Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Biology

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Summary

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

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Svec, K. V., Patterson, J. B., Naim, N., Howe, A. K. Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events. J. Vis. Exp. (150), e59995, doi:10.3791/59995 (2019).

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Abstract

Durotaxis est le processus par lequel les cellules détectent et réagissent aux gradients de tension. Afin d'étudier ce processus in vitro, la rigidité du substrat sous-jacent à une cellule doit être manipulée. Tandis que les hydrogels avec la rigidité graduée et les essais à long terme de migration se sont avérés utiles dans des études de durotaxis, les réponses immédiates et aigues aux changements locaux dans la tension de substrat permettent l'étude focalisée des mouvements individuels de cellules et des événements subcellulaires de signalisation. Pour tester à répétition la capacité des cellules à détecter et à répondre à la rigidité sous-jacente du substrat, une méthode modifiée pour l'application de gradients aigus de tension accrue aux cellules individuelles cultivées sur des hydrogels déformables est utilisée qui permet de temps réel manipulation de la force et de la direction des gradients de rigidité transmis aux cellules en question. En outre, en affinant les détails et les paramètres de l'analyse, tels que la forme et les dimensions de la micropipette ou la position relative, le placement et la direction du gradient appliqué, l'analyse peut être optimisée pour l'étude de tout mécaniquement type et système de cellules sensibles. Ces paramètres peuvent être modifiés pour modifier de manière fiable le stimulus appliqué et élargir la fonctionnalité et la polyvalence de l'analyse. Cette méthode permet l'examen du mouvement durotactic à long terme aussi bien que des changements plus immédiats dans la signalisation cellulaire et la dynamique morphologique en réponse à la rigidité changeante.

Introduction

Au cours des dernières décennies, l'importance des propriétés mécaniques de l'environnement d'une cellule a acquis une reconnaissance croissante en biologie cellulaire. Différents tissus et matrices extracellulaires ont des rigidités relatives différentes et, comme les cellules migrent dans tout le corps, ils naviguent dans ces changements, en utilisant ces propriétés mécaniques pour les guider1,2,3 , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7. Les cellules utilisent la rigidité d'un tissu donné pour éclairer leur comportement motile pendant des processus tels que le développement, la guérison des plaies et les métastes cancéreuses. Cependant, les mécanismes moléculaires qui permettent la sensation et la réponse à ces entrées mécaniques restent largement inconnus1,2,3,4,5, 6 Annonces , 7.

Afin d'étudier les mécanismes par lesquels les cellules réagissent aux indices environnementaux physiques, la rigidité ou la rigidité du substrat sous-jacent aux cellules adhérentes doit être manipulée. En 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang et ses collègues ont mis au point un essai8 par lequel la réponse motile d'une cellule individuelle aux indices mécaniques changeants pouvait être directement testée en étirant la matrice extracellulaire déformable (ECM) enduite de polyacrylamide hydrogels sur lesquels les cellules ont été plaquées. Les cellules présentent une préférence significative pour la migration vers des substrats plus rigides, un phénomène qu'elles ont surnommé « durotaxis ».

Depuis le rapport original de 2000, de nombreuses autres techniques ont été utilisées pour l'étude du durotaxis. Des gradients de rigidité raide ont été fabriqués en jetant des gels sur des caractéristiques rigides telles que les perles de polystyrène9 ou les poteaux de polymère rigide s'il en est à10 ou en polymérisant le substrat sur les bords d'un verrecouvre 11 pour créer des step-boundaries ». Alternativement, les hydrogels avec des gradients de rigidité moins profonds mais fixes ont été fabriqués par une variété de méthodes telles que des gradients de crosslinker créés par des dispositifs microfluidiques12,13 ou côte à côte gouttelettes de solution hydrogel de rigidité différente8, ou hydrogels avec crosslinker photoréactive traité avec une exposition à la lumière UV graduée pour créer un gradient de rigidité linéaire14,15. Ces techniques ont été utilisées à grand effet pour étudier le mouvement cellulaire durotactic en masse au fil du temps. Cependant, généralement ces caractéristiques sont fabriquées à l'avance du placage cellulaire et leurs propriétés restent cohérentes au cours de l'expérience, en s'appuyant sur le mouvement aléatoire des cellules pour l'échantillonnage des gradients mécaniques. Aucune de ces techniques ne sont propices à l'observation de changements rapides dans le comportement cellulaire en réponse à un stimulus mécanique aigu.

Afin d'observer les réponses cellulaires aux changements aigus dans l'environnement mécanique, les essais de durotaxis à cellule unique offrent plusieurs avantages. Dans ces essais, les cellules individuelles sont donnés un stimulus mécanique aigu en tirant le substrat sous-jacent loin de la cellule avec une micropipette en verre, introduisant de ce fait un gradient directionnel de tension de cellule-matrice. Les changements dans le comportement motile, tels que la vitesse ou la direction de la migration, sont ensuite observés par microscopie de contraste de phase de cellule vivante. Cette approche facilite l'observation directe des relations de cause à effet entre les stimuli mécaniques et la migration cellulaire, car elle permet une manipulation rapide et itérative de la direction et de l'ampleur du gradient de tension et l'évaluation des réponses cellulaires en temps réel. En outre, cette méthode peut également être utilisée pour stimuler mécaniquement les cellules exprimant des protéines fluorescentes de fusion ou des biocapteurs pour visualiser les changements dans la quantité, l'activité ou la localisation subcellulaire des protéines soupçonnées d'être impliquées dans la mécanoceles et durotaxis.

Cette technique a été utilisée par des groupes qui étudient la durotaxique8,16 et est décrite ici comme il a été adapté par le laboratoire Howe pour étudier le comportement durotactic des cellules cancéreuses ovariennes SKOV-3 et les mécanismes moléculaires qui sous-durotaxis17. En outre, une méthode modifiée est décrite pour la fabrication d'hydrogels avec une seule couche uniforme de microsphères fluorescentes près de la surface de la culture cellulaire; cela facilite la visualisation et l'optimisation des gradients de tension générés par micropipette et peut permettre l'évaluation de la contractilité cellulaire par microscopie de force de traction.

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Protocol

1. Fabrication d'hydrogels de polyacrylamide déformables avec microsphères fluorescentes intégrées

REMARQUE: Les instructions décrivent la polymérisation d'un hydrogel de 25 kPa d'un diamètre de 22 m et d'une épaisseur d'environ 66 m. Chacun ou tous ces paramètres peuvent être modifiés et les directions à cet égard peuvent être trouvées dans le tableau 1 et dans les notes17.

  1. Activation de plats à fond de verre ou de couvertures
    1. Préparer la solution de travail de silane de liaison pour l'activation d'un plat d'imagerie à fond de verre ou d'un bordereau qui s'insère dans une chambre d'imagerie à cellules vives. Mélanger 950 l d'éthanol à 95 %, 50 l d'acide acétique glaciaire et 5 l de silane de liaison (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
      REMARQUE: L'utilisation d'un couvercle de fond plus grand par rapport à la couverture supérieure donnera plus d'espace pour travailler lors de la préparation du gel et facilitera le positionnement de la micropipette en verre dans les étapes ultérieures. De plus, si vous utilisez un bordereau plutôt qu'un plat d'imagerie à fond de verre, nettoyez le bordereau tel que décrit dans la section suivante.
    2. Activez la surface du verre pendant 20 s avec une baguette corona et retrouverez immédiatement 50 ll de la solution de travail de silane de liaison. Laisser sécher la solution pendant 10 min.
    3. Rincer deux fois avec 95 % d'éthanol, puis deux fois avec l'isopropanol, puis laisser les feuilles de couverture sécher à l'air pendant environ 20 min.
      REMARQUE: Le verre activé peut être conservé jusqu'à une semaine dans un dessiccateur.
  2. Couvertures de dessus de nettoyage
    1. Nettoyer les couvertures supérieures de 22 mm en couve dans 2 % de HCl à 70 oC pendant 30 min, puis laver en ddH2O pendant 10 min deux fois.
    2. Incuber les couvercles dans une solution de 2% de concentré de nettoyage cuvette en ddH2O à 50 oC pendant 30 min, puis laver dans ddH2O pendant 10 min deux fois.
    3. Incuber les couvercles en ddH2O à 90 oC pendant 30 min, puis dans 70 % d'éthanol à 70 oC pendant 10 min, puis sécher à l'air à 60 oC pendant au moins 2 h.
      REMARQUE: Les couvertures nettoyées peuvent être stockées indéfiniment dans un dessiccateur propre.
  3. Dépôt de microsphère/perle fluorescentsur les couvertures supérieures
    1. Sonicate la solution de stock de microsphères fluorescentes pour 1 h dans un bain d'eau à ultrasons. Faire une solution de perle de travail en diluant le stock de perles 1:200 dans 100% d'éthanol et sonicate à nouveau pendant 1 h.
    2. 15 min avant que la solution de perle ait fini de sonicating, nettoiez complètement les couvertures en les plaçant verticalement dans un support en céramique de couverture et en traitant avec le plasma de pièce-air pendant 3 min dans un nettoyant de plasma de table.
    3. Pour faciliter la manipulation et empêcher le glissement de la glissière pendant les étapes suivantes, placez un morceau de parafilm dans un couvercle de vaisselle Petri de 60 mm ou un contenant similaire. Placez la glissière de couverture dans le stabilisateur et appuyez légèrement vers le bas, assurant un bon contact entre le parafilm et le bordereau.
    4. Pour un bordereau de couverture de 22 mm, ajouter 150 l de la solution de perle de travail au sommet de la glissière de couverture. Aspirez immédiatement la solution d'éthanol du côté de la glissière, laissant les perles sur la glissière. Laisser sécher la glissière à air.
      REMARQUE: La quantité de solution de perle de travail ajoutée doit être de 4 livres/cm2 et peut être mise à l'échelle pour s'adapter à n'importe quelle couverture de taille.
  4. Moulage d'hydrogels avec perles fluorescentes intégrées
    1. Préparer la solution hydrogel de l'acrylamide et du bis-acrylamide. Mélanger la solution selon le tableau 1, puis ajouter 2,5 L de 10% APS et 0,5 L de TEMED. Bien mélanger. Passez immédiatement à l'étape suivante.
      REMARQUE: Le mélange de solution hydrogel peut être modifié pour varier le modulus du Jeune, ou rigidité, de l'hydrogel en modifiant le rapport de l'acrylamide au bis-acrylamide comme indiqué dans le tableau 1. Ces valeurs ont été vérifiées pour une utilisation dans le laboratoire Howe à l'aide de la microscopie de force atomique, mais doivent être confirmées au sein de son établissement.
    2. Immédiatement après la fabrication de la solution hydrogel, ajouter une goutte de 25 l sur le côté activé du plat à fond de verre ou de la couverture inférieure, puis placez immédiatement la feuille de couverture enrobée de perles sur la solution, côté perle vers le bas. Le contact avec la goutte avec le côté éloigné de la glissière de couverture suivie d'un abaissement lent permet d'éviter de piéger les bulles d'air à l'intérieur de l'hydrogel.
      REMARQUE: La hauteur de l'hydrogel doit être bien dans la distance de travail de la lentille objective à utiliser dans l'expérience ultérieure. Une hauteur hydrogel de 66 m fonctionne bien pour la plupart des systèmes. La taille de l'hydrogel peut être mise à l'échelle en ajoutant plus ou moins de solution hydrogel en fonction de la taille de la couverture. Pour calculer le volume approprié de la solution hydrogel, utilisez l'équation pour le volume d'un cylindre, V 'r2hr est le rayon de couverture et h est la hauteur d'hydrogel désirée. Typiquement, ce calcul prédit avec une juste précision la hauteur réelle de l'hydrogel, mesurée en préparant un gel avec des couvertures enrobées de perles sur le dessus et le bas et en utilisant un microscope confocal pour mesurer la distance entre les deux plans de perles. Cependant, il a été observé que la hauteur réelle de l'hydrogel peut s'écarter de ce calcul de 20 m(p. ex., selon l'épaisseur et le fabricant de la glissière de verre supérieure). Il est recommandé de mesurer directement la hauteur du gel à l'aide de la méthode décrite ci-dessus.
    3. Laisser le gel polymériser pendant 30 min, puis retirer le couvercle supérieur doucement avec des forceps. L'ajout de 50 mM HEPES pH 8.5 au plat peut faciliter l'enlèvement. Laver pendant 5 min en 50 mM HEPES pH 8,5 trois fois.
  5. Activation d'hydrogel et revêtement de matrice extracellulaire
    1. Activer la surface de l'hydrogel en couvant dans 0.4 mM Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate) dans 50 mM HEPES pH 8.5. Immédiatement exposer à une lampe à arc UV dans un espace clos.
      REMARQUE: Protégez Sulfo-SANPAH de la lumière avant l'activation. Pour une lampe de 400 W, placez le gel à 10 cm de l'ampoule dans la boîte lumineuse et illuminez pendant 100 s. La solution Sulfo-SANPAH passera de l'orange vif au brun foncé.
    2. Laver pendant 5 min en 50 mM HEPES pH 8,5 trois fois.
      REMARQUE: Les gels hydratés peuvent être entreposés à 4 oC pendant une semaine.
    3. Incuber l'hydrogel activé dans 20 fibronectins de 20 g/mL dans 50 mM HEPES pH 8,5 pour 1 h à 37 oC.
    4. Aspirer la solution de fibronectine et laver pendant 5 min dans la saline tamponnée de phosphate (PBS) trois fois. Stériliser l'hydrogel et le couvercle du plat pendant 15 min sous la lumière UV dans une hotte de culture tissulaire avec un faible volume de PBS. Laver une fois dans le PBS stérile.
      REMARQUE: D'autres types de protéines ECM peuvent être utilisés pour enrober l'hydrogel, y compris le collagène et la lamininine.

2. Cellules de placage

  1. Ajouter 3 ml de support contenant 21 000 cellules pour remplir un plat de 60 mm pour une densité cellulaire finale de 1000 cellules/cm2. Ajuster la densité d'ensemencement au besoin pour éviter l'encombrement et permettre la libre circulation des cellules individuelles.
  2. Laisser les cellules récupérer à 37 oC pendant au moins 4 h et jusqu'à 18 h avant l'imagerie. Préparez-vous à l'imagerie en rinçant deux fois avec des supports d'imagerie avant d'ajouter des supports d'imagerie. Laisser les cellules s'aquilper pendant au moins 30 minutes avant l'imagerie.
    REMARQUE: Filtrer les conditions des médias à l'avance pour déterminer les conditions qui optimiseront la migration dans la ligne cellulaire utilisée. Pour les cellules SKOV-3, le DMEM sans rouge phénol, contenant 20 mM HEPES et 12,5 ng/mL de facteur de croissance épidermique stimule le plus de migration. Les conditions optimales pour les cellules Ref52 sont le tampon de Ringer avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) et le facteur de croissance dérivé de plaquette de 25 ng/mL.

3. Préparation de micropipette en verre : traction et forge de pipette

  1. Tirez des micropipettes en verre borosilicate de 100 mm de long avec un extérieur de 1,0 mm et un diamètre intérieur de 0,58 mm dans un processus en deux étapes pour obtenir un cône de plus de 2 mm qui réduit à 50 m au premier millimètre et s'étend jusqu'à un long tube parallèle de 10 m de diamètre au dernier millimètre.
  2. Chargez la tuyauterie tirée dans une microforge. Façonner la tuyauterie pour qu'elle ait une pointe émoussée de 15 m qui est fermée à la toute fin d'une section de 250 m pliée à un angle de 35 degrés par rapport au reste de la tuyauterie. Le diamètre approximatif à la courbure doit être d'environ 30 m pour donner de la force à la pointe.
    REMARQUE: Les dimensions du cône et de la pointe peuvent être ajustées pour appliquer correctement la force désirée (voir l'étape 5). Tirer des micropipettes à 65 oC pour la première étape pour 3 mm, et 60 oC pour la deuxième étape produit les dimensions décrites à l'étape 3.1. Les résultats à l'aide de différents pullers pipet peuvent varier.
  3. Stériliser la micropipette dans 70% d'éthanol avant utilisation.

4. Positionnement du micromanipulateur et de la micropipette

  1. Retirez le couvercle du plat et chargez le plat sur l'étape du microscope et au centre. Utilisez un objectif de grossissement 10X ou tout aussi faible. Couvrez les médias d'huile minérale pour éviter l'évaporation des médias.
  2. Insertion de pipet tiré
    1. Insérez la tuyauterie tirée dans la gaine de micropipette, pointant le crochet vers le plat. La pointe du crochet sera le point le plus bas lorsqu'il est abaissé au gel.
    2. Insérez la gaine dans le micromanipulateur et ajustez jusqu'à ce que la pointe du tuyau soit centrée sur la lentille objective dans les deux directions X et Y.
    3. Baisser la tuyauterie à l'aide d'un manipulateur grossier jusqu'à ce qu'il touche juste la surface du liquide.
  3. À l'aide d'un contraste de phase ou d'un champ lumineux, concentrez le microscope sur la couche de perles au sommet du gel. Ce sera le plan de référence.
  4. En veillant à ce que l'objectif ne soit pas en danger de frapper l'échantillon ou l'étape, mettre l'accent au-dessus du gel pour trouver la pointe de la micropipette, en utilisant de petits ajustements du manipulateur grossier dans les directions X et Y pour projeter des ombres sur le plan focal. Ne baissez la micropipette que lorsqu'il est certain que la pointe même de la tuyauterie se trouve dans le champ de vision.
  5. Assurez-vous que la pointe émoussée de la micropipette est pointant vers le bas en tournant la tuyauterie dans la gaine ou en tournant la gaine dans le micromanipulateur jusqu'à ce que la pointe soit perpendiculaire au plan focal. Répétez les étapes 4.4 et 4.5 au besoin. Concentrez-vous sur la pointe de la tuyauterie.
  6. Concentrez-vous vers le bas à la couche supérieure de perle du gel pour évaluer à quelle distance le tuyau est de la surface du gel. Concentrez-vous sur un plan qui est à mi-chemin entre le gel et la pointe de la tuyauterie. Abaissez lentement la tuyauterie pour atteindre le plan focal intermédiaire.
  7. Répétez l'étape 4.6 jusqu'à ce que des ombres très faibles de la pointe de la micropipette peuvent être appréciés en se concentrant sur l'hydrogel. Augmenter au grossissement le plus élevé suivant.
  8. Abaisser le micromanipulateur jusqu'à ce que les ombres et les réfractions de l'extrémité même de la micropipette puissent être appréciées dans le plan focal de couche de perle.
  9. Augmentez le grossissement à celui qui sera utilisé dans l'expérience. Baisser la tuyauterie jusqu'à ce qu'elle plane juste au-dessus de la surface de l'hydrogel.

5. Calibrating le micromanipulateur et la génération de force

  1. En phase ou brightfield, abaisser la micropipette en vol stationnaire pour toucher la surface de l'hydrogel. Observez comment le tuyauterie regarde le contact avec l'hydrogel. Continuer à abaisser la micropipette en Z jusqu'à ce que les ajustements en X et Y provoquent la traction et la déviation de l'hydrogel dans ces directions. Utilisez les microsphères ou les cellules voisines comme marques fiduciaires.
    REMARQUE: Si le micromanipulateur est attaché au bras condensé de phase ou au banc et non à l'étape de l'échantillon elle-même, désengagez toujours le gel avant de déplacer la scène pour éviter de casser le tuyautisme ou de déranger les cellules. Si la tuyauterie se casse, retournez à l'étape 3 et à l'étape 4.
  2. Trouver une zone dépourvue de cellules pour engager le gel. Tirez-le dans toutes les directions et se familiariser avec la façon dont la micromanipulation se traduit par la déformation du gel.
  3. Prenez des images fluorescentes du champ de perles sans manipulation, avec la pipet engageant le gel, et avec la pipet engagé tirant le gel. Répétez cette répétition plusieurs fois en prenant de bonnes notes concernant les marques de tiques sur le micromanipulateur, la façon dont la pointe pipet regarde en phase ou brightfield à chaque étape de la traction, et la distance de la pointe se déplace en utilisant cette manipulation.
  4. Utilisez ImageJ comme décrit précédemment16,17 pour calculer les déplacements relatifs de perles et la force appliquée aux perles en comparant le champ de perles nulles au champ de perles sans engagement de pipet, le champ de perles avec le gel engagé, et le gel tiré.
  5. Pour affiner le stimulus tensionnel, comparez l'application de force en utilisant différentes dimensions de pointe de micropipette, distances de la cellule, ou distance tirée par le micromanipulateur du point initial du toucher. L'effet de la dimension de pointe de micropipette sur l'application de force donne une grande flexibilité à l'utilisateur mais démontre également la nécessité de générer des cartes de force pour de nouvelles micropipettes, même lorsque les dimensions et la forme ressemblent étroitement à des pointes précédemment calibrées.

6. Conduite de l'assay durotaxis

  1. Avant d'effectuer l'expérience, pratiquez l'engagement du gel près d'une cellule et observez la déformation de la cellule lorsque le micromanipulateur est repositionné.
  2. Surveillez un groupe de cellules qui ont une polarité claire et semblent se déplacer pendant 30 min pour identifier les cellules qui se déplacent d'une manière dirigée.
  3. Choisissez une cellule qui se déplace dans une seule direction claire et surveillez-la à la fréquence d'image désirée pendant 30 min supplémentaires.
  4. Si la détermination des forces exercées sur la cellule ou la tension exercée par la cellule est souhaitée, capturez des images de champ de perles à chaque acquisition. Si la cellule change de direction pendant la surveillance, choisissez une cellule différente à surveiller car cela rendra difficile de déterminer l'effet de la stimulation.
  5. Engagez l'hydrogel à environ 50 m de la cellule. Placez la pipet devant le côté proche du bord d'avant et déplacez le micromanipulateur de telle sorte que le gel est déformé orthogonalement dans la direction de déplacement de la cellule. Observez la cellule au fil du temps car elle réagit au gradient aigu et local de rigidité.
    REMARQUE: Le moment fourni ici est efficace lors de la surveillance des fibroblastes SKOV3 ou Ref52, cependant, l'intervalle et le cours de temps global doivent être ajustés en fonction du type de cellule et de l'événement biologique observé. Si vous faites un jumelage avec la microscopie à fluorescence, suspendez l'acquisition fluorescente immédiatement avant l'étape 6.5., utilisez le contraste de phase ou le champ lumineux pour positionner la micropipette et tirez, et redémarrez l'acquisition fluorescente immédiatement après.
  6. Si le tuyautre ou si le gradient est autrement détendu ou libéré, trouvez une nouvelle cellule en répétant les étapes 6.2 et 6.3.

7. Détermination de la réponse migratoire durotactique

  1. À l'aide d'ImageJ19 ou d'un autre programme d'analyse d'image, calculez l'angle de virage en traçant une ligne entre le milieu du bord d'avant de la cellule à 0 min et 30 min de moniteur de poste (reflétant la trajectoire d'origine de la cellule) et une autre ligne entre le milieu de le bord d'avant juste avant et 80 min après stimulation et la mesure de l'angle entre ces deux lignes.

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Representative Results

En préparant des micropipettes (figure 1) et en normalisant la génération de force des tractions (figure 2 et figure 3) comme décrit ci-dessus, des conditions durotactiques optimales ont été identifiées pour plusieurs lignées cellulaires. À l'aide de cette technique, telle qu'elle est décrite à la figure 4, les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-317 et les fibroblastes embryonnaires de rat Ref52 (figure 5) se dirigent vers une rigidité accrue des gradients appliqués par une micropipette en verre. En plus de durotaxis, cette méthode peut être utilisée pour étudier les événements de signalisation dynamique à l'aide de biocapteurs et de marqueurs fluorescents. Par exemple, la structure et la signalisation dans les structures d'adhérence focale peuvent être observées sur la stimulation durotactic. Le capteur de tension de Vinculin (VinTS) est un biocapteur basé sur fret qui localise aux adhérences focales, permettant l'observation fluorescente de la dynamique focale d'adhérence et la mesure des changements de tension dans ces structures19. Ref52 cellules exprimant transitoirement VinTS sur 125 kPa gels polyacrylamide montrent la formation d'adhérences focales dans le sens de l'étirement au cours de la période de 40 min (Figure 6A). L'analyse20 du FRET révèle que la vinculane localisée aux adhérences focales subit un changement immédiat de tension lorsqu'elle est présentée avec une stimulation durotacticale aigue (Figure 6B) élargissant l'utilité de cet analyse à l'observation de la sous-cellulaire en réponse à la stimulation durotactic.

Figure 1
Figure 1. Diagrammes de micropipettes typiques tirées (A) et forgées (B). (A) Les micropipettes sont tirées à l'aide d'un protocole en deux étapes pour atteindre un cône de 1 mm à 10 m sur 2 mm. (B) Les micropipettes sont ensuite chargées dans la microforge et leurs pointes sont pliées, fermées et raccourcies de sorte que les 250 derniers m de la la micropipette est pliée à un angle de 35 degrés et s'effiloche de 30 m à une pointe arrondie qui mesure 15 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Amélioration du champ de perles après revêtement d'éthanol par rapport à la méthode traditionnelle utilisant la poly-L-lysine. Champs représentatifs de perles d'hydrogel provenant des méthodes de revêtement de couverture d'évaporation de poly-L-L-lysine et d'éthanol (EtOH) utilisant des perles fluorescentes jaune-vert, rouge et rouge foncé. Barre d'échelle : 25 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. Carte de génération de force pour un étirement durotactic d'exemple. (A) Position des microsphères fluorescentes avant et après (vert et rouge pseudo-colorés, respectivement) déformant l'hydrogel avec une micropipette (située au-delà du bord droit du panneau). Barre d'échelle : 25 m. Les vecteurs de déplacement (B) et la carte thermique de déplacement (C) entre les champs de perles nulles et tirés générés par les plugins de microscopie de traction force dans ImageJ mettent en évidence le gradient de la déviation de perles et de la souche hydrogel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. Schéma tique de l'assay durotaxis et détermination de l'angle de déviation. (A) Une cellule est observée pendant au moins 30 min pour déterminer sa trajectoire d'origine. (B) La micropipette est positionnée orthogonalement sur la trajectoire de la cellule, à 50 m du bord cellulaire. L'hydrogel est engagé par la micropipette de telle sorte que le déplacement de la micropipette exercera une force sur la surface de l'hydrogel. (C) La micropipette est tirée à 20 m supplémentaires de la cellule, orthogonale à la trajectoire de la cellule qui crée un gradient de tension local aigu (dénoté en bleu) qui augmente vers la micropipette. (D) La cellule est observée au fil du temps pendant qu'elle navigue le gradient appliqué. (E) Dans ImageJ ou un programme d'analyse d'images, la trajectoire originale (ligne pointillée) est marquée par une ligne tracée au milieu de la cellule à travers le centre du bord d'avant dans la première image. La trajectoire finale (ligne solide) est marquée par une ligne tracée après que la cellule est autorisée à naviguer dans le gradient de tension appliqué. L'angle entre ces deux lignes vers le stimulus est appelé « angle de virage », marqué ici par . S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5. Les fibroblastes embryonnaires de rat se déplacent vers des régions de rigidité accrue de substrat dans le durotaxis. Cours de temps montrant le mouvement durotactic d'une cellule Ref52 10 min avant la traction (panneau 1), 1 min avant la traction (panneau 2), au moment de la traction (panneau 3), et 1 h après traction (panneau 4). La flèche indique la direction de l'étirement. Barre d'échelle : 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6. Localisation et activité des protéines pendant la stimulation durotactic à l'aide de marqueurs fluorescents ou de biocapteurs. Les cellules Ref52 exprimant transitoirement le capteur de tension de Vinculin (VinTS)19 migrant sur 125 gels polyacrylamide de kPa sont présentées avec la stimulation durotactic aigu. (A) Après stimulation, de nouvelles adhérences focales se forment dans le sens de l'étirement lorsque les cellules se réorientent le long du gradient de rigidité. Pendant deux périodes de 10 minutes, à partir de 20 minutes avant la stimulation mécanique et 21 min après stimulation, la morphologie cellulaire (en haut) et la formation d'adhérence focale (en bas) ont été surveillées. La couleur rouge indique le premier point de temps dans la période de temps et la couleur verte indique le point de temps 10 min plus tard. Les nouvelles adhérences focales formées au cours de la période de 10 minutes sont indiquées en vert. Avant la stimulation, de nouvelles adhérences focales se forment dans le sens du voyage. Après stimulation, de nouvelles adhérences focales se forment dans le sens de l'étirement. La flèche indique la direction de l'étirement. Les pointes de flèche indiquent les zones avec des adhérences focales formées au cours de cette période de 10 min. Barre d'échelle : 25 m. (B) L'analyse fret de la fluorescence de VinTS indique un changement de tension dans les adhérences focales proximales à l'étirement durotactic. Le contour de la membrane cellulaire avant et après l'étirement accentue la déformation de la cellule lors de la stimulation. Arrowheads indiquent des exemples d'adhérences focales éprouvant des changements dans le rapport FRET sur l'étirement. Barre d'échelle : 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Rigidité d'hydrogel désirée 3 kPa 25 kPa 125 kPa
7,5% Acrylamide 100 l 100 l 160 l
0,5% Bis-Acrylamide 10 l 100 l 100 l
ddH2O 287 l 197 l 137 l

Tableau 1. Solutions de gel d'acrylamide.

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Discussion

Démontré ici est un reproductible, un seul-cellule durotaxis analyse qui permet d'évaluer la capacité d'une cellule à modifier son comportement de migration en réponse à des indices mécaniques aigus. Cette technique peut également être utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence et des protéines de fusion ou biocapteurs appropriés pour examiner la signalisation sous-cellulaire et les événements cytosquelettiques dans les secondes suivant la stimulation mécanique ou sur une plus longue période de temps pendant mouvement durotactic. Comprendre la relation d'une cellule avec son environnement implique l'étude de l'impact des aspects chimiques et mécaniques de cet environnement. Bien que potentiellement difficile à maîtriser, cet analyse durotaxis peut être largement utilisé pour comprendre la réponse cellulaire aux changements dans son microenvironnement mécanique.

Importance par rapport aux méthodes existantes

Comme mentionné précédemment, cette méthode de stimulation durotacticàe basée sur la micropipette est très manipulable, permettant un degré élevé de contrôle spatiotemporal sur les stimuli mécaniques, un avantage majeur par rapport à d'autres techniques, telles que pré-formé linéaire ou des gradients de rigidité. L'ampleur et la direction des gradients de tension transmis peuvent être visualisées en suivant le déplacement des perles fluorescentes encastrées dans l'hydrogel, près de la surface de culture cellulaire.

Limiter ces marqueurs fiducial à une seule couche juste en dessous de la surface de la culture augmente la précision de ce suivi. Les microsphères situées sous le plan de déflexion (transmises soit par la micropipette, soit par microscopie de force de traction, par contractilité cellulaire), comme le ferait le mélange des microsphères uniformément dans l'hydrogel, se déplaceront moins que dans l'avion microsphères, ce qui peut conduire à une sous-estimation des forces appliquées. En outre, cette modification est plus facile à effectuer et plus fiable que les méthodes dans lesquelles les perles sont superposées dans une couche extrêmement mince de polyacrylamide moulé sur le dessus d'un gel pré-formé21 ou apporté à la surface de l'hydrogel par le réglage assisté par gravité22 et produit une dispersion plus uniforme de perles à travers l'hydrogel que les méthodes précédemment décrites17,23.

Modification et applications futures

Les détails de cet analyse peuvent être modifiés pour mieux convenir à la ligne d'intérêt cellulaire. Par exemple, une variété de molécules de matrice extracellulaire (parexemple, collagène I, collagène IV, laminine) ou d'autres ligands adhésifs peuvent être utilisés pour fonctionnaliser l'hydrogel. En outre, la rigidité de départ de l'hydrogel peut facilement être soulevée ou abaissée en atunisant le rapport de l'acrylamide au bis-acrylamide (voir tableau 1). En modifiant les dimensions de la pointe de la micropipette et l'ampleur de la traction, cet analyse peut être optimisé pour transmettre un stimulus durotactic reproductible et efficace pour le type de cellule en question.

Étapes critiques et dépannage

Seules les cellules suivant une trajectoire régulière et linéaire de la migration avant la manipulation de l'hydrogel devraient être stimulées pour s'assurer que les changements de trajectoire sont dus au stimulus mécanique et non à la fluctuation aléatoire. Il faut prendre soin de fabriquer une micropipette en verre qui engage la surface de l'hydrogel sans glisser, mais ne déchire pas le gel lorsqu'il est tiré. Il est important d'appliquer un étirement régulier et constant à l'hydrogel au cours de l'expérience pour obtenir des résultats propres, ce qui signifie que l'utilisateur doit être pratiqué au placement et au déplacement de la micropipette avant de rencontrer une cellule. Tout mouvement involontaire de la micropipette qui conduit à des changements dans le gradient de tension pourrait affecter la capacité de la cellule à durotax. De même, la manipulation du gel doit être pratiquée avec chaque nouvelle micropipette qui est forgée comme de légers changements dans la forme de pipet peut causer l'interaction pipet / gel de varier.

Le fait de ne pas positionner la micropipette dans le champ de vision microscopique avant d'augmenter le grossissement peut entraîner la rupture accidentelle de la pointe de verre fragile. Assurez-vous que la hauteur et la position X-Y de la pointe sont connues avant d'abaisser la micropipette avec le micromanipulateur. Surveillez toujours la position de la micropipette pour réduire le risque de rupture. Il est recommandé que le grossissement soit réduit à 10X pour chaque nouvelle micropipette chargée dans le micromanipulateur car de légers mouvements du micromanipulateur et de la gaine de pipet peuvent conduire à de grands changements apparents dans la position du nouveau chargé Micropipette.

Avant de trouver des cellules à observer, il est important de tester d'abord la micropipette pour confirmer qu'elle engagera l'hydrogel comme prévu et qu'il convient à l'application de l'étirement désiré. Trouver des dimensions de pointe qui conviennent à l'expérience et au type de cellule est essentiel au succès dans l'application de la stimulation durotactique. L'extrémité de la micropipette doit être suffisamment arrondie pour qu'elle ne perce pas le gel, mais pas si arrondie qu'elle ne le saisit pas. Si le tuyau ne tire pas le gel efficacement, il peut glisser le long de la surface. La forme de la pointe de micropipette peut être trop arrondie pour s'engager correctement avec la surface du gel. Les dimensions à l'extrémité même de la micropipette doivent être ajustées jusqu'à ce qu'un contact ferme et régulier puisse être atteint de façon cohérente. Dans certains cas où la micropipette glisse sur la surface du gel, il peut être nécessaire d'abaisser la micropipette plus loin dans l'hydrogel pour gagner plus de traction. Si la micropipette déchire le gel, la pointe peut être trop fine ou trop forte. La déchirure du gel peut également indiquer qu'une trop grande force est appliquée en tirant. La micropipette doit être légèrement augmentée pour réduire la déformation du gel et tirer des distances plus courtes.

Souvent, si la cellule ou le bord de la cellule est retiré de la mise au point par la micropipette, la pointe de la micropipette est engagée trop près de la cellule ou l'étirement est trop puissant. Déplacez la micropipette plus loin de la cellule, ne déformant que légèrement la cellule dans les plans X-Y. Déplacer la cellule hors de la mise au point ne fera pas seulement des événements cellulaires impossibles à surveiller et provoquer des aberrations optiques, mais il fera la cellule à l'expérience plus de stimulation que le gradient de tension en deux dimensions prévu.

Plus important encore, il est essentiel d'enregistrer et d'analyser uniquement les réponses qui ont une manipulation durotactique cohérente avec une erreur humaine minimale. Si l'abaissement de la pointe est imprécis ou si la micropipette est repositionnée, les résultats de l'expérience seront obscurcis. Étant donné que cet analyse est complexe et que de nombreuses étapes sont sujettes à l'erreur, il faut prendre soin d'éviter les changements involontaires dans la stimulation des cellules. L'échec à n'importe quelle étape peut conduire à une application d'étirement incohérente et des résultats peu fiables.

Limitations

Il y a des limites à cette technique qui devraient être considérées. Plus important encore, la forge et la manipulation précises des micropipettes en verre peuvent présenter une courbe d'apprentissage abrupte pour les nouveaux utilisateurs. En outre, la position et l'ampleur de la traction hydrogel doivent être optimisées pour différentes lignées cellulaires. L'examen des déplacements fluorescents de perle avant et après la manipulation d'hydrogel peut aider avec cet aspect de la technique. En outre, tandis que la technique permet l'observation spatiotemporal élevée du comportement durotactic dans les cellules individuelles, ceci lui fait un assay de bas-débit. Il est donc important de souligner que cet analyse peut également être complété par d'autres techniques avec une manipulabilité plus faible, mais un débit plus élevé, comme l'utilisation d'hydrogels avec des gradients préformés de rigidité, pour analyser le comportement durotactic de plus grande populations de cellules à la fois. En résumé, le degré élevé de contrôle spatiotemporal des indices mécaniques offerts par l'analyse durotactic monocellulaire le rendent très utile pour l'analyse des mécanismes moléculaires contribuant au comportement durotactic de beaucoup de différents types de cellules sous beaucoup Conditions.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

aucun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide 40 %  National Diagnostic EC-810
Ammonium Persulfate  Fisher BP179-25
BD20A High frequency generator Electro Technic Products 12011A 115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( Sigma Aldrich M6514
Bis-acrylamide 2%  National Diagnostic EC-820
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner Bransonic 40 kHz frequency
Coarse Manipulator Narshige MC35A
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM without phenol red Sigma Aldrich D5030
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narshige PC-10
Epidermal Growth Factor Peprotech AF-100-15
Ethanol Pharmco-aaper 111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) Gibco A31606-02
Fibronectin  EMD Millipore FC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um  Invitrogen F8810, F8807, F8811
Fugene 6 Roche 1815091 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish
Glacial Acetic Acid Fisher Chemical A38SI-212
Glass Bottom Dish CellVis D60-60-1.5-N
Glass Coverslip Electron Microscopy Sciences 72224-01 22 mm, #1.5
HCl JT Baker 9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrate Sigma Aldrich Z805939 Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powder Sigma Aldrich H3375 Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light Uviton International UV0338
Isopropanol Fisher Chemical A417-4
Microforge Narshige MF900
Micromanipulator Narshige MHW3
Mineral Oil Sigma Aldrich M5904
Nanopure Life Science UV/UF System Barnstead D11931 ddH2O
Nikon Eclipse Ti Nikon
OptiMEM Invitrogen 31985062
Parafilm M Bemis Company, Inc PM-992
PBS 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) Sigma Aldrich P4056
Ref52 Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3 American Type Culture Collection Culture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH  Covachem  12414-1
Tabletop Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
TEMED  Sigma Aldrich T9281-50

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