Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Biology

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Summary

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

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Svec, K. V., Patterson, J. B., Naim, N., Howe, A. K. Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events. J. Vis. Exp. (150), e59995, doi:10.3791/59995 (2019).

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Abstract

Durotaxis è il processo attraverso il quale le cellule percepiscono e rispondono a gradienti di tensione. Per studiare questo processo in vitro, la rigidità del substrato sottostante una cellula deve essere manipolata. Mentre gli idrogel con rigidità graduata e saggi di migrazione a lungo termine si sono dimostrati utili negli studi di durotassi, le risposte immediate e acute ai cambiamenti locali nella tensione del substrato consentono uno studio mirato dei movimenti delle singole cellule e degli eventi di segnalazione subcellulare. Per testare ripetutamente la capacità delle cellule di rilevare e rispondere alla rigidità del substrato sottostante, viene utilizzato un metodo modificato per l'applicazione di gradienti acuti di maggiore tensione alle singole cellule coltivate su idrogel deformabili che consente in tempo reale manipolazione della forza e della direzione dei gradienti di rigidità impartiti sulle cellule in questione. Inoltre, ottimizzando i dettagli e i parametri dell'analisi, come la forma e le dimensioni della micropipetta o la posizione relativa, il posizionamento e la direzione del gradiente applicato, il saggio può essere ottimizzato per lo studio di qualsiasi tipo di cella e sistema sensibili. Questi parametri possono essere modificati per modificare in modo affidabile lo stimolo applicato ed espandere la funzionalità e la versatilità del saggio. Questo metodo consente l'esame sia del movimento durotattico a lungo termine che dei cambiamenti più immediati nella segnalazione cellulare e nella dinamica morfologica in risposta al cambiamento di rigidità.

Introduction

Negli ultimi decenni, l'importanza delle proprietà meccaniche dell'ambiente di una cellula ha ottenuto un crescente riconoscimento nella biologia cellulare. Tessuti diversi e matrici extracellulari hanno diverse rigidità relative e, quando le cellule migrano in tutto il corpo, navigano questi cambiamenti, utilizzando queste proprietà meccaniche per guidarli1,2,3 , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7.Le cellule usano la rigidità di un dato tessuto per informare il loro comportamento motile durante processi come lo sviluppo, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro. Tuttavia, i meccanismi molecolari che permettono la sensazione e la risposta a questi input meccanici rimangono in gran parte sconosciuti1,2,3,4,5, 6 È possibile: , 7.

Per studiare i meccanismi attraverso i quali le cellule rispondono ai segnali ambientali fisici, la rigidità o rigidità delle cellule aderenti sottostanti deve essere manipolata. Nel 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang e colleghi hanno sviluppato un saggio8 in base alla quale la risposta motilica di una singola cellula ai cambiamenti di segnali meccanici potrebbe essere testata direttamente allungando la poliacrilammide rivestita egicolofosa ECM idrogel su cui sono state placcate le cellule. Le cellule mostrano una preferenza significativa per migrare verso substrati più rigidi, un fenomeno che hanno soprannominato "durotaxis".

Dalla relazione originale del 2000, molte altre tecniche sono state impiegate per lo studio del durotassi. I gradienti di rigidità ripida sono stati fabbricati mediante la colata di gel su caratteristiche rigide come perline in polistirolo9 o pali polimerici rigidi10 o polimerizzando il substrato intorno ai bordi di un vetro coverlips11 per creare meccanica ' passo-confini'. In alternativa, gli idrogel con gradienti di rigidità più bassi ma fissi sono stati fabbricati con una varietà di metodi come gradienti di crosslinker creati da dispositivi microfluidici12,13 o goccioline di soluzione idrogel side-by-side di diversa rigidità8, o idrogel con crosslinker fotoreattivo trattati con esposizione alla luce UV graduata per creare un gradiente di rigidità lineare14,15. Queste tecniche sono state utilizzate con grande effetto per indagare il movimento cellulare durotattico in massa nel tempo. Tuttavia, in genere queste caratteristiche sono fabbricate in anticipo rispetto alla placcatura cellulare e le loro proprietà rimangono coerenti nel corso dell'esperimento, basandosi sul movimento casuale delle cellule per il campionamento di gradienti meccanici. Nessuna di queste tecniche è suscettibile di osservazione di rapidi cambiamenti nel comportamento cellulare in risposta a stimoli meccanici acuti.

Per osservare le risposte cellulari ai cambiamenti acuti nell'ambiente meccanico, i saggi durotaxis a singola cella offrono diversi vantaggi. In questi saggi, alle singole cellule viene dato uno stimolo acuto e meccanico allontanando il substrato sottostante dalla cellula con una micropipetta di vetro, introducendo così un gradiente direzionale di tensione cell-matrice. I cambiamenti nel comportamento motile, come la velocità o la direzione della migrazione, sono poi osservati dalla microscopia a contrasto di fase delle cellule vive. Questo approccio facilita l'osservazione diretta delle relazioni di causa ed effetto tra gli stimoli meccanici e la migrazione cellulare, in quanto consente una rapida e iterativa manipolazione della direzione e della grandezza del gradiente di tensione e la valutazione della conseguente risposte cellulari in tempo reale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per stimolare meccanicamente le cellule che esprimono proteine di fusione fluorescente o biosensori per visualizzare i cambiamenti nella quantità, nell'attività o nella localizzazione subcellulare delle proteine che si sospetta siano coinvolte nella meccanosensing e durotaxis.

Questa tecnica è stata utilizzata da gruppi che studiano durotaxis8,16 ed è descritta qui come è stata adattata dal Laboratorio Howe per studiare il comportamento durotattico delle cellule tumorali ovariche SKOV-3 e i meccanismi molecolari che sotto durotaxis17. Inoltre, viene descritto un metodo modificato per la fabbricazione di idrogel con un singolo strato uniforme di microsfere fluorescenti vicino alla superficie di coltura cellulare; ciò facilita la visualizzazione e l'ottimizzazione dei gradienti di deformazione generati da micropipette e può consentire la valutazione della contrattilità cellulare mediante microscopia della forza di trazione.

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Protocol

1. Fabbricazione di idrogel di polimembrano deformabile con microsfere fluorescenti incorporate

NOT: Le direzioni descrivono la polimerizzazione di un idrogel di 25 kPa di 22 m di diametro e spesso circa 66 m. Ognuno o tutti questi parametri possono essere modificati e le direzioni per farlo possono essere trovate nella tabella 1 e nelle note17.

  1. Attivazione di piatti o coverlips con fondo in vetro
    1. Preparare la soluzione di lavoro a levida per l'attivazione di un piatto di imaging con fondo di vetro o di un coverslip che si inserisca in una camera di imaging a celle vive. Mescolare 950 -L di 95% di etanolo, 50 l di acido acetico glaciale e 5 -L di lega silano (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
      NOT: L'utilizzo di una coverslip inferiore più grande rispetto alla coverslip superiore darà spazio aggiuntivo per lavorare durante la preparazione del gel e faciliterà il posizionamento della micropipetta di vetro nelle fasi successive. Inoltre, se si utilizza un coverslip anziché un piatto di imaging con fondo di vetro, pulire la coverslip come descritto nella sezione seguente.
    2. Attivare la superficie del vetro per 20 s con una bacchetta corona e sovrapporre immediatamente 50 gradi della soluzione di lavoro a lestraglio. Lasciare asciugare la soluzione per 10 min.
    3. Risciacquare due volte con il 95% di etanolo, poi due volte con isopropanolo e poi lasciare che le coverlips ariedano per circa 20 min.
      NOTA: Il vetro attivato può essere conservato per un massimo di una settimana in un desiccatore.
  2. Pulizia superiore coprelips
    1. Pulire i coperchi superiori da 22 mm incubando in 2% HCl a 70 s per 30 min, quindi lavare in ddH2O per 10 min due volte.
    2. Incubare i copricapi in una soluzione di 2% pulizia cuvette concentrarsi in ddH2O a 50 s per 30 min, quindi lavare in ddH2O per 10 min due volte.
    3. Incubare le coverine in ddH2O a 90 gradi centigradi per 30 min, poi nel 70% di etanolo a 70 gradi centigradi per 10 min, quindi asciugare all'aria a 60 gradi centigradi per un minimo di 2 h.
      NOT: I coperchi puliti possono essere conservati a tempo indeterminato in un desiccatore pulito.
  3. Microsfera fluorescente/deposizione di perline sui coperchi dei coperchi superiori
    1. Sonicare la soluzione stock di microsfere fluorescenti per 1 h in un bagno d'acqua ultrasonico. Fare una soluzione di perline di lavoro diluindo perline stock 1:200 in 100% etanolo e sonicare di nuovo per 1 h.
    2. 15 min prima che la soluzione di perline ha finito di onorare, pulire accuratamente i copricopertine mettendoli verticalmente in un portacoprile in ceramica e trattando con plasma camera-aria per 3 min in un plasma pulito tavolo.
    3. Per facilitare la movimentazione e prevenire lo scorrimento del coperchio durante i passaggi successivi, posizionare un pezzo di parafilm in un coperchio della piastra Petri da 60 mm o in un contenitore simile. Posizionare il coperchio nello stabilizzatore e toccare leggermente, garantendo un buon contatto tra il parafilm e il coperchio.
    4. Per un coperchio da 22 mm, aggiungere 150 l della soluzione di perline di lavoro sulla parte superiore del coperchio. Immediatamente aspirare la soluzione di etanolo fuori dal lato della vela, lasciando le perline sul coperchio. Lasciare asciugare il coperchio.
      NOTA: La quantità di perline di lavoro aggiunta deve essere di 4 x L/cm2 e può essere ridimensionata per adattarsi a qualsiasi dimensione coverslip.
  4. Getto idrogel con perline fluorescenti incorporate
    1. Preparare la soluzione idrogel di acrilammide e bis-acrilammide. Mescolare la soluzione secondo la tabella 1, quindi aggiungere 2,5 luna di 10% APS e 0,5 L di TEMED. Mescolare bene. Passare immediatamente al passaggio successivo.
      NOTA: La miscela di soluzione idrogel può essere modificata per variare il modulo del Young, o rigidità, dell'idrogel cambiando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide come mostrato nella Tabella 1. Questi valori sono stati verificati per l'uso nel laboratorio Howe utilizzando la microscopia a forza atomica, ma dovrebbero essere confermati all'interno della propria istituzione.
    2. Subito dopo aver fatto la soluzione idrogel, aggiungere una goccia di 25 l sul lato attivato del piatto in vetro o coverslip inferiore, quindi posizionare immediatamente il coperchio rivestito di perline sulla soluzione, lato di perline verso il basso. Contattare la goccia con il lato più lontano del coperchio seguito da abbassamento lento aiuta a evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno dell'idrogel.
      NOTA: L'altezza dell'idrogel deve essere ben entro la distanza di lavoro della lente obiettivo da utilizzare nell'esperimento successivo. Un'altezza di idrogel di 66 m funziona bene per la maggior parte dei sistemi. La dimensione dell'idrogel può essere scalata aggiungendo più o meno soluzione idrogel a seconda delle dimensioni del coperchio. Per calcolare il volume appropriato della soluzione idrogel, utilizzare l'equazione per il volume di un cilindro, V s2 hdove r è il raggio coverslip e h è l'altezza desiderata hydrogel. Tipicamente, questo calcolo prevede con precisione l'altezza effettiva dell'idrogel, come misurato preparando un gel con coprilabbra rivestiti di perline sia sulla parte superiore che inferiore e utilizzando un microscopio confocale per misurare la distanza tra i due piani di perline. Tuttavia, è stato osservato che l'altezza effettiva dell'idrogel può discostarsi da questo calcolo di 20 m (adesempio, a seconda dello spessore e del produttore della copertina superiore). Si raccomanda la misurazione diretta dell'altezza del gel utilizzando il metodo descritto sopra.
    3. Lasciare il gel a polimerizzare per 30 min, quindi rimuovere delicatamente lo scivolo superiore con pinze. L'aggiunta di 50 m HEPES pH 8,5 al piatto può facilitare la rimozione. Lavare per 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 tre volte.
  5. Attivazione di idrogel e rivestimento a matrice extracellulare
    1. Attivare la superficie idrogel incubando in 0,4 m Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) esanotato) in 50 m HEPES pH 8.5. Esporre immediatamente a una lampada ad arco UV in un'area chiusa.
      NOTA: Proteggere Sulfo-SANPAH dalla luce prima dell'attivazione. Per una lampada da 400 W, posizionare il gel a 10 cm di distanza dalla lampadina all'interno della scatola luminosa e illuminare per 100 s. La soluzione Sulfo-SANPAH cambierà da arancione brillante a marrone scuro.
    2. Lavare per 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 tre volte.
      NOTA: I gel idratati possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana.
    3. Incubare l'idrogel attivato in fibronectina da 20 g/mL in 50 mM DI HEPES pH 8,5 per 1 h a 37 .
    4. Aspirare la soluzione fibronectina e lavare per 5 min in salina fosfata-buffered (PBS) tre volte. Sterilizzare l'idrogel e il coperchio del piatto per 15 min sotto la luce UV in una cappa di coltura tissutale con un basso volume di PBS. Lavare una volta in PBS sterile.
      NOTA: Altri tipi di proteine ECM possono essere utilizzati per rivestire l'idrogel tra cui collagene e lamininina.

2. Plating cellule

  1. Aggiungete 3 mL di supporti contenenti 21.000 celle per riempire un piatto di 60 mm per una densità cellulare finale di 1000 celle/cm2. Regolare la densità di semina in base alle esigenze per prevenire l'affollamento e consentire la libera circolazione delle singole cellule.
  2. Lasciare che le cellule si riprendano a 37 gradi centigradi per almeno 4 h e fino a 18 h prima dell'imaging. Preparare l'imaging risciacquando con i supporti di imaging due volte prima di aggiungere i supporti di imaging. Lasciare che le cellule eclacino per almeno 30 min prima dell'imaging.
    NOTA: In anticipo, si passa nodi le condizioni dei supporti per determinare le condizioni che ottimizzeranno la migrazione nella riga cellulare utilizzata. Per le cellule SKOV-3, DMEM senza fenolo rosso, contenente 20 mHe HEPES e 12,5 ng/mL fattore di crescita epidermica stimola la maggior parte della migrazione. Le condizioni ottimali per le cellule Ref52 sono Ringer's Buffer con 10% siero bovino fetale (FBS) e 25 fattori di crescita derivati dalle piastrine ng/mL.

3. Preparazione della micropipetta di vetro: tiratura e forgiatura delle pipette

  1. Tirare micropipette di vetro borosilicate lunghe 100 mm con un esterno di 1,0 mm e un diametro interno di 0,58 mm in un processo a due fasi per ottenere un cono superiore a 2 mm che si riduce a 50 m nel primo millimetro e si estende fino a un tubo lungo e parallelo di 10 m di diametro nell'ultimo millimetro.
  2. Caricare il tubo tirato in una microforforgia. Formail tubo per avere una punta smussata di 15 m che è racchiusa alla fine di una sezione di 250 m piegata ad un angolo di 35 gradi rispetto al resto del tubo. Il diametro approssimativo alla curva dovrebbe essere di circa 30 m per dare forza alla punta.
    NOTA: Le dimensioni coniche e di punta possono essere regolate per applicare correttamente la forza desiderata (vedere il punto 5). Il tirare le micropipette a 65 gradi centigradi per il primo passo per 3 mm, e 60 gradi centigradi per il secondo passo produce le dimensioni descritte al punto 3.1. I risultati che utilizzano diversi tiratori pipet possono variare.
  3. Sterilizzare la micropipetta nel 70% di etanolo prima dell'uso.

4. Posizionamento del micromanipolatore e della micropipetta

  1. Rimuovere il coperchio del piatto e caricare il piatto sullo stadio del microscopio e al centro. Utilizzare un obiettivo di ingrandimento 10X o altrettanto basso. Coprire il supporto con olio minerale per evitare l'evaporazione dei supporti.
  2. Inserimento del pipet tirato
    1. Inserire il tubo tirato nella fauna micropipetta, puntando il gancio verso il piatto. La punta del gancio sarà il punto più basso quando abbassato al gel.
    2. Inserire la guaina nel micromanipolatore e regolare fino a quando la punta del pipet non è centrata sulla lente obiettivo in entrambe le direzioni X e Y.
    3. Abbassare il pipet con manipolatore grossolano fino a toccare solo la superficie del liquido.
  3. Utilizzando il contrasto di fase o il campo luminoso, concentrare il microscopio sullo strato di perline nella parte superiore del gel. Questo sarà il piano di riferimento.
  4. Garantire che l'obiettivo non sia in pericolo di colpire il campione o lo stadio, portare la messa a fuoco sopra il gel per trovare la punta della micropipetta, utilizzando piccole regolazioni del manipolatore grossolano nelle direzioni X e Y per proiettare ombre sul piano focale. Abbassare la micropipetta solo quando è certo che la punta stessa del pipet è nel campo visivo.
  5. Assicurarsi che la punta smussata della micropipetta sia rivolta verso il basso ruotando il tubo nella guaina o ruotando la guaina nel micromanipolatore fino a quando la punta non è perpendicolare al piano focale. Ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 in base alle esigenze. Concentrarsi sulla punta del pipet.
  6. Riportare verso il basso verso il basso per lo strato superiore del gel per misurare quanto il pipet è dalla superficie del gel. Riportare il fuoco su un piano che si trova a metà strada tra il gel e la punta del pipet. Abbassare lentamente il tubo per raggiungere il piano focale intermedio.
  7. Ripetere il passaggio 4.6 fino a quando le ombre molto deboli dalla punta della micropipetta possono essere apprezzate quando si mette a fuoco sull'idrogel. Aumentare al successivo ingrandimento più alto.
  8. Abbassare il micromanipolatore fino a quando le ombre e le rifrazioni della punta stessa della micropipetta possono essere apprezzate all'interno del piano focale strato di perline.
  9. Aumentare l'ingrandimento a quello che verrà utilizzato nell'esperimento. Abbassare il tubo fino a quando non si libra appena sopra la superficie dell'idrogel.

5. Calibrare il micromanipolatore e la generazione di forza

  1. In fase o in campo luminoso, abbassare la micropipetta in bilico per toccare la superficie dell'idrogel. Osservare come il pipet guarda al contatto con l'idrogel. Continuare a abbassare la micropipetta in , fino a quando le regolazioni in X e Y causano trazione e deflessione dell'idrogel in quelle direzioni. Utilizzare le microsfere o le cellule vicine come segni fiduciari.
    NOTA: Se il micromanipolatore è collegato al braccio del condensatore di fase o al banco e non allo stadio del campione stesso, disinserire sempre il gel prima di spostare lo stage per evitare di rompere il pipet o disturbare le cellule. Se il pipet si rompe, tornare al passaggio 3 e 4.
  2. Trova un'area priva di cellule per coinvolgere il gel. Tirarlo in tutte le direzioni e mettersi a proprio agio con il modo in cui la micromanipolazione si traduce in deformazione del gel.
  3. Prendere immagini fluorescenti del campo di perline senza manipolazione, con il pipet impegnando il gel, e con il pipet impegnato tirando il gel. Ripetere questo più volte prendendo buone note per quanto riguarda i segni di graduazione sul micromanipolatore, il modo in cui la punta pipet appare in fase o brightfield in ogni fase di tirare, e la distanza la punta si muove utilizzando tale manipolazione.
  4. Utilizzare ImageJ come descritto in precedenza16,17 per calcolare gli spostamenti relativi di perline e la forza applicata alle perline confrontando il campo di perline null con il campo di perline senza ingoiare pipet, il campo di perline con il gel impegnato, e il gel tirato.
  5. Per regolare in modo lineare lo stimolo di tensione, confrontare l'applicazione della forza utilizzando diverse dimensioni della punta della micropipetta, delle distanze dalla cella o della distanza estratta dal micromanipolatore dal punto iniziale del touchdown. L'effetto della dimensione della punta micropipetta sull'applicazione della forza dà grande flessibilità all'utente, ma dimostra anche la necessità di generare mappe di forza per nuove micropipette, anche quando le dimensioni e la forma assomigliano molto a punte precedentemente calibrate.

6. Condurre il saggio durotassino

  1. Prima di eseguire l'esperimento, esercitati a coinvolgere il gel vicino a una cellula e osserva la deformazione della cellula quando il micromanipolatore viene riposizionato.
  2. Monitorare un gruppo di cellule che hanno una chiara polarità e sembrano muoversi per 30 minuti per identificare le cellule che si muovono in modo diretto.
  3. Scegliere una cella che si muove in una singola direzione chiara e monitorarla alla frequenza fotogrammi desiderata per altri 30 min.
  4. Se si desidera la determinazione delle forze esercitate sulla cellula o la tensione esercitata dalla cellula, catturare le immagini del campo di perline ad ogni acquisizione. Se la cellula cambia il suo corso di direzione durante il monitoraggio, scegliere una cella diversa da monitorare in quanto questo renderà difficile determinare l'effetto della stimolazione.
  5. Impegnare l'idrogel a circa 50 m di distanza dalla cella. Posizionare il tubo davanti al lato vicino del bordo iniziale e spostare il micromanipolatore in modo che il gel sia deformato ortogonale mente alla direzione di viaggio della cella. Osservare la cellula nel tempo in quanto risponde al gradiente acuto e locale di rigidità.
    NOTA: La tempistica qui fornita è efficace quando si monitorano i fibroblasti SKOV3 o Ref52, tuttavia, l'intervallo e il percorso temporale complessivo devono essere regolati in base al tipo di cellula e all'evento biologico osservato. Se si associa con la microscopia a fluorescenza, mettere in pausa l'acquisizione fluorescente immediatamente prima del passaggio 6.5., utilizzare il contrasto di fase o il campo luminoso per posizionare la micropipetta e tirare e riavviare l'acquisizione fluorescente subito dopo.
  6. Se il pipet scivola o se il gradiente è altrimenti rilassato o rilasciato, trovare una nuova cella ripetendo i passaggi 6.2 e 6.3.

7. Determinazione della risposta alla migrazione di durotattici

  1. Utilizzando ImageJ19 o un altro programma di analisi dell'immagine, calcolare l'angolo di svolta disegnando una linea tra il centro del bordo iniziale della cella a 0 min e 30 min post monitor (riflettendo la traiettoria originale della cella) e un'altra linea tra il centro di il bordo iniziale appena prima e 80 min dopo la stimolazione e la misurazione dell'angolo tra queste due linee.

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Representative Results

Preparando le micropipette (Figura 1) e normalizzando la generazione della forza dei pull (Figura 2 e Figura 3) come descritto in precedenza, sono state identificate condizioni di durotassiche ottimali per più linee cellulari. Utilizzando questa tecnica, come descritto nella Figura 4, entrambe le cellule tumorali ovariche SKOV-317 e i fibroblasti embrionali di ratto Ref52 (Figura 5) si muovono verso una maggiore rigidità nei gradienti applicati da una micropipetta di vetro. Oltre a durotassi, questo metodo può essere utilizzato per studiare gli eventi di segnalazione dinamica utilizzando biosensori e marcatori fluorescenti. Ad esempio, la struttura e la segnalazione all'interno delle strutture di adesione focale possono essere osservate sulla stimolazione durotattica. Il sensore di tensione Vinculin (VinTS) è un biosensore basato su FRET che localizza le aderesi focali, consentendo l'osservazione fluorescente delle dinamiche di adesione focale e la misurazione dei cambiamenti di tensione all'interno di tali strutture19. Le cellule Ref52 che esprimono transitoriamente VinTS su gel di poliacrilofia da 125 kPa mostrano la formazione di adere focali nella direzione del tratto nel periodo di 40 min (Figura 6A). L'analisi FRET20 rivela che la vinculina localizzata ad aderes focali sperimenta un cambiamento immediato della tensione quando viene presentata con stimolazione durotassica acuta (Figura 6B) espandendo l'utilità di questo saggio all'osservazione della subcellulare eventi di segnalazione in risposta alla stimolazione durotattica.

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. Diagrammi di micropipette tipiche tirate (A) e forgiate (B). (A) Le micropipette vengono tirate utilizzando un protocollo in due fasi per ottenere uncono da 1 mm a 10 m superiore a 2 mm. La micropipetta è piegata con un angolo di 35 dollari e si assottiglia da 30 m a una punta arrotondata che misura 15 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Migliorato campo di perline dopo rivestimento di etanolo rispetto al metodo tradizionale utilizzando poli-L-lysina. I relativi metodi di rivestimento in poli-L-lisina ed etanolo (EtOH) utilizzando perline fluorescenti giallo-verdi, rosse e rosso scuro. Barra della scala: 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. Generazione della mappa della forza per un esempio di tratto durotattico. (A) Posizione delle microsfere fluorescenti prima e dopo (rispettivamente verde e rosso pseudo-colorato) che deforma l'idrogel con una micropipetta (situata oltre il bordo destro del pannello). Barra della scala: 25 m. I vettori di spostamento (B) e la mappa termica di spostamento (C) tra i campi di perline nulli e estratti generati dai plug-in Traction Force Microscopy in ImageJ evidenziano il gradiente di deflessione del tallone e deformazione idrogel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
come illustrato nella Figura 4. Schematica del saggio durotassino e determinazione dell'angolo di deflessione. (A) Una cellula è osservata per almeno 30 min per determinare la sua traiettoria originale. (B) La micropipetta è posizionata ortogonalemente sulla traiettoria della cellula, a 50 m dal bordo della cellula. L'idrogel è impegnato dalla micropipetta in modo che lo spostamento della micropipetta eserciti la forza sulla superficie dell'idrogel. (C) La micropipetta viene estratta di altri 20 m di distanza dalla cella, ortogonale alla traiettoria della cellula che crea un gradiente acuto e locale di tensione (indicato in blu) che aumenta verso la micropipetta. (D) La cella viene osservata nel tempo mentre si sposta nel gradiente applicato. (E) In ImageJ o in un programma di analisi delle immagini, la traiettoria originale (linea tratteggiata) è contrassegnata da una linea tracciata dal centro della cella attraverso il centro del bordo iniziale nel primo fotogramma. La traiettoria finale (linea continua) è contrassegnata da una linea disegnata dopo che alla cella è consentito navigare il gradiente di tensione applicato. L'angolo tra queste due linee verso lo stimolo è chiamato "angolo di svolta", contrassegnato qui da , fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
come illustrato nella Figura 5. I fibroblasti embrionali di ratto si muovono verso regioni di aumento della rigidità del substrato nel durotassio. Corso di tempo che mostra il movimento durotattico di una cella Ref52 10 min prima della trazione (pannello 1), 1 min prima della trazione (pannello 2), al momento della trazione (pannello 3) e 1 h dopo il pull (pannello 4). La freccia indica la direzione di stiramento. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
come illustrato nella Figura 6. Localizzazione e attività delle proteine durante la stimolazione durotattica utilizzando marcatori fluorescenti o biosensori. Le cellule Ref52 che esprimono transitoriamente il sensore di tensione vinculina (VinTS)19 che migra su 125 gel di poliacrilammide kPa sono presentate con stimolazione durotassica acuta. (A) Dopo la stimolazione, nuove adesioni focali si formano nella direzione del tratto come le cellule si ri-orientano lungo il gradiente di rigidità. Per due periodi di 10 min, a partire da 20 min prima della stimolazione meccanica e 21 min dopo la stimolazione, sono stati monitorati la morfologia cellulare (in alto) e la formazione di adesione focale (in basso). Il colore rosso indica il primo timepoint entro il periodo di tempo e il colore verde indica il timepoint 10 min successivo. Nuove adesioni focali formate entro il periodo di 10 min sono mostrate in verde. Prima della stimolazione, si formano nuove adesioni focali nella direzione del viaggio. Dopo la stimolazione, nuove adesioni focali si formano nella direzione di allungamento. La freccia indica la direzione di stiramento. Le punte delle frecce indicano aree con adere focali formate nel corso di quel periodo di 10 min. Barra della scala: 25 m. (B) L'analisi FRET della fluorescenza VinTS indica un cambiamento di tensione all'interno delle adescuzioni focali proximale a tratto durotassivo. Contorno della membrana cellulare prima e dopo allungamento evidenziare deformazione della cellula dopo stimolazione. Le punte di freccia indicano esempi di adere focali che sperimentano cambiamenti nel rapporto FRET su tratto. Barra della scala: 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Rigidità idrogel desiderata 3 kPa 25 kPa 125 kPa
7.5% Acrilammide 100 ll 100 ll 160 lL
0,5% Bis-Acrilammide 10 ll 100 ll 100 ll
ddH2O 287 ll 197 -L 137 -L

Tabella 1. Soluzioni per gel di acrilammide.

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Discussion

Divenuto qui è un test di durotassire ripetibile e a singola cellula che consente di valutare la capacità di una cellula di alterare il suo comportamento di migrazione in risposta a segnali meccanici acuti. Questa tecnica può essere utilizzata anche in combinazione con la microscopia a fluorescenza e proteine o biosensori di fusione appropriate per esaminare la segnalazione subcellulare e gli eventi citoscheletrici entro secondi di stimolazione meccanica o su una scala cronologica più lunga durante movimento durotattico. Comprendere il rapporto di una cellula con il suo ambiente comporta lo studio dell'impatto degli aspetti chimici e meccanici di quell'ambiente. Anche se potenzialmente difficile da padroneggiare, questo saggio durotassis può essere ampiamente utilizzato per comprendere la risposta cellulare ai cambiamenti nel suo microambiente meccanico.

Significato rispetto ai metodi esistenti

Come accennato in precedenza, questo metodo di stimolazione durotattica basato su micropipette è altamente manipolabile, consentendo un alto grado di controllo spatiotemporale sugli stimoli meccanici, un grande vantaggio rispetto ad altre tecniche, come step-gradienti di rigidità. La grandezza e la direzione dei gradienti di deformazione impartiti possono essere visualizzate monitorando lo spostamento delle perline fluorescenti incorporate nell'idrogel, vicino alla superficie di coltura cellulare.

Limitare questi indicatori fiduciari a un singolo livello appena al di sotto della superficie di coltura aumenta la precisione di questo monitoraggio. Le microsfere situate al di sotto del piano di deflessione (impartiti sia dalla micropipetta che, per la microscopia della forza di trazione, per contrattilità cellulare), come si verificherebbe mescolando le microsfere in modo uniforme in tutto l'idrogel, si muoveranno meno che in piano microsfere, che possono portare a sottovalutare le forze applicate. Inoltre, questa modifica è più facile da eseguire e più affidabile dei metodi in cui le perline sono sovrapposte in uno strato estremamente sottile di poliacrilammide gettato sopra un gel preformato21 o portati sulla superficie dell'idrogel mediante settling a gravità assistita22 e produce una dispersione più uniforme di perline attraverso l'idrogel rispetto ai metodi descritti in precedenza17,23.

Modifiche e applicazioni future

Le specifiche di questo saggio possono essere modificate per adattarsi meglio alla linea cellulare di interesse. Ad esempio, una varietà di molecole di matrice extracellulare (adesempio, collagene I, collagene IV, laminina) o altri ligandi adesivi possono essere utilizzati per funzionalizzare l'idrogel. Inoltre, la rigidità iniziale dell'idrogel può essere facilmente sollevata o abbassata regolando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide (vedi tabella 1). Modificando le dimensioni della punta della micropipetta e la grandezza della trazione, questo saggio può essere ottimizzato per impartire uno stimolo durotattico ripetibile ed efficace per il tipo di cellula in questione.

Passaggi critici e risoluzione dei problemi

Solo le cellule che seguono una traiettoria costante e lineare di migrazione prima della manipolazione dell'idrogel dovrebbero essere stimolate per garantire che i cambiamenti nella traiettoria siano dovuti allo stimolo meccanico e non alla fluttuazione casuale. Occorre prestare attenzione a fabbricare una micropipetta di vetro che coinvolga la superficie dell'idrogel senza scivolare ma non strappi il gel quando viene tirato. È importante applicare un tratto costante e costante all'idrogel durante il corso dell'esperimento per ottenere risultati puliti, il che significa che l'utente deve essere praticato al posizionamento e allo spostamento della micropipetta prima di incontrare una cella. Qualsiasi movimento involontario della micropipetta che porti a cambiamenti nel gradiente di tensione potrebbe influenzare la capacità della cellula di durotassa. Allo stesso modo, la manipolazione del gel deve essere praticata con ogni nuova micropipetta che viene forgiata in quanto lievi cambiamenti nella forma del pipet possono causare la variazione dell'interazione pipet/gel.

La mancata posizione della micropipetta all'interno del campo visivo microscopico prima di aumentare l'ingrandimento può portare alla rottura accidentale della fragile punta di vetro. Assicurarsi che l'altezza e la posizione X-Y della punta siano note prima di abbassare la micropipetta con il micromanipolatore. Monitorare sempre la posizione della micropipetta per ridurre il rischio di rottura. Si raccomanda che l'ingrandimento venga ridotto di nuovo a 10X per ogni nuova micropipetta caricata nel micromanipolatore, poiché lievi movimenti del micromanipolatore e della conetta del tubo possono portare a grandi cambiamenti apparenti nella posizione del nuovo caricato micropipetta.

Prima di trovare le cellule da osservare, è importante testare la micropipetta per confermare che si impegnerà l'idrogel come previsto e che è adatto per l'applicazione dell'allungamento desiderato. Trovare le dimensioni della punta che si adattano all'esperimento e al tipo di cellula è fondamentale per il successo nell'applicazione della stimolazione durotattica. L'estremità della micropipetta deve essere abbastanza arrotondata in modo da non sfondare il gel, ma non così arrotondata da non riuscire ad afferrarlo. Se il pipet non tira gel in modo efficace, può essere scivolare lungo la superficie. La forma della punta della micropipetta può essere troppo arrotondata per interagire correttamente con la superficie del gel. Le dimensioni sulla punta stessa della micropipetta devono essere regolate fino a quando il contatto fermo e costante può essere raggiunto in modo coerente. In alcuni casi in cui la micropipetta sta scivolando sulla superficie del gel, potrebbe essere necessario abbassare ulteriormente la micropipetta nell'idrogel per ottenere maggiore trazione. Se la micropipetta si strappa attraverso il gel, la punta potrebbe essere troppo fine o troppo affilata. Lo strappo di gel può anche indicare che viene applicata troppa forza durante il trazione. La micropipetta deve essere sollevata leggermente per ridurre la deformazione del gel e tirando distanze più brevi.

Spesso, se la cella o il bordo della cellula viene tirato fuori fuoco dalla micropipetta, la punta della micropipetta è impegnata troppo vicino alla cellula o l'allungamento è troppo forte. Spostare la micropipetta più lontano dalla cella, deformando solo leggermente la cella nei piani X-Y. Spostando la cellula fuori fuoco non solo renderà gli eventi cellulari impossibili da monitorare e causerà aberrazioni ottiche, ma farà sì che la cellula sperimenti più stimolazione rispetto al gradiente di tensione bidimensionale previsto.

Ancora più importante, è fondamentale registrare e analizzare solo le risposte che hanno una manipolazione durotassica coerente con un errore umano minimo. Se l'abbassamento della punta è impreciso o se la micropipetta viene riposizionata, i risultati dell'esperimento saranno offuscati. Poiché questo saggio è complesso e molti passi sono soggetti a errori, è necessario prestare attenzione ad ogni passo per evitare cambiamenti involontari nella stimolazione delle cellule. Un errore in qualsiasi passaggio può portare a un'applicazione stretch incoerente e a risultati inaffidabili.

Limitazioni

Ci sono limitazioni a questa tecnica che dovrebbero essere considerate. In modo più evidente, la forgiatura e la manipolazione accurate delle micropipette in vetro possono presentare una curva di apprendimento ripida per i nuovi utenti. Inoltre, la posizione e la grandezza della trazione idrogel devono essere ottimizzate per diverse linee cellulari. L'esame degli spostamenti di perline fluorescenti prima e dopo la manipolazione dell'idrogel può aiutare con questo aspetto della tecnica. Inoltre, mentre la tecnica consente un'elevata osservazione spatiotemporale del comportamento durotassico nelle singole cellule, questo lo rende un saggio a bassa produttività. È quindi importante sottolineare che questo saggio può essere completato anche da altre tecniche con una minore manipolabilità ma una maggiore produttività, come l'utilizzo di idrogel con gradienti preformati di rigidità, per analizzare il comportamento durotattico di di cellule contemporaneamente. In sintesi, l'elevato grado di controllo spatiotemporale dei segnali meccanici offerto dal saggio durotattico a singola cellula lo rende molto utile per l'analisi dei meccanismi molecolari che contribuiscono al comportamento durotattico di molti tipi di cellule diverse sotto molti Condizioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

nessuno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide 40 %  National Diagnostic EC-810
Ammonium Persulfate  Fisher BP179-25
BD20A High frequency generator Electro Technic Products 12011A 115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( Sigma Aldrich M6514
Bis-acrylamide 2%  National Diagnostic EC-820
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner Bransonic 40 kHz frequency
Coarse Manipulator Narshige MC35A
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM without phenol red Sigma Aldrich D5030
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narshige PC-10
Epidermal Growth Factor Peprotech AF-100-15
Ethanol Pharmco-aaper 111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) Gibco A31606-02
Fibronectin  EMD Millipore FC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um  Invitrogen F8810, F8807, F8811
Fugene 6 Roche 1815091 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish
Glacial Acetic Acid Fisher Chemical A38SI-212
Glass Bottom Dish CellVis D60-60-1.5-N
Glass Coverslip Electron Microscopy Sciences 72224-01 22 mm, #1.5
HCl JT Baker 9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrate Sigma Aldrich Z805939 Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powder Sigma Aldrich H3375 Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light Uviton International UV0338
Isopropanol Fisher Chemical A417-4
Microforge Narshige MF900
Micromanipulator Narshige MHW3
Mineral Oil Sigma Aldrich M5904
Nanopure Life Science UV/UF System Barnstead D11931 ddH2O
Nikon Eclipse Ti Nikon
OptiMEM Invitrogen 31985062
Parafilm M Bemis Company, Inc PM-992
PBS 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) Sigma Aldrich P4056
Ref52 Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3 American Type Culture Collection Culture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH  Covachem  12414-1
Tabletop Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
TEMED  Sigma Aldrich T9281-50

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References

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