Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

Neuroscience

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Summary

Este protocolo descreve a construção de uma matriz híbrida do Microdrive que permita a implantação de nove tetrodes independentemente ajustáveis e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone em duas regiões do cérebro em ratos livremente moventes. Também é demonstrado um método para recuperar e reusar com segurança a sonda opto-silício para múltiplos propósitos.

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Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (150), e60028, doi:10.3791/60028 (2019).

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Abstract

As gravações neurais multiregionais podem fornecer informações cruciais para compreender as interações de escala de tempo fino entre várias regiões cerebrais. Entretanto, os projetos convencionais do Microdrive permitem frequentemente somente o uso de um tipo de elétrodo para gravar das únicas ou das regiões múltiplas, limitando o rendimento de únicas-unidade ou de gravações do perfil da profundidade. Ele também geralmente limita a capacidade de combinar as gravações de eletrodos com ferramentas optogenéticas para direcionar a atividade de caminho e/ou tipo de célula específica. Aqui apresentamos um array híbrido de Microdrive para ratos que se deslocam livremente para otimizar o rendimento e uma descrição de sua fabricação e reutilização da matriz de Microdrive. O projeto atual emprega nove tetrodes e uma ponta de prova do opto-silicone implantada em duas áreas diferentes do cérebro simultaneamente em ratos livremente moventes. O tetrodes e a sonda opto-silício são independentemente ajustáveis ao longo do eixo dorsoventral no cérebro para maximizar o rendimento das atividades unitárias e oscilatórias. Esta matriz de Microdrive também incorpora uma set-up de luz, mediando a manipulação optogenética para investigar as respostas específicas do tipo regional ou celular e funções de circuitos neurais de longo alcance. Além, a ponta de prova do opto-silicone pode com segurança ser recuperada e reúso após cada experimentação. Como a matriz de Microdrive consiste em peças impressas em 3D, o design de microdrives pode ser facilmente modificado para acomodar várias configurações. Descrito pela primeira vez é o projeto da matriz de Microdrive e como anexar a fibra óptica a uma sonda de silício para experimentos de optogenética, seguido pela fabricação do pacote tetrode e implantação da matriz em um cérebro do mouse. A gravação de potencialidades locais do campo e da unidade que spiking combinou com a estimulação optogenética igualmente demonstra a viabilidade do sistema da disposição do Microdrive em ratos livremente moventes.

Introduction

É crucial compreender como a atividade neuronal apoia o processo cognitivo, tal como a aprendizagem e a memória, investigando como as regiões cerebrais diferentes interagem dinamicamente uns com os outros. Para elucidar a dinâmica da atividade neural subjacente às tarefas cognitivas, a eletrofisiologia extracelular em grande escala tem sido conduzida em animais que se deslocam livremente com o auxílio de matrizes de Microdrive1,2,3, a 4. Nas últimas duas décadas, vários tipos de Microdrive array foram desenvolvidos para implantar eletrodos em múltiplas regiões cerebrais para ratos5,6,7,8 e camundongos9, 10 de , 11 anos de , 12. no entanto, os projetos atuais do Microdrive geralmente não permitem o uso de tipos múltiplos da ponta de prova, forçando investigadores a escolher um único tipo do elétrodo com benefícios e limitações específicos. Por exemplo, as matrizes tetrode funcionam bem para regiões cerebrais densamente povoadas, como o hipocampo dorsal CA11,13, enquanto sondas de silício dão um melhor perfil geométrico para estudar conexões anatômicas14 , quinze anos.

Tetrodes e sondas de silício são freqüentemente usados para gravação in vivo crônica, e cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Tetrodes provaram ter vantagens significativas na melhor isolação da única unidade do que os únicos elétrodos16,17, além do que a eficácia de custo e a rigidez mecânica. Eles também fornecem rendimentos mais elevados de atividades de unidade única quando combinados com microdrives8,18,19,20. É essencial aumentar o número de neurônios simultaneamente gravados para compreender a função dos circuitos neurais21. Por exemplo, um grande número de células é necessário para investigar pequenas populações de tipos de células funcionalmente heterogêneas, como22 ou recompensa relacionadas ao tempo23 células. Os números de pilha muito mais elevados são exigidos para melhorar a qualidade da decodificação de seqüências do ponto13,24,25.

Tetrodes, no entanto, tem uma desvantagem na gravação de células distribuídas espacialmente, como no córtex ou no tálamo. Em contraste com tetrodes, sondas de silício podem fornecer distribuição espacial e interação de potenciais de campo local (lfps) e atividades de spiking dentro de uma estrutura local14,15. As sondas de silício com várias hastes aumentam ainda mais o número de locais de gravação e permitem a gravação em estruturas únicas ou vizinhas27. Entretanto, tais matrizes são menos flexíveis no posicionamento de locais do elétrodo comparados a tetrodes. Além disso, os algoritmos de classificação de Spike complexos são necessários em sondas de alta densidade para extrair informações sobre potenciais de ação de canais vizinhos para espelhar os dados adquiridos por tetrodes28,29,30. Daqui, o rendimento total de únicas unidades é frequentemente menos do que tetrodes. Além disso, as sondas de silício são desvantajosas devido à sua fragilidade e alto custo. Assim, a escolha de tetrodes vs. sondas de silício depende do objetivo da gravação, que é uma questão de saber se a obtenção de um alto rendimento de unidades únicas ou perfil espacial nos locais de gravação é priorizada.

Além de registrar a atividade neural, a manipulação optogenética tornou-se uma das ferramentas mais poderosas na neurociência para examinar como tipos específicos de células e/ou caminhos contribuem para as funções do circuito neural13,31, 32,33. Entretanto, as experiências optogenética exigem a consideração adicional no projeto da disposição do Microdrive para unir o conector da fibra às fontes luminosas da estimulação34,35,36. Muitas vezes, a conexão de fibra óptica requer uma força relativamente grande, o que pode levar a uma mudança mecânica da sonda no cérebro. Portanto, não é uma tarefa trivial para combinar uma fibra óptica implantável para matrizes de Microdrive convencionais.

Pelas razões acima, os pesquisadores são obrigados a otimizar a seleção do tipo de eletrodo ou para implantar uma fibra óptica, dependendo do objetivo da gravação. Por exemplo tetrodes são usados para alcançar maior rendimento unitário no hipocampo1,13, enquanto sondas de silício são usadas para investigar o perfil de profundidade laminar de áreas corticais, como o córtex entorrinal medial (MEC)37. Atualmente, microdrives para implantação simultânea de tetrodes e sondas de silício haviam sido relatados para os ratos5,11. No entanto, é extremamente desafiador para implantar múltiplas sondas de tetrodes e silício em camundongos por causa do peso dos Microdrives, espaço limitado na cabeça do mouse e requisitos espaciais para projetar o Microdrive para empregar diferentes sondas. Embora seja possível implantar sondas de silício sem um Microdrive, este procedimento não permite o ajuste da sonda e diminui a taxa de sucesso da recuperação da sonda de silício12,38. Além disso, experimentos optogenéticos exigem considerações adicionais no design de matriz de Microdrive. Este protocolo demonstra como construir e implantar uma disposição do Microdrive para a gravação crônica em ratos livremente moventes, que permite a implantação de nove tetrodes independente ajustável e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone. Esta matriz de Microdrive também facilita experimentos optogenéticos e recuperação da sonda de silício.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) do centro médico do sudoeste da Universidade do Texas.

1. preparações de peças de matriz de Microdrive

  1. Imprima as peças da matriz de Microdrive usando uma impressora 3D usando resina modelo dental (Figura 1a, B). Assegure-se de que a espessura de camadas impressas 3D individuais seja inferior a 50 μm para manter os pequenos furos nas peças impressas claras e viáveis.
    Nota: a matriz de Microdrive consiste em cinco partes (Figura 1C): (1) o corpo principal da matriz de Microdrive, que inclui nove Microdrive-parafusos para tetrodes e um parafuso para uma sonda de silício (Figura 1CA-d). A coordenação do feixe e do furo tetrode para a ponta de prova do opto-silicone na parte inferior depende das coordenadas da área do cérebro do alvo (Figura 1Cd); (2) um vaivém para fixar uma sonda de silício ou um optrode (Figura 1Ce); (3) um conector elétrico da ponta de prova monta para prender o conector da ponta de prova do silicone (Figura 1CF); (4) um suporte da virola da fibra que grampos à parte center do corpo para impedir movimentos indesejados da ponta de prova implantada do opto-silicone ao obstruir/desconectar um conector da fibra óptica (Figura 1Cg); e (5) um cone de blindagem que fornece blindagem física e elétrica para a matriz de Microdrive para gravação estável (Figura 1Ch). O peso total da matriz de Microdrive é 5,9 g, incluindo o cone de blindagem (tabela 1). Se os furos são obstruídos nas peças impressas, perfurar para fora os furos usando bocados de broca: #76 para os furos internos e #68 para os furos exteriores para parafusos do tetrode-Microdrive, #71 para o furo do suporte do Microdrive-parafuso do tetrode, e #77 para os furos para os bornes da guia na parte inferior de o corpo.
  2. Inserção de postes de guia no corpo da matriz de Microdrive.
    1. Corte 2 16 mm de comprimento de 26-GA fio de aço inoxidável. Afie delicadamente as pontas do fio usando um moedor giratório.
    2. Insira os fios nos orifícios inferiores do corpo (Figura 2a). Aplique uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato na parte inferior do corpo para fixar os postes de guia.

2. preparação da sonda de Opto-silício

  1. Prepare o parafuso de Microdrive para uma sonda de silício.
    Nota: o parafuso de Microdrive para a sonda de silício consiste em um parafuso personalizado (Pitch de 300 μm), suportando um tubo de suporte e um tubo em forma de L (Figura 2b).
    1. Prepare o molde para a cabeça do Microdrive (Figura 2C). Para construir o molde, prepare o padrão de plástico impresso em 3D do Microdrive (Figura 2Ca). Em seguida, despeje gel de silicone líquido depois de fazer uma parede temporal, colocando fitas em torno do padrão. Retire as bolhas de ar agitando suavemente, aguarde até que seja curada, em seguida, retire o molde de silicone-gel do padrão (Figura 2Cb).
    2. Corte 18 mm e 9,5 mm de comprimento de 23 G de fio inoxidável usando um moedor rotativo. Roughen os 2-3 milímetros superiores dos fios com um moedor giratório para realçar a adesão do acrílico dental.
    3. Tome um parafuso feito encomenda e aplique a pequena quantidade de óleo de silicone para reduzir a fricção com o acrílico dental. Definir os fios e um costume-parafuso para o molde.
    4. Derrame o acrílico dental no molde usando uma seringa para eliminar bolhas de ar em torno dos fios e dos parafusos. A contaminação da bolha de ar fará o Microdrive frágil. Espere até que o acrílico dental esteja curado inteiramente, a seguir Tire os parafusos do Microdrive do molde. Dobre 6 mm da ponta do fio mais longo para um ângulo de 60 ° usando alicates.
    5. Verifique a qualidade dos parafusos de Microdrive (por exemplo, rachaduras, bolhas de ar e atrito) para girar o parafuso. Se houver fricção elevada, gire o parafuso até que se tornem lisos usando um excitador de parafuso elétrico com uma ponta personalizada do excitador, que acopla com o parafuso do Microdrive.
    6. Instale o parafuso de Microdrive no corpo da matriz do Microdrive para verificar se ele se move para cima e para baixo suavemente girando o parafuso. As roscas para o parafuso são automaticamente criadas ao inserir o parafuso no orifício do corpo.
  2. Prepare o vaivém (Figura 3Aa).
    1. Corte dois comprimentos de 5 milímetros da tubulação do polyetheretherketone (auge) usando tesouras afiadas. Alinhe os tubos em ambos os lados do vaivém. Cole os tubos e transporte usando epóxi.
    2. Aplique uma pequena quantidade de óleo de silício nos postes de guia. Verifique a qualidade do transporte inserindo nas postagens do guia do corpo da matriz de Microdrive. Certifique-se de que o vaivém se move suavemente sem atrito excessivo.
  3. Prepare um optorode (Figura 3Ab). Esta etapa pode ser ignorada se um experimento optogenético não for necessário.
    1. Cleave a fibra óptica de 21 mm de comprimento usando um cortador de rubi. Moer a ponta de fibra para fazer a ponta plana e brilhante.
    2. Coloc delicadamente a fibra ótica na parte dianteira da silício-ponta de prova. A ponta da fibra é posicionada 200-300 μm acima da parte superior dos locais do elétrodo. Segure a fibra temporariamente com fita transparente.
    3. Cole a fibra óptica na base da sonda de silício usando uma pequena quantidade de epóxi. Aguarde pelo menos 5 h até que o epóxi está totalmente curado.
      Nota: recomenda-se anexar a fibra óptica do mesmo lado que os locais dos eléctrodos. Prender a fibra na parte traseira pode impedir que a luz iluminando corretamente os locais da gravação.
  4. Prenda a canela à sonda de silício (Figura 3Ac): aplique uma pequena quantidade de epóxi na parte de trás da base da sonda de silício. Prenda a parte inferior do vaivém à base da sonda de silício e segure suavemente a posição durante 2 – 3 min para evitar a formação de uma lacuna entre a base de transporte e a sonda de silício durante a cura inicial da epoxi. Aguarde pelo menos 5 h até que o epóxi está completamente curado.
  5. Insira cuidadosamente os tubos de transporte nos postes de guia do corpo principal o microscópio (Figura 3B). Durante este procedimento, segure a ranhura do vaivém com pinças finas.
  6. Insira o parafuso Microdrive no orifício do parafuso rodando o parafuso. Envolva a sonda de silício e o Microdrive-Screw inserindo a ponta do fio em forma de L na ranhura da cabeça do vaivém (Figura 3C).
  7. Fixe o suporte do conector elétrico da sonda ao corpo da matriz de Microdrive (Figura 3D).
    1. Corte dois parafusos #0 para 3,5 mm de comprimento da rosca. Moer as pontas para remover rebarbas.
    2. Coloque o suporte do conector da sonda no corpo. Coloque o conector elétrico da sonda de silício no suporte.
    3. Fixe o conector da sonda de silício no suporte usando epóxi e certifique-se de não colá-lo no corpo da matriz de Microdrive para permitir o procedimento de recuperação da sonda de silício. Insira os parafusos para segurar o suporte do conector da sonda.
  8. Fixe o suporte de virola à sonda opto-Silicon e ao corpo da matriz de Microdrive (Figura 3D).
    1. Corte dois parafusos #0 a 6 mm de comprimento da rosca. Moer as pontas para remover rebarbas.
    2. Moer o exterior de duas porcas #0 parafuso da máquina para fazer pequenas porcas sextavadas com 2,5 – 3,0 mm de diâmetro exterior para reduzir o peso e o espaço.
    3. Insira os parafusos no componente A do suporte. Cole as cabeças do parafuso usando epóxi.
    4. Aplique uma pequena quantidade de graxa de silício ao componente a e B para reduzir o atrito com o corpo. Insira o componente A no corpo e, em seguida, segure temporalmente usando pinças inversas.
    5. Coloque o componente B no parafuso do componente A. Rosqueie as porcas personalizadas nos parafusos. Use alicates para apertar as porcas para fixar o suporte do virola no corpo.
    6. Insira a ponteira de fibra na ranhura do porta-virola de fibra (componente B). Assegure-se de que a virola de fibra esteja furando 4 – 5 milímetros fora do suporte.
    7. Aplique uma pequena quantidade de epóxi entre a virola e o sulco do suporte. Aguarde até que o epóxi esteja totalmente curado e verifique se a ponteira não se move. Verifique a canela e o suporte do virola para o movimento liso afrouxando as porcas antes de girar o Microdrive-Screw.
    8. Verifique a distância de trabalho da sonda. Certifique-se de que a ponta da sonda se retraí completamente no corpo quando o suporte de virola está na posição superior, enquanto os tubos de transporte ainda estão associados com os postes de guia. A distância máxima de trabalho é determinada pelo comprimento da sonda de silicone e a região do cérebro alvo.
    9. Se o Microdrive-Screw é frouxo, aplique a pequena quantidade de acrílico dental em torno do parafuso para adicionar mais linhas para a sustentação. Quando é curado, gire o parafuso para verific a tensão e a estabilidade.

3. tetrode preparação

Nota: este procedimento é semelhante ao publicado anteriormente artigos8,19,20,39.

  1. Prepare os parafusos de Microdrive para o tetrode. O Microdrive para um tetrode consiste em um parafuso feito-à-medida e em uma tubulação de 23 G (Figura 2b). Este procedimento é semelhante à secção 2,1.
  2. Faça um pacote de 30 tubos de aço inoxidável G que tem um fio de 5,5 mil dentro. Neste caso, utilizou-se um total de 9 30 G de tubos (oito tetrodes de gravação e um eletrodo de referência).
  3. Passe o pacote de 30 G da parte inferior do corpo da unidade e fixe-os com tubos de parede fina de 20 G para o corpo principal. Aparar a parte inferior do pacote com um moedor rotativo para fazer a ponta mesmo e flush. Aparar a parte superior dos tubos de 30 G com um moedor rotativo para que o tubo de 30 G se sobressaia cerca de 0,5 mm do corpo principal.
  4. Carregue 5,5 mil tubos de isolamento do polyimide na tubulação de 30 G. Prepare os fios tetrode e carregue-os em uma placa de interface elétrica (BEI) de 32 canais. Verifique a conexão elétrica com o testador de impedância antes do corte de precisão final.
  5. Abaixe a impedância da ponta do elétrodo a 250-350 kΩ com solução do chapeamento de ouro. Conserte todos os tetrodes com supercola.
  6. Encha a abertura excessiva entre o tubo do polyimide e o tetrode com óleo mineral para a selagem e a lubrificação. Encaminhar o fio terrestre para o BEI.
    Nota: se necessário, a fibra óptica pode ser integrada ao longo de fios tetrode12.

4. fixar o cone de blindagem

  1. Pinte a pintura de blindagem condutora de prata no interior do cone impresso. Coloque a matriz de Microdrive dentro do cone (Figura 3E).
  2. Corte dois parafusos #0 para 3,5 mm de comprimento da rosca. Aperte os parafusos do lado de fora do cone para segurar a matriz de Microdrive no lugar.
  3. Aplique tinta prateada ao redor da cabeça do parafuso para conectar eletricamente o cone de blindagem com aterramento elétrico. Verifique a conectividade elétrica entre o fio terra e o cone. Aplique uma pequena quantidade de epóxi entre o corpo da matriz de Microdrive e o cone de blindagem para prender firmemente o corpo.
    Nota: outra maneira de preparar o cone de blindagem é usar fita de alumínio40 (Figura 3F). Primeiro, prepare o papel padrão para o cone de blindagem depois de furar a folha de alumínio ao papel (Figura 3Fa). Em seguida, role o papel e prenda-o ao corpo do Microdrive usando uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato (Figura 3Fb). O peso deste cone é de 0,72 g e o peso total da matriz de Microdrive é reduzido para 4,7 g (tabela 1).

5. cirurgia de implante

Nota: este procedimento é modificado a partir de artigos publicados anteriormente18,39,41 para implantação de dois sites. Assegure-se de que o peso do animal esteja sobre 25 g para o implante do Microdrive para uma recuperação mais rápida após a cirurgia.

  1. Preparação
    1. Para preparar um parafuso à terra, prenda o fio de prata a um parafuso do crânio e aplique a pintura de prata. Em seguida, anexar um pino de ouro para o lado oposto do fio usando tinta prateada.
    2. Prepare o adaptador de retenção de unidade para manter a matriz de Microdrive em um dispositivo estereotáxico. Prenda um conector masculino a um punho inoxidável usando a cola Epoxy. Certifique-se de que o alinhamento do cabo conector e inoxidável é reto.
    3. No caso em que a confirmação histológica é necessária após a gravação, aplicar di-I para o tetrodes ou parte traseira da sonda de silício38.
    4. Abaixe a sonda de silício para baixo para ser a profundidade desejada. Afrouxe as porcas do suporte da ponteira usando alicates, abaixe a sonda de silício (sonda opto-Silicon) girando o Microdrive-Screw da sonda de silício e aperte as porcas para fixar o suporte de virola. Ao implantar tetrodes na área hipocampal CA1 e uma sonda de silício no MEC, a distância entre a cânula tetrode e a ponta da sonda de silício é de 3 – 4 mm.
  2. Defina o rato anestesiado (0,8% – 1,5% de isoflurano) num dispositivo estereotaxico. A condição anestésica do rato é confirmada pela ausência do reflexo do dedo do pé-pitada. Aplique pomada clara aos olhos para evitar a secagem. Cubra os olhos com um pedaço de folha para proteger da exposição à luz cirúrgica forte.
  3. Desinfete o couro cabeludo do rato com iodo e isopropanol depois de raspar a pele. Faça uma incisão de 1,5 – 2,0 cm no couro cabeludo usando tesouras cirúrgicas padrão e remova o tecido sobre o crânio usando cotonetes de algodão após a aplicação subcutânea de lidocaína.
  4. Alinhe a cabeça do mouse com a ferramenta estereotótaxica. Assegure-se de que a diferença de altura entre Bregma e lambda seja inferior a 100 μm. Determine o local da craniotomia usando um Atlas e marque esses locais com um lápis esterilizado.
  5. Escorra os parafusos do crânio (diâmetro de 0,8 milímetros, passo da linha de 0,200 milímetros) girando os 1,5 voltas (0,3 milímetros) no crânio, usando pinças cirúrgicos e uma chave de fenda após a perfuração 8 – 11 furos no crânio usando a broca de 0,5 milímetros.
    Nota: 2 – 4 furos no crânio frontal, 2 – 3 furos em cada lado do crânio parietal, e 1 – 2 furos no crânio interparietal são sugeridos.
  6. Fixe o parafuso de aterramento ao orifício girando-o uma vez (0,2 mm) Após perfurar um orifício no osso interparietal. Assegure-se de que este furo não penetre através do osso no caso do cérebro; caso contrário, os sinais Cerebelares irão contaminar a gravação. Verifique se a impedância é inferior a 20 kΩ a 1 kHz entre o parafuso de aterramento e os parafusos do crânio usando um medidor de impedância.
    Nota: a impedância maior causará a introdução de artefatos de movimento durante a gravação.
  7. Realize a craniotomia nos locais marcados. A dura pode ser deixada intacta em camundongos.
  8. Conecte o pino macho do parafuso de aterramento e o conector de aterramento da matriz de Microdrive. Verifique a conectividade usando o medidor de impedância medindo entre o parafuso de aterramento e a blindagem.
  9. Defina a matriz de Microdrive para o adaptador, defina-o para o dispositivo estereotódico e abaixe lentamente a sonda de silício até a profundidade desejada. Assegure-se de que os feixes tetrode estejam coloc acima da superfície do cérebro mas ainda dentro da disposição do Microdrive quando a ponta de prova do silicone é introduzida no cérebro (figura 4a).
  10. Aplique cuidadosamente a graxa de silício para selar a área da sonda de silício e o feixe tetrode (Figura 4B). Coloque uma pequena quantidade de graxa de silício na ponta de uma agulha de 20 G e aplique a graxa em torno das sondas usando a agulha. Repita até que a graxa do silicone cubra completamente a área em torno da ponta de prova de modo que o acrílico dental não flua sobre ou debaixo dos elétrodos/pontas de prova. Tenha cuidado para não deixar a graxa tocar os locais do eletrodo, caso contrário, aumentará drasticamente a impedância dos locais de gravação.
  11. Aplique o acrílico dental para fixar a disposição do Microdrive aos parafusos de ancoragem no crânio.
    Nota: recomenda-se aplicar o acrílico dental em três camadas para evitar o calor excessivo produzido durante a cura do acrílico.
  12. Remova o adaptador da matriz de Microdrive com cuidado. Injete 1 mL de PBS subcutaneamente para evitar a desidratação. Injete 5 mg/kg de Meloxicam por via subcutânea como tratamento analgésico.
  13. Cubra o conector do silicone-Probe por uma parte de fita para impedir que toda a sujeira começ dentro das conexões elétricas. Cubra a matriz de Microdrive usando um filme plástico de parafina e tape-o no lugar.
  14. Administrar o tratamento analgésico adequado durante 3 dias (por exemplo, injeções subcutâneas de 2 mg/kg de Meloxicam uma vez por dia). Permita 3 – 5 dias para a recuperação antes de começar o ajuste tetrode. O mouse implantado após o período de recuperação é mostrado na Figura 4C.

6. recuperando a sonda de silício (figura 4D)

  1. Injetar cetamina (75 mg/kg) e dexmedetomidina (1 mg/kg) anestésicos via intraperitoneal e confirmou a ausência do reflexo do dedo do pé-pitada. Fixar o rato anestesiado por perfusing diretamente 4% paraformaldeído através do coração usando uma capa. Os métodos cirúrgicos para roedores são descritos previamente42.
  2. Afrouxe as porcas do suporte do virola usando um alicate. Em seguida, mova-o cuidadosamente para o topo do corpo girando o parafuso de ajuste para retrair totalmente a sonda de silício para dentro do corpo da matriz de Microdrive. Aperte as porcas para segurar a sonda na posição superior.
  3. Tire o cérebro do mouse para fora do fundo, quebrando o crânio do lado. A matriz de Microdrive está agora separada do animal.
  4. Remova completamente o Microdrive-Screw em forma de L que impulsiona a sonda de silício. Afrouxe e tire as porcas do suporte de virola usando alicates. Tire o componente a do suporte de virola.
  5. Desaparafuse a montagem do conector da sonda e retire-a do corpo da unidade. Verifique se a montagem do conector da sonda pode sair do corpo da matriz de Microdrive.
  6. Segure a parte superior do vaivém com pinças e, em seguida, deslize cuidadosamente o conjunto de sonda de silício para fora da matriz de Microdrive.
  7. Limpe a ponta da sonda com o limpador de lentes de contato (primeiro com enzima, depois 3% de peróxido de hidrogênio) por pelo menos 1 dia. Limpe com cuidado a ponta do elétrodo usando as almofadas do isopropanol o microscópio. Mantenha a sonda em uma caixa de armazenamento livre de estática.
    Nota: a montagem do conector de transporte e sonda permanece presa à sonda de silício e pode ser reutilizada na próxima implantação.
    Nota: algumas sondas de silício não são toleráveis com peróxido de hidrogênio. Neste caso, use a solução da lente de contato que contem a enzima proteolíticas somente.
  8. Para reutilizar o corpo da matriz de Microdrive para a próxima cirurgia, retire o acrílico dental usando uma combinação de brocas de ponta fina e pinças. Em seguida, recupere os parafusos do crânio, imersando o acrílico dental removido em acetona. Observe que a acetona dissolverá partes plásticas da matriz de Microdrive.
  9. Remova o epóxi entre o corpo do Microdrive e o cone de blindagem usando um bisturi.
    Nota: nenhuma peça adicional precisa de ser imprimida outra vez para a cirurgia seguinte se o Microdrive não é quebrado.

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Representative Results

A matriz de Microdrive foi construída dentro de 5 dias. A linha do tempo da preparação do Microdrive é descrita na tabela 2. Usando este Microdrive, nove tetrodes e uma sonda de silício foram implantados no hipocampal CA1 e MEC do mouse [21 semanas de idade/29 g peso corporal masculino pOxr1-CRE (C57BL/6 fundo)], respectivamente. Este rato transgênicas expressa CRE em neurônios piramidal da camada III de MEC. O rato foi injetado com 200 nL de AAV5-DIO-ChR2-YFP (Titer: 7,7 x 1012 GC/ml) no MEC 10 semanas antes do implante do eletrodo. Os LFPs foram gravados usando um filtro passa-baixo (1-500 Hz), e unidades de cravagem foram detectadas usando um filtro passa-alta (0,8-5 kHz). A estimulação luminosa (λ = 450 nm) foi realizada com uma largura de pulso de 1 ms a 10,6 mW de intensidade medida no final do conector de fibra. O eletrodo de referência para a gravação tetrode foi colocado na matéria branca usando um fio tetrode dedicado. A referência para a gravação da sonda de silício foi definida como o canal superior da sonda.

Após o ajuste do tetrode, o desempenho comportamental foi testado em faixa linear (Figura 5a) e em campo aberto (Figura 5b). Em ambos os experimentos, o rato explorou livremente por ~ 30 min (Figura 5AA, b, c; Figura 5Ba, b, c). Os sinais eletrofisiológicos foram registrados com sucesso sem ruído grave relacionado ao movimento durante toda a sessão de gravação (Figura 5AD, e; Figura 5 BD, e). Em seguida, a estimulação leve foi realizada no MEC para estimular os neurônios da camada III do MEC que projetam para o CA143 (Figura 6a). As atividades de cravagem espontânea (Figura 6B, C) e lfps (Figura 6D) foram registradas da sonda tetrodes e silício quando o camundongo estava dormindo. Os LFPs registrados no tetrodes mostraram grandes atividades de ondulação, sugerindo que todos os tetrodes foram posicionados nas imediações da camada de células piramidais CA1. As atividades responsivas induzidas pela luz foram observadas pela primeira vez no MEC, seguidas em CA1 com latência de 13-18 MS (Figura 6E).

Figure 1
Figura 1: visão geral da matriz de Microdrive. (A) uma visão de esqueleto da matriz de Microdrive, do lado tetrode (a) e do lado da sonda de silício (b). (B) uma imagem real da matriz de Microdrive carregada, visualizada a partir do lado tetrode (a) e do lado da sonda de silício (b). A matriz de Microdrive é colocada na fase de gabarito no painel (b). (C) peças de matriz de Microdrive 3D-Printed individuais. (a-d) O corpo da matriz do Microdrive, visto de quatro ângulos diferentes (a: vista lateral tetrode; b: vista lateral do silicone-ponta de prova; c: vista superior; d: Vista inferior). Uma visão ampliada da linha tracejada no painel (c) é mostrada na Figura 2a. (e) o vaivém, que detém e permite o ajuste da sonda de silício. Uma sonda de silício é anexada na linha tracejada no painel (e). f) o suporte do conector de sonda, que contém um conector de sonda de silício de 32 canais. (g) o suporte da virola da fibra, que prende uma virola da fibra óptica para impedir do movimento da ponta de prova ao obstruir/desconectar o conector da fibra com a luz-fonte. Esta parte consiste em dois componentes: [painel (g) e componentes A e B]. (h) o cone de blindagem impresso, que fornece blindagem física e elétrica quando pintado com material condutor. A janela do cone permite a habilidade de ver dentro da estrutura durante a preparação da disposição do Microdrive, que é coberta eventualmente por uma parte de fita ou do material 3D-printed. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: preparação de postes de guia e parafusos de Microdrive no corpo principal. (A) guia pós-preparação. (a) vista ampliada do corpo da matriz de Microdrive mostrada na Figura 1Cc. (b) guia pós-inserção nos orifícios do corpo. (B) os projetos do Microdrive-parafuso. (a) o Microdrive-Screw para uma sonda de silício, que consiste em um parafuso personalizado de 300 μm pitch, tubo de apoio, e tubo de forma L. (b) o Microdrive-Screw para um tetrode, que consista em um parafuso feito encomenda do passo de 160 μm e em um tubo de guia inoxidável de 30 G. (C) fabricação da parte superior dos Microdrive-parafusos: (a) preparação de padrões impressos em 3D do antimolde para o Microdrive-Screw. O retrato mostra um teste padrão para o Microdrive-parafuso da silício-ponta de prova. (b) o molde feito usando o teste padrão do anti-molde (a) e o material da silicone-borracha. Os Microdrive-parafusos montados são produzidos introduzindo os costume-parafusos e os fios/tubo, e derramando o acrílico dental em cada poço. Inset: magnificada vista dos poços do molde. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: conjunto de matriz de Microdrive. (A) preparação de uma sonda opto-silício. a) fixar dois tubos de guia de plástico ao vaivém. (b) colagem da fibra óptica na sonda de silício. c) fixar o vaivém na sonda opto-silício. Nesta imagem, a parte inferior do vaivém (linha tracejada) é anexada à base da sonda de silício [parte traseira da (b)]. A canela e a haste da sonda de silício devem estar em paralelo. (B) carregando o conjunto de shuttle da sonda opto-Silicon nos bornes-guia do corpo da matriz do Microdrive. (C) posição relativa do Microdrive de sonda de silício quando a sonda é completamente retraído no corpo (a) e quando posicionado no mais baixo no corpo da unidade (b). O fio da L-forma é introduzido na ranhura na canela. (D) uma vista explodida do suporte da virola da fibra e da montagem do conector da ponta de prova. (E) cone de blindagem anexado. O material condutor é pintado dentro do cone. (F) cone de blindagem alternativo usando uma fita de papel e alumínio. (a) um papel padrão. (b) um cone de blindagem alternativo anexado, que reduz 1,1 g de peso em comparação com a versão impressa em 3D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: vedação das sondas durante a cirurgia e recuperação da sonda de silício. (A) o arranjo do Microdrive e o crânio do rato após a craniotomia, antes de aplicar a silicone-graxa. A sonda de silício é inserida cerca de 2mm no cérebro neste momento. (B) aplicando a silicone-graxa em torno dos feixes do silicone-ponta de prova e do tetrode para proteger as pontas de prova do acrílico dental. (C) o mouse cronicamente implantado após o período de recuperação, quando o mouse está andando (a), grooming (b), e quando conectado ao cabo de gravação com o sistema de polia de contrabalançar (c). (D) a sonda de silício recuperada, antes (a) e após (b) imersão na solução de limpeza. Os tecidos biológicos em (a) são removidos após o processo de limpeza (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: exemplos da gravação simultânea do tetrode/silicone-sonda no CA1 hippocampal e no córtice do entorrinal medial (MEC) do rato comportando -se. (A) gravação na faixa linear. a) a faixa linear utilizada para a recodificação. (b) trajetórias da exploração do rato para ~ 30 min na pista. (c) desempenho comportamental na faixa linear. (d-e) Gravações representativas do LFP da tetrode (d) e da sonda de silício (e). (B) gravação no campo aberto. a) a câmara de campo aberta utilizada para a recodificação. (b) trajetórias da exploração do rato para ~ 30 min na câmara. (c) desempenho comportamental em campo aberto. (d, e) Gravações representativas do LFP da tetrode (d) e da sonda de silício (e). LED é anexado ao amplificador de cabeça para gravar as posições do mouse. A faixa linear e a câmara de campo aberto são conectadas com a terra elétrica para reduzir o ruído eletrostático. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: resultados representativos de gravações simultâneas no CA1 e MEC e estimulação optogenética. (A) expressão de AAV5-dio-CHR2-YFP após 4 semanas de injeção. Neurônios piramidais da camada III do MEC que projetam seus axônios do MEC dorsal ao CA1 dorsal. Linhas tracejadas: Ori, estrato Oriens; Pry, estrato pyramidale; Rad, estrato radiatum; Mol, estrato lacunosum moleculare. (B) gravação de espiga representativa de um dos tetrodes. (a) projeções de cluster 2D de picos gravados a partir do tetrode. (b) exemplos da forma de onda média do pico de três aglomerados, que são indicados por linhas tracejadas em (a). (C) gravação de espiga representativa de um dos sítios de eletrodo de sonda de silício. (a) projeções de cluster 2D de componentes principais de espiga. (b) exemplos da forma de onda média do pico de três aglomerados. Os clusters de Spike (rosa e verde) são separados dos clusters de ruído (azul). Os clusters em (B, C) são calculados usando o software KlustaKwik. (D) traços de lfps espontâneos simultaneamente gravados a partir do TETRODES em CA1 (a) e sonda de silício no MEC (b). As setas pretas indicam o tetrode mostrado no (B) e no local do elétrodo da silício-ponta de prova mostrado em (C). (E) respostas do LFP à estimulação ótica pulsada (10,6 MW, 1 MS; Arrowhead vermelho enchido) do TETRODES em CA1 (a) e sonda de silício no MEC (b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

gramas/um Número soma [Gram]
corpo principal 1,25 1 1,25
Transporte 0, 4 1 0, 4
montagem do conector da sonda 0,19 1 0,19
suporte da virola da fibra 0,1 1 0,1
cone de blindagem 1,82 1 1,82 (0,72) *
pasta condutora 0,2 1 0,2
parafuso da máquina (#00, 2 mm), para manter o BEI 0, 5 2 0,1
parafuso da máquina (#0-80, 3,5 milímetro) 0, 6 4 0,24
parafuso da máquina (#0-80, 6mm) 0, 9 2 0,18
Porca 0, 3 2 0, 6
Microdrive (tetrode) 0, 5 9 0,45
Microdrive (sonda de silício) 0,29 1 0,29
sonda de silício 0,28 1 0,28
placa de interface elétrica 0,6 1 0,6
Total 5,8 (4,7) *

Tabela 1: peso individual de cada peça de matriz de Microdrive. O peso total da matriz de Microdrive foi de 5,9 g após a fixação do cone de proteção com epóxi (* no caso de usar um cone de blindagem alternativo usando uma fita de papel e alumínio).

Procedimentos Tempo
preparação Microdrive
3D peças de impressão 1 dia de trabalho
preparação optrode
Prepare o molde para a cabeça do Microdrive 1 dia *
Preparação da cabeça de Microdrive 3 h
Anexando uma fibra óptica 3 h
Anexando uma nave auxiliar 3 h
Tetrode preparação
Prepare o molde para a cabeça do Microdrive 1 dia *
Preparação das cabeças de Microdrive 3 h
Carregando fios tetrode 1 dia de trabalho
Fixar o cone de blindagem
Pintura de blindagem durante a noite
Anexando ao corpo do Microdrive 3 h
* Estes procedimentos podem ser conduzidos em paralelo

Tabela 2: a linha do tempo da preparação do Microdrive. A impressão 3D-Parts, à espera de curar a borracha de silicone/acrílico dental/epóxi, e carregando os fios tetrode tomar a maior parte do tempo de preparação da matriz Microdrive, no total 4-5 dias.

Arquivos suplementares: Os arquivos suplementares incluem dados de modelo 3D de cinco partes de Microdrive em ambos os formatos. SLDPRT e. STL. Os arquivos de modelo 3D originais foram criados com o software Solidworks2003. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O protocolo demonstra como construir e implantar uma matriz de Microdrive híbrida que permite a gravação de atividades neurais de duas áreas cerebrais usando tetrodes ajustável independente e uma sonda de silício em camundongos que se comportam livremente. Também demonstra experimentos optogenéticos e a recuperação da sonda de silício após experimentos. Quando a ponta de prova ajustável33 do silicone ou a sonda do opto-silicone36 a implantação for demonstrada previamente nos ratos, este protocolo tem vantagens desobstruídas na disposição simultânea do tetrode e na implantação da ponta de prova do opto-silicone para fornecer flexível escolha de tipos de sonda implantados. O tipo de sonda implantada pode ser alternado dependendo do objetivo do experimento, como sondas multipata27,44 ou neuropixels de Ultra densidade21,45. A coordenação e o ângulo de implantação7 podem ser facilmente modificados no estágio de design do objeto 3D, conforme necessário. Por exemplo, o dual-site ou mesmo a gravação do triplo-local é possível durante tarefas de aprendizagem através das estruturas memória-relacionadas do cérebro, tais como o hipocampo46, o córtice de entorrinal47, o córtice pré-frontal48, amígdala49, e cingulado Cortex50.

Há diversos procedimentos críticos para o implante e a gravação bem sucedidos. Devido à fragilidade de sondas à base de silício, quaisquer vibrações ou impactos mecânicos para a matriz de Microdrive devem ser minimizados durante a montagem. Por exemplo, abrir os furos obstruídos usando uma broca deve ser terminado antes de carregar a ponta de prova do silicone na disposição do Microdrive. Além disso, deve ser enfatizado para verificar cuidadosamente a ligação à terra em cada etapa durante a construção de matriz de Microdrive e implante de cirurgia para garantir a estabilidade dos dados gravados. As conexões instáveis ou de alta impedância ao solo causam ruídos pesados e artefatos relacionados ao movimento durante a sessão de gravação. Para gravações estáveis, recomenda-se esperar 1-2 semanas após a cirurgia para evitar a deriva do eletrodo porque o tecido cerebral é afetado negativamente pela cirurgia do implante. Entretanto, a qualidade do sinal na ponta de prova do silicone recupera após 1-2 semanas do traumatismo cirúrgico baseado na experiência precedente. Recomenda-se usar o único-alojamento para impedir dano ao array implantado do Microdrive por outros ratos. Para o experimento optogenético, é importante notar que a maioria das sondas de silício induzem foto-artefatos em resposta à luz-estimulações51, enquanto outros são projetados para minimizar a foto-artefatos52 (há foto-artefato reduzido silício-sondas que estão disponíveis comercialmente).

O peso da matriz Microdrive (5,9 g) é mais pesado do que os Microdrives típicos descritos nos artigos anteriores12,53, principalmente devido ao corpo da matriz Microdrive (~ 21% do peso total), cone de blindagem (~ 31%) e peças metálicas (parafusos e porcas: ~ 22%). Recomenda-se o uso de camundongos com pesos de mais de 25 g (~ 2-3 meses de idade para C57Bl/6 camundongos54,55) para cirurgia de implante, porque camundongos com pesos corporais adequados tendem a se recuperar mais cedo. Por esta razão, esta matriz de Microdrive pode não ser a melhor solução para ratos juvenis. Enquanto os dispositivos que são 5%-10% do peso corporal do mouse são muitas vezes guiados para ser tolerado para implantes12,56 (embora não haja dados publicados de apoio para este57), esta matriz Microdrive pesa ~ 24% do peso corporal de 25 g de camundongos (~ 19% ao usar o cone alternativo descrito abaixo).

No entanto, os ratos adultos implantados foram capazes de movimentar-se livremente e saltar em torno das gaiolas de casa. Camundongos implantados com um peso de matriz Microdrive semelhante (~ 4,5 g) têm sido mostrados anteriormente para realizar a tarefa comportamental (tarefa de labirinto linear) mesmo restrição alimentar13,14. A desvantagem do peso não é um problema durante a gravação, como um sistema de balanceamento de contrapeso18,34,58 ou sistema headpost59 irá suportar o array Microdrive. Além, o peso total da disposição do Microdrive pode ser reduzido abaixando a altura ou reduzindo a espessura do cone de protecção e modificando o projeto para utilizar os parafusos menores.

Usando o material de impressão 3D atual, a espessura do cone de blindagem pode ser reduzida até ~ 0,3 mm (a partir da espessura atual de ~ 0,6 mm). A altura do cone pode ser reduzida ~ 5 mm, desde que os fios tetrode ainda podem ser cobertos. A exposição dos fios tetrode resultará na ruptura dos fios e na falha da gravação a longo prazo. Alternativamente, a preparação do cone de blindagem usando fita de papel e alumínio pode reduzir o peso do cone para ~ 0,7 g (~ 15% do peso total; reduziu 20% do peso total da matriz de Microdrive original); embora, estes são um compensação com a força física. Além disso, o tamanho do Microdrive (cone de blindagem atual: 4,2 x 4,0 x 2,6 cm = eixo principal x eixo menor x altura) pode ser um obstáculo para o acesso a alimentos e água, se eles são fornecidos a partir do topo da gaiola animal. Contanto que sejam fornecidos no assoalho da gaiola ou do sidewall, o Microdrive não perturba comportamentos naturais dos ratos, tais como comer, beber, grooming, criação, ou aninhamento60.

Em conclusão, este protocolo do Microdrive fornece investigadores as escolhas flexíveis para a gravação das áreas múltiplas do cérebro em ratos livremente moventes para compreender a dinâmica e as funções de circuitos neural de longo alcance.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte pela sociedade do Japão para a promoção da ciência de bolsas de pesquisa no exterior (HO), programa de estudioso dotado (TK), programa de ciência da fronteira humana (TK), Brain Research Foundation (TK), faculdade de ciência e tecnologia de aquisição e Programa da retenção (TK), cérebro & Fundação da pesquisa do comportamento (TK), e pelo concessão da pesquisa da Fundação de Sumitomo (JY), concessão nova da pesquisa do investigador de NARSAD (JY). Agradecemos a W. Marks por comentários valiosos e sugestões durante a preparação do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#00-90 screw J.I. Morris #00-90-1/8 EIB screws
#0-80 nut Small Parts B00DGB7CT2 brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw Small Parts B000FMZ57G brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes Small Parts SLPT-22-24 for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing Small Parts HTX-23R for tetrode
23 Ga stainless wire Small Parts HTX-23R-24-10 for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire Small Parts GWX-0200 for guide-posts
30 Ga stainless wire Small Parts HTX-30R for tetrode
3-D CAD software package Dassault Systèmes SolidWorks 2003
3D printer FormLab Form2
5.5mil polyimide insulating tubes HPC Medical 72113900001-012
aluminum foil tape Tyco Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape for the alternative shielding cone
conductive paste YSHIELD HSF54 for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive AMT UNM1.25-HalfMoon half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive AMT Yamamoto_0000-160_9mm slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic Stoelting 51459
dental model resin FormLab RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool Dremel model 800 a grinder
drill bit Fine Science Tool 19007-05
electric interface board Neuralynx EIB-36-Narrow
epoxy Devcon GLU-735.90 5 minutes epoxy
eye ointment Dechra Puralube Ophthalmic Ointment to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet Thorlabs LFG5P for polishing the optical fiber
fine tweezers Protech International 15-368 for loading/recovering the silicon probe
gold pins Neuralynx EIB Pins Small
ground wire A-M Systems 781500 0.010 inch bare silver wire
headstage preamp Neuralynx HS-36
impedance meter BAK electronics Model IMP-2 1 kHz testing frequency
mineral oil ZONA 36-105 for lubricating screws and wires
optical fiber Doric MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system Neuralynx Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe Thorlabs S90R for cleaving the optical fiber
silicon grease Fine Science Tool 29051-45
silicon probe Neuronexus A1x32-Edge-5mm-20-177 Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe Neuronexus A1x32-6mm-50-177 Fig. 4C
silicon probe washing solution Alcon AL10078844 contact lens cleaner
silicone lubber Smooth-On Dragon Skin 10 FAST for preparation of microdrive mold
silver paint GC electronic 22-023 silver print II coating, used for ground wires
skull screw Otto Frei 2647-10AC 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors ROBOZ RS-5880
stereotaxic apparatus Kopf Model 942
super glue Loctite LOC230992 for applying to guide-posts
surgical tweezers ROBOZ RS-5135
Tetrode Twister Jun Yamamoto TT-01
tetrode wires Sandvik PX000004

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