות שתי פעמים.
    2. דגירה הכיסויים בתמיסה של 2% קובט ניקוי הריכוז ב ddH2O ב 50 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב-ddh2o עבור 10 דקות שתי פעמים.
    3. מודג את שמיכות ב ddH2O ב 90 ° c עבור 30 דקות, אז ב 70% אתנול ב 70 ° c עבור 10 דקות, ולאחר מכן האוויר יבש ב 60 ° c עבור מינימום של 2 h.
      הערה: שמיכות מנוקה ניתן לאחסן ללא הגבלה בdesiccator נקי.
  3. מיקרוספירה פלורסנט/התצהיר חרוז על שמיכות העליון
    1. Sonicate את פתרון המניה של מיקרוספירות פלורסנט עבור 1 h באמבט מים אולטרה סאונד. לעשות פתרון חרוז עובד על ידי דילול מלאי חרוז 1:200 ב 100% אתנול ו sonicate שוב עבור 1 h.
    2. 15 דקות לפני הפתרון חרוז סיים sonicating, ביסודיות לנקות את הכיסויים על ידי הצבת אותם אנכית במחזיק שמיכות קרמיקה לטפל עם האוויר החדר פלזמה עבור 3 דקות מנקה שולחן פלזמה.
    3. כדי להקל על הטיפול ולמנוע החלקה של שמיכות במהלך השלבים הבאים, מניחים פיסת parafilm במכסה צלחת פטרי 60 מ"מ או מכולה דומה. מניחים את הכיסויים במיצב ומקישים קלות למטה, ומבטיחים מגע טוב בין הפראפilm לבין הכיסויים.
    4. עבור שמיכות 22 מ"מ, להוסיף 150 μL של פתרון חרוז העבודה לחלק העליון של coverslip. מיד מוריד את פתרון האתנול מהצד של העטיפות, ומשאיר את החרוזים על שמיכות. . הניחו לכיסויים להתייבש
      הערה: כמות הפתרון חרוז עבודה שנוסף צריך להיות ~ 4 μl/cm2 ניתן לשנות את קנה המידה כדי להכיל שמיכות גודל.
  4. יציקת הידרו-ג'לים עם חרוזי פלורסנט מוטבעים
    1. הכינו את תמיסת ההידרוג'ל לאקרילאמיד ו-bis-אקרילאמיד. לערבב את הפתרון לפי טבלה 1, ולאחר מכן להוסיף 2.5 μl של 10% APS ו 0.5 μl של temed. . תערבב היטב . מייד מעבר לשלב הבא
      הערה: ניתן לשנות את תערובת ההידרוג'ל כדי לשנות את המודוללי של הצעירים, או נוקשות, של ההידרוג'ל, על ידי שינוי היחס של אקרילאמיד ל-bis-אקרילאמיד כפי שמוצג בטבלה 1. ערכים אלה אומתו לשימוש במעבדה האו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, אך יש לאשרו במסגרת המוסד.
    2. מיד לאחר ביצוע הפתרון הידרוג'ל, להוסיף 25 μL ירידה אל הצד המופעל של הצלחת זכוכית תחתית או coverslip התחתון, ולאחר מכן מיד למקם את עטיפת מצופה חרוז על הפתרון, החרוז בצד למטה. יצירת קשר עם הירידה עם הצד הרחוק של שמיכות ואחריו הפחתת איטי מסייע למנוע השמנה בועות אוויר בתוך ההידרוג'ל.
      הערה: גובה ההידרוג'ל צריך להיות גם בטווח העבודה של העדשה האובייקטיבית לשימוש בניסוי המאוחר. גובה הידרוג'ל של 66 יקרומטר עובד היטב עבור רוב המערכות. ניתן לשנות את גודל ההידרוג'ל באמצעות הוספת תמיסת הידרוג'ל פחות או יותר בהתאם לגודל הכיסויים. כדי לחשב את הנפח המתאים של הידרוג'ל פתרון, השתמש במשוואה עבור נפח של גליל, V = πr2h שבו r הוא רדיוס coverslip ו- h הוא גובה ההידרוג'ל הרצוי. בדרך כלל, חישוב זה מנבא בדיוק הוגן את הגובה בפועל של הידרוג'ל, כפי שנמדד על ידי הכנת ג'ל עם חרוזים מצופה שמיכות על העליון והתחתון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד למדוד את המרחק בין שני מטוסי חרוז. עם זאת, זה כבר נצפתה כי הגובה בפועל של הידרוג'ל יכול לסטות מהחישוב זה על ידי ± 20 יקרומטר (למשל, בהתאם לעובי והיצרן של שמיכות זכוכית העליון). מומלץ למדידה ישירה של גובה ג'ל באמצעות השיטה המתוארת לעיל.
    3. לאפשר ג'ל פולימלזציה עבור 30 דקות, ולאחר מכן להסיר את שמיכות העליון בעדינות עם מלקחיים. הוספת 50 mM HEPES pH 8.5 התבשיל יכול להקל על ההסרה. לשטוף עבור 5 דקות ב 50 mM HEPES pH 8.5 שלוש פעמים.
  5. מטריצה הידרוג'ל וציפוי מטריצות
    1. הפעל את משטח ההידרוג'ל על-ידי דגירה ב 0.4 מ"מ Sulfo-SANPAH (sulfoסוכות cinimidyl 6-(4 '-azido-2'-ניטרופניאמינו) הקסאנואט ב 50 מ"מ HEPES pH 8.5. לחשוף מיד למנורת קשת UV באזור סגור.
      הערה: הגנה על SULFO-sanpah מאור לפני ההפעלה. עבור מנורת 400 W, מיקום ג'ל 10 ס מ מן הנורה בתוך תיבת האור ולהאיר עבור 100 s. הפתרון Sulfo-SANPAH ישתנה מכתום בהיר לחום כהה.
    2. לשטוף עבור 5 דקות ב 50 mM HEPES pH 8.5 שלוש פעמים.
      הערה: ניתן לאחסן ג'ל רטוב ב -4 ° c עד שבוע אחד.
    3. מודלת את ההידרוג'ל שהופעל ב -20 μg/mL fibronectin ב 50 mM HEPES pH 8.5 עבור 1 h ב 37 ° c.
    4. מפחית את תמיסת הפילברון ומכבסת 5 דקות בתמיסת מלח (PBS) שלוש פעמים. לחטא את ההידרוג'ל ואת המכסה של המנה עבור 15 דקות תחת אור UV במכסה של תרבות רקמה עם נפח נמוך של PBS. שטוף פעם אחת. בערוץ הPBS הסטרילי
      הערה: ניתן להשתמש בסוגים אחרים של חלבון ecm לתפירת ההידרוג'ל, כולל קולגן ומלמינציה.

2. ציפוי תאים

  1. הוסף 3 מ ל של מדיה המכילה 21,000 תאים כדי למלא צלחת 60 מ"מ עבור צפיפות התא הסופי של ~ 1000 תאים/cm2. התאימו את צפיפות הזריעה בהתאם לצורך, כדי למנוע את הצפיפות ולאפשר תנועה חופשית של תאים בודדים.
  2. אפשר לתאים להתאושש ב-37 מעלות צלזיוס ללפחות 4 שעות עד 18 שעות לפני ההדמיה. התכונן לדימות על ידי שטיפה עם מדיית דימות פעמיים לפני הוספת מדיית דימות. אפשר לתאי השפה לעבור לפחות 30 דקות לפני הדמיה.
    הערה: תנאי מדיית המסך מראש כדי לקבוע תנאים שימטב את ההעברה בתא התאים בשימוש. עבור התאים סקוב -3, DMEM זיכרון ללא פנול אדום, המכיל 20 מ"מ HEPES ו 12.5 ng/mL גורם גידול באפידרמיס מעוררת את ההגירה ביותר. תנאים אופטימליים עבור תאים Ref52 הם מאגר של המצלצל עם 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו -25 ng/mL-גורם הגדילה הנגזר.

3. הכנת מיקרופיפטה מזכוכית: פיפטה מושך ומנפח

  1. משוך 100 מ"מ ארוך בורוסיליקט זכוכית מיקרופיפטות עם 1.0 מ"מ החיצוני, 0.58 מ"מ קוטר הפנים בתהליך של שני שלבים כדי לקבל להתחדד מעל 2 מ"מ שמפחית ל ~ 50 יקרומטר ב מילימטר הראשון ומרחיב לארוך, מקביל 10 יקרומטר קוטר צינור במילימטר האחרון.
  2. . העמסה משכה לתוך מיקרופורג הצורה pipet יש 15 יקרומטר טיפ הבלית כי הוא מוקף בקצה מאוד של 250 יקרומטר סעיף כפוף בזווית ~ 35 ° משאר pipet. הקוטר המשוער על העיקול צריך להיות סביב 30 יקרומטר כדי להלוות כוח לקצה.
    הערה: להתחדד ומידות עצה ניתן לכוונן כדי להחיל כראוי כוח רצוי (ראה שלב 5). משיכת מיקרופיפטות ב 65 ° c לצעד הראשון במשך 3 מ"מ, ו 60 ° c עבור השלב השני מייצרת את הממדים המתוארים בשלב 3.1. תוצאות באמצעות pipet שונים עשויים להשתנות.
  3. לחטא את המיקרופיפטה ב-70% אתנול לפני השימוש.

4. מיקום המיקרומניפולציה והמיקרופיפטה

  1. להסיר את מכסה הכלים ולטעון את הצלחת על הבמה מיקרוסקופ מרכז. השתמש ביעד הגדלה בגודל 10X או באופן דומה. לכסות את התקשורת עם שמן מינרלי כדי למנוע אידוי של התקשורת.
  2. הכנסת משכה בפיג
    1. הכניסו את הפטה המותפס למעטפת המיקרופיפטה, והצביעו על הקרס לכיוון המנה. קצה הקרס יהיה הנקודה הנמוכה ביותר כאשר הנמיך לג.
    2. הכנס נדן למיקרומניפולציה והתאם עד שהקצה של הפייפט ממורכז מעל העדשה האובייקטיבית בכיוונים של X ו-Y.
    3. הנמך את הדלי באמצעות מניפולטור גס עד שהוא נוגע במשטח הנוזל.
  3. שימוש בניגוד פאזה או ברייטפילד, למקד את המיקרוסקופ על שכבת חרוז בחלק העליון של ג'ל. . זה יהיה מטוס הייחוס
  4. להבטיח כי המטרה היא לא בסכנה להכות את המדגם או הבמה, להביא מיקוד מעל ג'ל כדי למצוא את קצה המיקרופיפטה, באמצעות התאמות קטנות של מניפולטור גס בכיוונים X ו-Y להטיל צללים על המטוס המוקד. רק הנמך את המיקרופיפטה כאשר בטוח שקצהו של הפיידפט נמצא בשדה הראייה.
  5. ודא כי הקצה הקהה של המיקרופיפטה מצביע למטה על-ידי סיבוב העוגה במעטפת או סיבוב הנדן במיקרומניפולציה עד שהקצה ניצב למישור המוקד. חזור על שלבים 4.4 ו-4.5 לפי הצורך. . תתמקד בקצה העוגה
  6. להתמקד בחזרה אל שכבת חרוז העליון של ג'ל כדי למדוד כמה רחוק pipet הוא משטח ג'ל. התמקד בחזרה למישור המהווה חלק בין הג והקצה של הפייפט. הורידו באיטיות את הפייפט כדי להגיע למישור התווך המתווך.
  7. חזור על השלב 4.6 עד שניתן יהיה להעריך את הצללים החלשים מקצה המיקרופיפטה בעת התמקדות בהידרוג'ל. הגדל להגדלה הגבוהה ביותר הבאה.
  8. הנמך את המיקרומניפולציה עד שהצללים והשברים של קצה מאוד של המיקרופיפטה יכולים להיות מוערכים בתוך מטוס מוקד של שכבת חרוז.
  9. הגדילו את ההגדלה לדבר שישמש בניסוי. הורידו את הפייפט עד שהוא מרחף מעל פני המים של ההידרוג'ל.

5. כיול המיקרומניפולציה ויצירת הכוח

  1. בשלב או ברייטפילד, הנמך את מיקרופיפטה הריחוף כדי לגעת במשטח של ההידרוג'ל. שים לב איך הפייפט מסתכל. על מגע עם ההידרוג'ל המשיכו להוריד את המיקרופיפטה ב-Z עד שהתאמות X ו-Y יגרמו למשיכת והטיה של ההידרוג'ל בכיוונים אלה. השתמש במיקרו-כדורים או בתאים הסמוכים כסימני נאמנות.
    הערה: אם המיקרומניפולציה מחוברת לזרוע העבה של השלב או לספסל ולא לשלב המדגם עצמו, יש לנתק תמיד את הג לפני הזזת הבמה כדי להימנע משבירת התאים המקבתיים או המטריד. , אם הפייפט ישבר. חזור לשלב 3 וצעד 4
  2. מצא אזור נטול תאים לעסוק ג'ל. משוך את זה לכל הכיוונים ולהרגיש בנוח עם הדרך מתרגמת המיקרומניפולציה לדפורמציה של ג'ל.
  3. לקחת תמונות פלורסנט של שדה חרוז ללא מניפולציה, עם pipet העוסקים ג'ל, עם pipet מעורב מושך את ג'ל. חזור על זה מספר פעמים לקחת הערות טובות לגבי סימוני השנתות על המיקרומניפולציה, הדרך שבה הקצה הפייפט נראה בשלב או ברייטפילד בכל שלב של משיכה, ומרחק הטיפ זז באמצעות מניפולציה זו.
  4. השתמש imagej כפי שתוארה בעבר16,17 כדי לחשב displacements חרוז יחסי כוח להחיל את החרוזים על ידי השוואת שדה החרוז null לשדה חרוז ללא התחייבות pipet, שדה חרוז עם ג'ל מעורב, ואת ה . משכתי ג'ל
  5. כדי לכוונן את הגירוי הטסטריתי, השוו את יישום הכוח באמצעות מידות עצה מיקרופיפטה שונות, מרחקים מתא, או מרחק שנשלפו על ידי המיקרומניפולציה מנקודת הנחיתה הראשונית. ההשפעה של ממד טיפ מיקרופיפטה ביישום הכוח מעניקה גמישות רבה למשתמש, אך גם ממחישה את הצורך ליצור מפות כוח עבור מיקרופיפטות חדשות, גם כאשר הממדים והצורה דומים מאוד לטיפים מכויל קודם לכן.

6. ניהול שיטת הדורוקוניות

  1. לפני ביצוע הניסוי, לתרגל לטפח את הג ליד תא ולראות את הדפורמציה של התא כאשר המיקרומניפולציה ממקם את מיקומן.
  2. נטר קבוצה של תאים בעלי קוטביות ברורה ונראה שהוא נע במשך 30 דקות כדי לזהות תאים הנעים באופן מונחה.
  3. בחר תא העובר בכיוון יחיד וברור ונטר אותו בקצב המסגרות הרצוי עבור 30 דקות נוספות.
  4. במידה וקביעת הכוחות המופעל על התא או המתח המופעל על ידי התא רצוי, לכידת תמונות שדה חרוז בכל רכישה. אם התא משנה את מסלול הכיוון שלו במהלך הניטור, לבחור תא אחר לפקח כמו זה יהיה קשה לקבוע את ההשפעה של גירוי.
  5. הפעילו את ההידרוג'ל כ-50 יקרומטר מהתא. הצב את המחיית מחמד לפני הצד הקרוב של הקצה המוביל והזז את המיקרומניפולציה כך שהג מעוות ומעוותים לכיוון התא של הנסיעה. לראות את התא לאורך זמן כפי שהוא מגיב הדרגתי, המעבר המקומי של נוקשות.
    הערה: התזמון המסופק כאן הוא יעיל כאשר ניטור SKOV3 או Ref52 פיברותקיעות, אולם, את המרווח ואת הזמן הכולל המסלול צריך להיות מותאם להתאים את סוג התא ואת האירוע הביולוגי להיות נצפתה. אם זיווג עם מיקרוסקופ ניאון, השהה את רכישת פלורסנט מיד לפני שלב 6.5., השתמש בניגוד פאזה או ברייטפילד למיקום מיקרופיפטה ומשוך, והפעל מחדש את רכישת פלורסנט מיד לאחר מכן.
  6. אם הפייפט מחליק או אם המעבר נינוח או משוחרר באופן אחר, מצא תא חדש על-ידי שלבים חוזרים 6.2 ו-6.3.

7. קביעת תגובת ההגירה הדוטוטקטיקה

  1. באמצעות ImageJ19 או תוכנית אחרת לניתוח תמונה, חשב את זווית הסיבוב על-ידי ציור קו בין אמצע הקצה המוביל של התא ב-0 דקות ובין שלושים דקות לצג (המשקף את הנתיב המקורי של התא) ושורה נוספת בין אמצע הקצה המוביל בדיוק לפני ו 80 דקות לאחר גירוי ומדידת הזווית בין שתי השורות האלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על-ידי הכנת מיקרופיפטות (איור 1) ונרמול דור הכוח של מושך (איור 2 ואיור 3) כפי שמתואר לעיל, זוהו תנאים מיטביים של הדוטקטקטיקה לקווי תאים מרובים. באמצעות טכניקה זו, כפי שמתואר באיור 4, שניהם סקוב-3 בתאי סרטן השחלות17 ו Ref52 עכברים עובריים מתחלקים (איור 5) לנוע לעבר נוקשות מוגברת במעברי צבע שהוחלו על ידי מיקרופיפטה זכוכית. בנוסף durotaxis, שיטה זו ניתן להשתמש כדי לחקור את האירועים איתות דינאמי באמצעות ביוחיישנים פלורסנט סמנים. לדוגמה, המבנה של והאיתות בתוך מבנים הדבקה מוקד ניתן לצפות על גירוי durotactic. חיישן המתח של vinculin (VinTS) הוא ביוסנסור מבוסס-סריג, המאפשר תצפית פלואורסצנטית של דינמיקת הדבקה מוקד ומדידת שינויים במתח בתוך אותם מבנים19. Ref52 תאים המבטא בצורה מלאה vints על 125 kPa אלקטרופורזה ג'לים להראות את היווצרות של הידקויות מיקוד בכיוון של למתוח על פני תקופה של 40 דקות (איור 6a). הניתוח מצביע על20 מראה כי vinculin מקומי הידעיות מיקוד חוויות שינוי מיידי במתח כאשר מוצג עם גירוי durotactic חריפה (איור 6b) הרחבת השירות של הטיפול הזה להתבוננות של subcellular איתות אירועים בתגובה גירוי durotactic.

Figure 1
איור 1. דיאגרמות של (א) ומיקרופיפטות (ב) מזויפים. (א) מיקרופיפטות משכו באמצעות פרוטוקול דו-שלבים להשגת להתחדד מ 1 מ"מ עד 10 יקרומטר מעל 2 מ"מ. (ב) micropipettes נטען לתוך מיקרופורג והטיפים שלהם הם כפוף, מוקף, מקוצר כך האחרון 250 יקרומטר של ה מיקרופיפטה הוא כפוף בזווית ~ 35 ° ו נרות מ ~ 30 יקרומטר לקצה מעוגל המודד ~ 15 יקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. שדה חרוז משופר לאחר ציפוי אתנול לעומת השיטה המסורתית באמצעות פולי-L-ליזין. נציג הידרוג'ל שדות חרוזים מ פולי ליזין ו אתנול (אטוח) האידוי שיטות ציפוי שמיכות באמצעות צהוב ירוק, אדום, וכהה חרוזי פלורסנט אדום. סרגל קנה מידה: 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. הדור של מפת הכוח למתיחה לדוגמה durotactic. (א) מיקום של מיקרוספירות פלורסנט לפני ואחרי (ירוק בצבע ואדום, בהתאמה) המאדימים את ההידרוג'ל עם מיקרופיפטה (הנמצא מעבר לקצה הימני של הפאנל). סרגל קנה מידה: 25 μm. וקטורים הזחה (ב) ו הזחה החום מפה (ג) בין null ומשכו שדות חרוז שנוצרו על ידי תוספים כוח המתיחה מיקרוסקופ ב imagej להדגיש את הדרגתי של הטיה חרוז ומתח הידרוג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. סכמטית של שיטת הדורומוניות וקביעת זווית הסטה. (א) תא נצפה לפחות 30 דקות כדי לקבוע את המסלול המקורי שלו. (ב) המיקרופיפטה ממוקם אורתוגונאלי אל מסלול התא, 50 יקרומטר מקצה התא. ההידרוג'ל מעורב במיקרופיפטה כך שהזזת המיקרופיפטה תפעיל כוח על פני ההידרוג'ל. (ג) המיקרופיפטה משכו במרחק 20 מטרים נוספים מהתא, מכוון אל מסלול התא היוצר מעבר מקומי חריף של מתח (מסומן בכחול) המגביר את המיקרופיפטה. (ד) התא נצפה לאורך זמן כאשר הוא מנווט את מעבר הצבע שהוחל. (E) ב-imagej או בתוכנית ניתוח תמונה, הנתיב המקורי (קו מקווקו) מסומן על-ידי קו שצויר מאמצע התא דרך מרכז הקצה המוביל במסגרת הראשונה. המסלול הסופי (קו מלא) מסומן על-ידי קו שצויר לאחר שהתא מותר לנווט במעבר הצבע של המתח שהוחל. הזווית בין שתי השורות האלה לקראת גירוי נקרא "להפוך זווית," מסומן כאן על ידי θ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. חולדה עובדיתקיעות לנוע לכיוון אזורים של קשיות המצע מוגבר ב durotaxis. קורס זמן מראה תנועה durotactic של תא Ref52 10 דקות לפני המשיכה (פאנל 1), 1 דקות לפני המשיכה (פאנל 2), בזמן משיכה (פאנל 3), ו 1 h לאחר משיכה (פאנל 4). חץ מציין את כיוון המתיחה. סרגל קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. לוקליזציה של חלבון ופעילות במהלך גירוי באמצעות שימוש בסמני פלורסנט או ביוחיישנים. Ref52 תאים המבטאים בסיפוק חיישן מתח של Vinculin (VinTS)19 הגירה על 125 kPa פוליאקרילמיד ג'ל מוצגים עם גירוי durotactic חריפה. (א) לאחר גירוי, מיקוד חדש טופס הצורה בכיוון של למתוח כמו תאים מחדש המזרח לאורך מעבר הנוקשות. עבור 2 10 דקות, החל מ -20 דקות לפני גירוי מכני ו -21 דקות לאחר גירוי, מורפולוגיה תא (למעלה) והיווצרות הדבקה מוקד (למטה) היו מנוטרים. הצבע האדום מציין את נקודת הזמן הראשונה בתוך התקופה וצבע ירוק מציין את נקודת הזמן 10 דקות מאוחר יותר. הידקויות מיקוד חדשות שנוצרו במהלך 10 דקות מוצגות בירוק. לפני גירוי, הידקויות מיקוד חדשות לכיוון הנסיעה. לאחר גירוי, הידקויות מיקוד חדשות לכיוון המתיחה. החץ מציין את כיוון המתיחה. ראשי חץ מצביעים על אזורים עם הידקויות מיקוד שנוצרו במשך התקופה הזאת של 10 דקות. סרגל קנה מידה: 25 μm. (ב) הניתוח התחבירי של הקרינה הפלואורסצנטית מעיד על שינוי במתח בתוך הידעיות הנמצאות מתחת למתיחה הדירופטיק. חלוקה לרמות של קרום התא לפני ואחרי למתוח עיוות האור של התא על הגירוי. ראשי חץ מצביעים על דוגמאות של הידקויות מיקוד החווה שינויים ביחס הסריג בעת המתיחה. סרגל קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קשיות הידרוג'ל רצוי 3 מאלה מיכל שלמה 125
7.5% אקרילאמיד 100 מיקרומטר 100 מיקרומטר 160 מיקרומטר
0.5% Bis-אקרילאמיד 10 מיקרומטר 100 מיקרומטר 100 מיקרומטר
ddH2O 287 מיקרומטר 197 מיקרומטר 137 מיקרומטר

. שולחן 1 מוצרי אקרילמיד ג'ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפגינו כאן היא מערכת הניתן לשחזור, תא בודד שיטת הפעולה המאפשרת הערכה של היכולת של התא לשנות את התנהגותו הגירה בתגובה רמזים מכניים חריפה. טכניקה זו יכולה לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית וחלבונים היתוך המתאים או אנלייזרים לבחון את האותות הסלולריים והשלד האירועים בתוך שניות של גירוי מכני או על ציר זמן ארוך יותר במהלך . תנועת הדורובוטיק הבנת מערכת היחסים של התא לסביבתו כרוכה בחקר ההשפעה של ההיבטים הכימיים והמכניים של אותה סביבה. למרות שקשה מאוד לשלוט ביכולות האלה, ניתן להשתמש בו באופן נרחב כדי להבין את התגובה התאית לשינויים בסביבה המכנית.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

כפי שהוזכר בעבר, זו שיטה מבוססת micropipette של גירוי manipulable מאוד, המאפשר רמה גבוהה של שליטה הרקתית על גירויים מכניים, יתרון גדול על טכניקות אחרות, כגון מראש בנוי ליניארי או צעד-מעברי של קשיחות. את הגודל ואת הכיוון של מעברי הצבע להתאמץ ניתן לדמיין על ידי מעקב אחר העקירה של חרוזי פלורסנט מוטבע הידרוג'ל, ליד משטח התרבות התא.

הגבלת סמנים fiducial אלה לשכבה אחת מתחת למשטח התרבות מגבירה את הדיוק של מעקב זה. מיקרוספירות הממוקמות מתחת למישור הטיה (הניתן על-ידי המיקרופיפטה או, עבור מיקרוסקופ כוח המתיחה, על-ידי הוראות הסלולר), כפי שקורה עם ערבוב המיקרוספירות באופן שווה במהלך ההידרוג'ל, יזוז פחות מהמטוס מיקרוספירות, שיכולות להוביל לחוסר הערכה של כוחות שהוחלו. כמו כן, שינוי זה קל יותר לבצע ואמין יותר מאשר שיטות בהן מצופה חרוזים בשכבה דקה ביותר של אלקטרופורזה יצוק על גבי ג'ל שנוצר מראש21 או הביא למשטח ההידרוג'ל על ידי בסיוע הכבידה להתיישב22 ומייצרת גם פיזור של חרוזים על פני ההידרוג'ל מאשר שיטות שתוארו בעבר17,23.

שינויים ויישומים עתידיים

ניתן לשנות את הפרטים הספציפיים של שיטת הפעולה כדי להתאים את קו הריבית הסלולרי. לדוגמה, מגוון של מולקולות מטריצות של מטריקס (לדוגמה, קולגן I, קולגן IV, למינציה) או ליגניות דבק אחרות ניתן להשתמש כדי לתפקד על ההידרוג'ל. כמו כן, הקשיות ההתחלתי של ההידרוג'ל ניתן לגדל או להנמיך בקלות על ידי כוונון היחס של אקרילאמיד כדי bis-אקרילאמיד (לראות את שולחן 1). על ידי שינוי הממדים של הטיפ מיקרופיפטה ואת סדר הגודל של המשיכה, שיטה זו יכולה להיות ממוטבת כדי להקנות גירוי לשחזור ואפקטיבי של סוג התא המדובר.

שלבים קריטיים ופתרון בעיות

רק תאים בעקבות מסלול קבוע, ליניארי של הגירה לפני טיפול הידרוג'ל צריך להיות מגורה כדי להבטיח כי שינויים במסלול הם בשל גירוי מכני ולא תנודות אקראיות. יש לקחת את הטיפול כדי להמציא מיקרופיפטה מזכוכית שעוסקת במשטח ההידרוג'ל מבלי לחמוק, אך לא לקרוע את הג כאשר משכו. חשוב להחיל מתיחה קבועה וקבועה על ההידרוג'ל במהלך הניסוי כדי לקבל תוצאות נקיות, כלומר המשתמש צריך להיות מתרגל בהנחה והזזת המיקרופיפטה לפני שנתקלת בתא. כל תנועה של המיקרופיפטה שמובילה לשינויים במעבר המתח עלולה להשפיע על יכולתו של התא לבצע מיסים. באופן דומה, מניפולציה של הג צריך להיות מעובד עם כל מיקרופיפטה חדש כי הוא מזויף כמו שינויים קלים בצורה pipet יכול לגרום האינטראקציה pipet/ג'ל להשתנות.

כישלון במיקום המיקרו-פיפטה בתוך שדה הראייה המיקרוסקופי לפני הגדלת ההגדלה עלול להוביל לשבר בשוגג של קצה הזכוכית השברירי. ודא כי הגובה ומיקום ה-X-Y של העצה ידועים לפני הנמכת המיקרו-פיפטה עם המיקרומניפולציה. תמיד לפקח על המיקום של המיקרופיפטה כדי להפחית את הסיכון של שבירה. מומלץ להקטין את ההגדלה בחזרה ל-10X עבור כל מיקרופיפטה חדשים שנטענו לתוך המיקרומניפולציה כתנועות קלות של המיקרומניפולציה והנרתיק העשוי להוביל לשינויים לכאורה גדולים במיקום החדש שנטען מיקרופיפטה.

לפני מציאת תאים להתבונן, חשוב תחילה לבדוק את המיקרופיפטה כדי לוודא שהוא מעורב בהידרוג'ל כמצופה ושהוא מתאים להחלת המתיחה הרצויה. מציאת ממדי קצה המתאימים לניסוי ולסוג תא היא קריטית להצלחה בהחלת גירוי באמצעות הטקטיקה. על קצה המיקרופיפטה להיות מעוגל מספיק כדי שהוא לא ישבור דרך הג, אך לא כל כך מעוגל, שאינו מצליח לאחוז בו. אם הפייפט לא מושך את ג'ל ביעילות, ייתכן שהוא מחליק לאורך פני השטח. הצורה של הטיפ מיקרופיפטה עשוי להיות מעוגל כדי לעסוק כראוי עם משטח ג'ל. יש לכוונן את הממדים בקצה המיקרופיפטה עד שניתן יהיה להשיג מגע יציב באופן עקבי. במקרים מסוימים שבהם המיקרופיפטה מחליק על פני משטח הג, ייתכן שיהיה צורך להוריד את המיקרופיפטה לתוך ההידרוג'ל כדי להשיג יותר כוח גרירה. אם המיקרופיפטה מזיל דמעה באמצעות ג'ל, ייתכן שהקצה טוב מדי או חד מדי. לקרוע ג'ל עשוי גם להצביע על כוח רב מדי מוחל בעת משיכת. המיקרופיפטה צריך להיות מוגבה מעט כדי להפחית את דפורמציה ג'ל ולמשוך מרחקים קצרים.

לעתים קרובות, אם התא או קצה התא מחוץ לפוקוס על ידי המיקרופיפטה, הקצה של המיקרופיפטה מופעל קרוב מדי לתא או שמתיחה קשה מדי. הזיזו את המיקרופיפטה הרחק מהתא, אך רק מעט מפילים את התא במטוסי ה-X-Y. הזזת התא מחוץ לפוקוס לא רק להפוך את האירועים הסלולריים בלתי ניתנים לניטור ולגרום סטיות אופטיות, אבל זה יגרום לתא לחוות יותר גירוי מאשר מעבר הצבע 2-מימדי מתיחה המיועד.

והכי חשוב, זה קריטי להקליט ולנתח רק את התגובות כי יש מניפולציה durotactic עקבית עם טעות אנוש מינימלית. אם הפחתת הטיפ אינה מדויקת, או אם המיקרופיפטה ממוקם מתחת למיקומן, תוצאות הניסוי יהיו מטשטשה. מאחר שטיפול זה מורכב ושלבים רבים מועדים לשגיאות, יש לנקוט בכל שלב כדי להימנע משינויים לא מכוונת בגירוי התאים. כישלון בכל שלב עלול להוביל ליישום מתיחה לא עקבי ולתוצאות לא אמינות.

גבלות

יש מגבלות על טכניקה זו יש לשקול. בולט ביותר, זיוף מדויק ומניפולציה של מיקרופיפטות זכוכית יכול להציג עקומת למידה תלולה עבור משתמשים חדשים. בנוסף, המיקום והיקף המשיכה של ההידרוג'ל חייבים להיות ממוטבים עבור קווי תאים שונים. בדיקת displacements פלורסנט לפני ואחרי מניפולציה הידרוג'ל יכול לעזור עם ההיבט הזה של הטכניקה. כמו כן, בעוד הטכניקה מאפשרת תצפית גבוהה הזמני של התנהגות durotactic בתאים בודדים, זה הופך את זה שיטת תפוקה נמוכה. לכן חשוב לציין שניתן לטפל בשיטה זו גם בשיטות אחרות עם התפוקה הmanipulability והגבוהה יותר, כגון שימוש בהידרוג עם מעברי מדרגות מוגדרים מראש של קשיחות, כדי לנתח את התנהגות הדירופטיק של יותר אוכלוסיות של תאים בבת אחת. לסיכום, הרמה הגבוהה של שליטה הרקתית הטמפורלית של רמזים מכניים המוענקת על ידי הקבוע תא בודד שיטת durotactic לעשות את זה מאוד שימושי עבור ניתוח המנגנון המולקולרי לתרום התנהגות durotactic של סוגי תאים שונים רבים תחת תנאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

לא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide 40 %  National Diagnostic EC-810
Ammonium Persulfate  Fisher BP179-25
BD20A High frequency generator Electro Technic Products 12011A 115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( Sigma Aldrich M6514
Bis-acrylamide 2%  National Diagnostic EC-820
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner Bransonic 40 kHz frequency
Coarse Manipulator Narshige MC35A
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM without phenol red Sigma Aldrich D5030
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narshige PC-10
Epidermal Growth Factor Peprotech AF-100-15
Ethanol Pharmco-aaper 111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) Gibco A31606-02
Fibronectin  EMD Millipore FC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um  Invitrogen F8810, F8807, F8811
Fugene 6 Roche 1815091 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish
Glacial Acetic Acid Fisher Chemical A38SI-212
Glass Bottom Dish CellVis D60-60-1.5-N
Glass Coverslip Electron Microscopy Sciences 72224-01 22 mm, #1.5
HCl JT Baker 9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrate Sigma Aldrich Z805939 Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powder Sigma Aldrich H3375 Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light Uviton International UV0338
Isopropanol Fisher Chemical A417-4
Microforge Narshige MF900
Micromanipulator Narshige MHW3
Mineral Oil Sigma Aldrich M5904
Nanopure Life Science UV/UF System Barnstead D11931 ddH2O
Nikon Eclipse Ti Nikon
OptiMEM Invitrogen 31985062
Parafilm M Bemis Company, Inc PM-992
PBS 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) Sigma Aldrich P4056
Ref52 Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3 American Type Culture Collection Culture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH  Covachem  12414-1
Tabletop Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
TEMED  Sigma Aldrich T9281-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7, (10), 1120-1134 (2015).
  2. Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28, (11), 1467-1488 (2017).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  4. Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319, (16), 2418-2423 (2013).
  5. Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209, (2), 221-238 (1999).
  6. Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6, (2), 229-240 (2011).
  7. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11, (1), 1-15 (2015).
  8. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, (1), 144-152 (2000).
  9. Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24, (45), 6059-6064 (2012).
  10. Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7, (1), 26-34 (2014).
  11. Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
  12. Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113, (40), 11190-11195 (2016).
  13. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8, (4), 472-484 (2013).
  14. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7, (10), e46107 (2012).
  15. Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14, (5), 1311-1320 (2013).
  16. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151, (7), 1513-1527 (2012).
  17. McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8, (1), 7228 (2018).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, (7303), 263-266 (2010).
  20. McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6, (10), e26552 (2011).
  21. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  22. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  23. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics