Sistema microdrive híbrido con sonda de optosilicio recuperable y tetroda para grabación de alta densidad de doble sitio en ratones en movimiento libre

Neuroscience

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Summary

Este protocolo describe la construcción de una matriz híbrida de micromotores que permite la implantación de nueve tetrodios ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable en dos regiones cerebrales en ratones que se mueven libremente. También se ha demostrado un método para recuperar y reutilizar de forma segura la sonda de optosilicio para múltiples propósitos.

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Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (150), e60028, doi:10.3791/60028 (2019).

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Abstract

Las grabaciones neuronales multirregionales pueden proporcionar información crucial para comprender las interacciones de escala de tiempo fino entre varias regiones cerebrales. Sin embargo, los diseños de microunidades convencionales a menudo solo permiten el uso de un tipo de electrodo para grabar desde una o varias regiones, lo que limita el rendimiento de grabaciones de una sola unidad o perfil de profundidad. También a menudo limita la capacidad de combinar grabaciones de electrodos con herramientas optogenéticas para apuntar a la vía y / o actividad específica del tipo de célula. Aquí se presenta una matriz de microunidades híbridas para ratones en movimiento libre para optimizar el rendimiento y una descripción de su fabricación y reutilización de la matriz de microunidades. El diseño actual emplea nueve tetrodes y una sonda de optosilicio implantada en dos áreas cerebrales diferentes simultáneamente en ratones que se mueven libremente. Los tetrodes y la sonda de optosilicio son ajustables independientemente a lo largo del eje dorsoventral en el cerebro para maximizar el rendimiento de las actividades unitarias y oscilatorias. Esta matriz de micromotores también incorpora una configuración para la manipulación optogenética ligera y mediadora para investigar las respuestas y funciones específicas del tipo regional o celular de los circuitos neuronales de largo alcance. Además, la sonda de optosilicio se puede recuperar y reutilizar de forma segura después de cada experimento. Debido a que la matriz de microunidades consta de piezas impresas en 3D, el diseño de microunidades se puede modificar fácilmente para adaptarse a varios ajustes. Se describe por primera vez el diseño de la matriz de micromotores y cómo conectar la fibra óptica a una sonda de silicio para experimentos de optogenética, seguido de la fabricación del paquete de tetrodes y la implantación de la matriz en un cerebro de ratón. El registro de los potenciales de campo locales y el pico de unidad combinado con la estimulación optogenética también demuestran la viabilidad del sistema de matriz de micromotores en ratones que se mueven libremente.

Introduction

Es crucial entender cómo la actividad neuronal apoya el proceso cognitivo, como el aprendizaje y la memoria, investigando cómo diferentes regiones cerebrales interactúan dinámicamente entre sí. Para esclarecer la dinámica de la actividad neuronal subyacente a las tareas cognitivas, se ha llevado a cabo electrofisiología extracelular a gran escala en animales en movimiento libre con la ayuda de matrices de micromotores1,2,3, 4. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios tipos de matriz demicromotores para implantar electrodos en múltiples regiones cerebrales para ratas 5,6,7,8 y ratones9, 10 , 11 , 12. Sin embargo, los diseños actuales de microunidades generalmente no permiten el uso de múltiples tipos de sonda, lo que obliga a los investigadores a elegir un solo tipo de electrodo con beneficios y limitaciones específicas. Por ejemplo, las matrices de tetrodes funcionan bien para regiones cerebrales densamente pobladas como el hipocampo dorsal CA11,13, mientras que las sondas de silicio dan un mejor perfil geométrico para el estudio de las conexiones anatómicas14 , 15.

Tetrodes y sondas de silicio se utilizan a menudo para la grabación crónica in vivo, y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Se ha demostrado que los tetrodes tienen ventajas significativas en un mejor aislamiento de una sola unidad que los electrodos individuales16,17,además de la rentabilidad y la rigidez mecánica. También proporcionan mayores rendimientos de las actividades deuna sola unidad cuando se combinan con micromotores 8,18,19,20. Es esencial aumentar el número de neuronas simultáneamente registradas para entender la función de los circuitos neuronales21. Por ejemplo, se necesita un gran número de celdas para investigar pequeñas poblaciones de tipos de células funcionalmente heterogéneos, como22 relacionados con el tiempo o recompensar la codificación23 celdas. Se requieren números de celda mucho más altos para mejorar la calidad de decodificación de las secuencias de picos13,24,25.

Los tetrodes, sin embargo, tienen una desventaja en el registro de células distribuidas espacialmente, como en la corteza o el tálamo. A diferencia de los tetrodes, las sondas de silicio pueden proporcionar distribución espacial e interacción de potenciales de campo locales (LFP) y actividades de espiga dentro de una estructura local14,26. Las sondas de silicio multivástago aumentan aún más el número de sitios de grabación y permiten la grabación en estructuras individuales o vecinas27. Sin embargo, tales matrices son menos flexibles en el posicionamiento de los sitios de electrodos en comparación con los tetrodios. Además, se requieren algoritmos complejos de clasificación de picos en sondas de alta densidad para extraer información sobre los potenciales de acción de los canales vecinos para reflejar los datos adquiridos por los teturos28,29,30. Por lo tanto, el rendimiento general de las unidades individuales es a menudo menor que los tetrodes. Además, las sondas de silicio son desventajosas debido a su fragilidad y alto costo. Por lo tanto, la elección de tetrodes frente a las sondas de silicio depende del objetivo de la grabación, que es una cuestión de si se prioriza la obtención de un alto rendimiento de unidades individuales o perfiles espaciales en los sitios de grabación.

Además de registrar la actividad neuronal, la manipulación optogenética se ha convertido en una de las herramientas más potentes en neurociencia para examinar cómo los tipos y/o vías celulares específicos contribuyen a las funciones del circuito neural13,31, 32,33. Sin embargo, los experimentos optogenéticos requieren una consideración adicional en el diseño de la matriz de micromotores para conectar el conector de fibra a las fuentes de luz de estimulación34,35,36. A menudo, la conexión de fibra óptica requiere una fuerza relativamente grande, lo que puede conducir a un cambio mecánico de la sonda en el cerebro. Por lo tanto, no es una tarea trivial combinar una fibra óptica implantable con matrices de micromotores convencionales.

Por las razones anteriores, los investigadores están obligados a optimizar la selección del tipo de electrodo o a implantar una fibra óptica dependiendo del objetivo de la grabación. Por ejemplo, los tetrodes se utilizan para lograr un mayor rendimiento unitario en el hipocampo1,13, mientras que las sondas de silicio se utilizan para investigar el perfil de profundidad laminar de áreas corticales, como la corteza entorrinal medial (MEC)37. Actualmente, se han notificado micromotores para la implantación simultáneade tetrodes y sondas de silicio para ratas 5,11. Sin embargo, es extremadamente difícil implantar múltiples tetrodios y sondas de silicio en ratones debido al peso de las microunidades, espacio limitado en la cabeza del ratón y requisitos espaciales para diseñar el micromotor para emplear diferentes sondas. Aunque es posible implantar sondas de silicio sin micromotor, este procedimiento no permite el ajuste de la sonda y reduce la tasa de éxito de la recuperación de sondas de silicio12,38. Además, los experimentos optogenéticos requieren consideraciones adicionales en el diseño de matrices de micromotores. Este protocolo demuestra cómo construir e implantar una matriz de micromotores para la grabación crónica en ratones en movimiento libre, lo que permite la implantación de nueve tetrodes ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable. Esta matriz de micromotores también facilita los experimentos optogenéticos y la recuperación de la sonda de silicio.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center.

1. Preparaciones de piezas de matriz de micromotores

  1. Imprima las piezas de la matriz de microunidades utilizando una impresora 3D utilizando resina de modelo dental (Figura1A, B). Asegúrese de que el grosor de las capas impresas 3D individuales sea inferior a 50 m para mantener los pequeños agujeros en las piezas impresas claras y viables.
    NOTA: La matriz de micromotores consta de cinco partes (Figura1C):(1) el cuerpo principal de la matriz de micromotores, que incluye nueve tornillos de micromotor para tetrodes y un tornillo para una sonda de silicio (Figura1Ca-d). La coordinación del haz de tetrodes y el agujero de la sonda de optosilicio en la parte inferior depende de las coordenadas del área del cerebro objetivo (Figura1Cd); 2) un trans bordador para conectar una sonda de silicio o optrode (Figura1Ce); (3) un soporte de conexión eléctrica de sonda para sujetar el conector de sonda de silicio (Figura1Cf); (4) un soporte de férula de fibra que se sujeta a la parte central del cuerpo para evitar movimientos no deseados de la sonda de optosilicio implantada al conectar/desenchufar un conector de fibra óptica (Figura1Cg); y (5) un cono de blindaje que proporciona blindaje físico y eléctrico a la matriz de microunidades para una grabación estable (Figura1Ch). El peso total de la matriz de microunidades es de 5,9 g, incluido el cono de protección (Tabla 1). Si los agujeros están obstruidos en las piezas impresas, taladre los orificios con brocas: #76 para los orificios interiores y #68 para los orificios exteriores para tornillos de tetrode-microdrive, #71 para el orificio de apoyo del tornillo de micromotor de tetrodey y #77 para los orificios para los postes guía en la parte inferior de el cuerpo.
  2. Inserción de postes guía en el cuerpo de la matriz de microunidades.
    1. Corte dos longitudes de 16 mm de alambre de acero inoxidable de 26-Ga. Afilar suavemente las puntas de los cables con una amoladora rotativa.
    2. Inserte los cables en los orificios inferiores del cuerpo (Figura 2A). Aplique una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato en la parte inferior del cuerpo para asegurar los postes guía.

2. Preparación de la sonda de optosilicio

  1. Prepare el tornillo de micromotor para una sonda de silicio.
    NOTA: El tornillo de microrresistente para la sonda de silicio consiste en un tornillo personalizado (paso de 300 m), que soporta un tubo de soporte y un tubo en forma de L (Figura2B).
    1. Prepare el molde para el cabezal de micromotor (Figura2C). Para construir el molde, prepare el patrón de plástico impreso en 3D del micromotor (Figura2Ca). Luego, vierta el gel de silicona líquido después de hacer una pared temporal colocando cintas alrededor del patrón. Retire las burbujas de aire agitando suavemente, espere hasta que se cure y, a continuación, retire el molde de silicona-gel del patrón (Figura2Cb).
    2. Corte longitudes de 18 mm y 9,5 mm de alambre inoxidable de 23 G utilizando una amoladora rotativa. Rugoso la parte superior 2-3 mm de los cables con una amoladora rotativa para mejorar la adhesión del acrílico dental.
    3. Tome un tornillo personalizado y aplique una pequeña cantidad de aceite de silicio para reducir la fricción con el acrílico dental. Ajuste los cables y un tornillo personalizado al molde.
    4. Vierta el acrílico dental en el molde usando una jeringa para eliminar las burbujas de aire alrededor de los cables y los tornillos. La contaminación por burbujas de aire hará que el micromotor sea frágil. Espere hasta que el acrílico dental esté completamente curado y, a continuación, quite los tornillos de micromotor del molde. Doblar 6 mm de la punta de alambre más larga a un ángulo de 60o utilizando alicates.
    5. Compruebe la calidad de los tornillos de micromotor (por ejemplo, grietas, burbujas de aire y fricción) para girar el tornillo. Si hay alta fricción, gire el tornillo hasta que se vuelvan suaves usando un destornillador eléctrico con una punta de conductor personalizada, que se acopla con el tornillo de microunidad.
    6. Instale el tornillo de microunidad en el cuerpo de la matriz de microunidades para comprobar si se mueve hacia arriba y hacia abajo suavemente girando el tornillo. Las roscas para el tornillo se crean automáticamente al insertar el tornillo en el orificio del cuerpo.
  2. Prepare el trans bordador (Figura3Aa).
    1. Corte dos longitudes de 5 mm de tubo de polietheretherketone (PEEK) utilizando tijeras afiladas. Alinee los tubos a ambos lados de la lanzadera. Pegue los tubos y el trans bordador con epoxi.
    2. Aplique una pequeña cantidad de aceite de silicio en los postes guía. Compruebe la calidad del transbordador insertándolo en los postes guía del cuerpo de la matriz de micromotores. Asegúrese de que el trans bordador se mueve suavemente sin fricción excesiva.
  3. Preparar un optorode (Figura3Ab). Este paso se puede omitir si no se requiere un experimento optogenético.
    1. Corte la fibra óptica a 21 mm de longitud utilizando un cortador de rubí. Moler la punta de la fibra para hacer la punta plana y brillante.
    2. Coloque suavemente la fibra óptica en la parte frontal de la sonda de silicio. La punta de fibra se coloca 200–300 m por encima de la parte superior de los sitios de electrodos. Sostenga la fibra temporalmente con cinta transparente.
    3. Pegue la fibra óptica a la base de la sonda de silicio utilizando una pequeña cantidad de epoxi. Espere al menos 5 horas hasta que el epoxi esté completamente curado.
      NOTA: Se recomienda conectar la fibra óptica en el mismo lado que los sitios de electrodos. La fijación de la fibra en la parte posterior puede impedir que la luz ilumine correctamente los sitios de grabación.
  4. Conecte el trans bordador a la sonda de silicio (Figura3Ac):aplique una pequeña cantidad de epoxi en la parte posterior de la base de la sonda de silicio. Fije la parte inferior del trans bordador a la base de la sonda de silicio y mantenga suavemente en posición durante 2-3 minutos para evitar la formación de un espacio entre el volante y la base de la sonda de silicio durante la curación inicial del epoxi. Espere al menos 5 horas hasta que el epoxi esté completamente curado.
  5. Inserte cuidadosamente los tubos de transporte en los postes guía del cuerpo principal bajo el microscopio (Figura3B). Durante este procedimiento, sostenga la ranura de la lanzadera con pinzas finas.
  6. Inserte el tornillo micromotor en el orificio del tornillo girando el tornillo. Encienda la sonda de silicio y el tornillo micromotor insertando la punta del cable en forma de L en la ranura del cabezal de transporte (Figura3C).
  7. Conecte el soporte del conector eléctrico de la sonda al cuerpo de la matriz de microunidades (Figura3D).
    1. Corte dos tornillos #0 a una longitud de rosca de 3,5 mm. Moler las puntas para eliminar las rebabas.
    2. Coloque el soporte del conector de la sonda en el cuerpo. Coloque el conector eléctrico de la sonda de silicio en el soporte.
    3. Asegure el conector de la sonda de silicio en el soporte utilizando epoxi, y asegúrese de no pegarlo al cuerpo de la matriz de microunidades para permitir el procedimiento de recuperación de la sonda de silicio. Inserte los tornillos para sujetar el soporte del conector de la sonda.
  8. Conecte el soporte de férula a la sonda de optosilicio y al cuerpo de la matriz de microunidades (Figura3D).
    1. Corte dos tornillos #0 a una longitud de rosca de 6 mm. Moler las puntas para eliminar las rebabas.
    2. Moler el exterior de dos tuercas de tornillo de máquina #0 para hacer tuercas hexagonales pequeñas con 2,5-3,0 mm de diámetro exterior para reducir el peso y el espacio.
    3. Inserte los tornillos en el componente A del soporte. Pegue los cabezales de tornillo con epoxi.
    4. Aplique una pequeña cantidad de grasa de silicio a los componentes A y B para reducir la fricción con el cuerpo. Inserte el componente A en el cuerpo y, a continuación, mantenga temporalmente pulsado utilizando pinzas inversas.
    5. Coloque el componente B en los tornillos del componente A. Enrosque las tuercas personalizadas en los tornillos. Utilice alicates para apretar las tuercas para fijar el soporte de la férula en el cuerpo.
    6. Inserte la férula de fibra en la ranura del soporte de la férula de fibra (componente B). Asegúrese de que la férula de fibra se pegue de 4 a 5 mm del soporte.
    7. Aplique una pequeña cantidad de epoxi entre la férula y la ranura del soporte. Espere hasta que el epoxi esté completamente curado y compruebe que la férula no se mueva. Compruebe el volante y el soporte de la férula para un movimiento suave aflojando las tuercas antes de girar el tornillo micromotor.
    8. Compruebe la distancia de trabajo de la sonda. Asegúrese de que la punta de la sonda se retrae completamente en el cuerpo cuando el soporte de la férula está en la posición superior mientras los tubos del trans bordador todavía están asociados con los postes guía. La distancia máxima de trabajo está determinada por la longitud de la sonda de silicona y la región del cerebro objetivo.
    9. Si el tornillo micromotor está suelto, aplique una pequeña cantidad de acrílico dental alrededor del tornillo para agregar más hilos para el soporte. Cuando esté curado, gire el tornillo para comprobar la estanqueidad y la estabilidad.

3. Preparación de Tetrode

NOTA: Este procedimiento es similar al de los artículos publicados anteriormente8,19,20,39.

  1. Prepare los tornillos de micromotor para el tetrode. El micromotor para un tetrode consiste en un tornillo mecanizado a medida y un tubo de 23 G (Figura2B). Este procedimiento es similar a la sección 2.1.
  2. Haga un paquete de tubos de acero inoxidable de 30 G que tenga un alambre de 5,5 mil en el interior. En este caso, se utilizaron un total de nueve tubos de 30 G (ocho tetrodes de grabación y un electrodo de referencia).
  3. Enhebra el haz de 30 G desde la parte inferior del cuerpo de la unidad y asegurolos con tubos de pared delgada de 20 G al cuerpo principal. Recorte la parte inferior del paquete con una amoladora rotativa para hacer que la punta esté uniforme y al ras. Recorte la parte superior de los tubos de 30 G con una amoladora rotativa para que el tubo de 30 G sobresalga a unos 0,5 mm del cuerpo principal.
  4. Cargue tubos aislantes de poliimida de 5,5 mil en el tubo de 30 G. Prepare los cables de tetrode y cárguelos en una placa de interfaz eléctrica (EIB) de 32 canales. Compruebe la conexión eléctrica con el probador de impedancia antes del corte de precisión final.
  5. Disminuir la impedancia de la punta del electrodo a 250–350 ko con solución de chapado en oro. Arregla todos los tetrodes con superpegamento.
  6. Llenar el espacio excesivo entre el tubo de poliimida y el tetroda con aceite mineral para el sellado y la lubricación. Dirija el cable de tierra al BEI.
    NOTA: Si es necesario, la fibra óptica se puede integrar a lo largo de los cables de tetrode12.

4. Colocación del cono de protección

  1. Pintar pintura de protección conductora de plata en el interior del cono impreso. Coloque la matriz de microunidades dentro del cono (Figura3E).
  2. Corte dos tornillos #0 a una longitud de rosca de 3,5 mm. Fije los tornillos desde el exterior del cono para mantener la matriz de microunidades en su lugar.
  3. Aplique pintura plateada alrededor de la cabeza del tornillo para conectar eléctricamente el cono de protección con tierra eléctrica. Compruebe la conectividad eléctrica entre el cable de tierra y el cono. Aplique una pequeña cantidad de epoxi entre el cuerpo de la matriz de micromotores y el cono de protección para fijar el cuerpo de forma segura.
    NOTA: Otra forma de preparar el cono de protección es utilizar cinta de aluminio40 (Figura3F). En primer lugar, prepare el papel de patrón para el cono de protección después de pegar papel de aluminio al papel (Figura3Fa). A continuación, enrolle el papel y adjúntelo al cuerpo de la microunidad usando una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato (Figura3Fb). El peso de este cono es de 0,72 g y el peso total de la matriz de microunidades se reduce a 4,7 g (Tabla 1).

5. Cirugía de implantes

NOTA: Este procedimiento se modifica a partir de los artículos publicados anteriormente18,39,41 para la implantación de dos sitios. Asegúrese de que el peso del animal es superior a 25 g para el implante de micromotor para una recuperación más rápida después de la cirugía.

  1. Preparación
    1. Para preparar un tornillo de tierra, conecte el alambre de plata a un tornillo de cráneo y aplique pintura plateada. A continuación, coloque un pasador de oro en el lado opuesto del alambre usando pintura plateada.
    2. Prepare el adaptador de retención de unidades para sujetar la matriz de microunidades a un dispositivo estereotáctico. Fije un conector macho a un mango inoxidable usando epoxi. Asegúrese de que la alineación de la conexión y el mango inoxidable es recta.
    3. En el caso de que se necesite confirmación histológica después de la grabación, aplique Di-I a los tetrodes o la parte posterior de la sonda de silicio38.
    4. Baje la sonda de silicio hacia abajo para la profundidad deseada. Afloje las tuercas del soporte de férula con alicates, baje la sonda de silicio (sonda de optosilicio) girando el tornillo micromotor de la sonda de silicio y, a continuación, apriete las tuercas para asegurar el soporte de la férula. Al implantar tetrodes en el área del hipocampo CA1 y una sonda de silicio en MEC, la distancia entre la cánula de tetrode y la punta de la sonda de silicio es de 3-4 mm.
  2. Establezca el ratón anestesiado (0,8%–1,5% isoflurano) en un dispositivo estereotaxico. La condición anestésica del ratón se confirma por la ausencia del reflejo del dedo del pie. Aplique pomada transparente en los ojos para evitar el secado. Cubra los ojos con un pedazo de papel de aluminio para protegerlo de una fuerte exposición a la luz quirúrgica.
  3. Desinfectar el cuero cabelludo del ratón con yodo e isopropanol después de afeitar se afeita el pelaje. Hacer una incisión de 1.5–2.0 cm en el cuero cabelludo usando tijeras quirúrgicas estándar, y extraer el tejido sobre el cráneo usando hisopos de algodón después de aplicar por vía subcutánea lidocaína.
  4. Alinee el cabezal del ratón con la herramienta esterenotaxica. Asegúrese de que la diferencia de altura entre bregma y lambda sea inferior a 100 m. Determinar la ubicación de la craneotomía usando un atlas y marcar estos lugares con un lápiz esterilizado.
  5. Ancle los tornillos del cráneo (0,8 mm de diámetro, paso de rosca de 0,200 mm) girándolos 1,5 vueltas (0,3 mm) en el cráneo, utilizando pinzas quirúrgicas y un destornillador después de perforar 8-11 agujeros en el cráneo usando una broca de 0,5 mm.
    NOTA: Se sugieren 2-4 agujeros en el cráneo frontal, 2-3 agujeros en cada lado del cráneo parietal y 1–2 agujeros en el cráneo interparietal.
  6. Fije el tornillo de tierra al orificio girándolo una vuelta (0,2 mm) después de perforar un agujero en el hueso interparietal. Asegúrese de que este agujero no penetre a través del hueso en la caja del cerebro; de lo contrario, las señales cerebelosas contaminarán la grabación. Compruebe que la impedancia es inferior a 20 k a 1 kHz entre el tornillo de tierra y los tornillos del cráneo utilizando un medidor de impedancia.
    NOTA: Una mayor impedancia provocará la introducción de artefactos de movimiento durante la grabación.
  7. Realice la craneotomía en los lugares marcados. La dura se puede dejar intacta en ratones.
  8. Conecte el pasador macho del tornillo de tierra y el conector de tierra de la matriz de microunidades. Compruebe la conectividad utilizando el medidor de impedancia midiendo entre el tornillo de tierra y el blindaje.
  9. Ajuste la matriz de microunidades en el adaptador, establézcala en el dispositivo estereotaxico y baje lentamente la sonda de silicio hasta la profundidad deseada. Asegúrese de que los paquetes de tetrodes se colocan por encima de la superficie del cerebro, pero todavía dentro de la matriz de microunidades cuando la sonda de silicio se inserta en el cerebro (Figura4A).
  10. Aplique cuidadosamente la grasa de silicio para sellar el área de la sonda de silicio y el paquete de tetrodes (Figura4B). Coloque una pequeña cantidad de grasa de silicio en la punta de una aguja de 20 G y aplique la grasa alrededor de las sondas con la aguja. Repita hasta que la grasa de silicio cubra completamente el área alrededor de la sonda para que el acrílico dental no fluya sobre o debajo de los electrodos/sondas. Tenga cuidado de no dejar que la grasa toque los sitios de electrodos, de lo contrario aumentará drásticamente la impedancia de los sitios de grabación.
  11. Aplique acrílico dental para fijar la matriz de microunidades a los tornillos de anclaje en el cráneo.
    NOTA: Se recomienda aplicar acrílico dental en tres capas para evitar el calor excesivo producido durante el curado del acrílico.
  12. Retire el adaptador de la matriz de microunidades con cuidado. Inyecte 1 ml de PBS por vía subcutánea para prevenir la deshidratación. Inyectar 5 mg/kg de meloxicam por vía subcutánea como tratamiento analgésico.
  13. Cubra el conector de la sonda de silicio con un trozo de cinta para evitar que la suciedad entre en las conexiones eléctricas. Cubra la matriz de micromotores con una película de parafina de plástico y fíjela en su lugar.
  14. Administrar el tratamiento analgésico adecuado durante 3 días (p. ej., inyecciones subcutáneas de 2 mg/kg de meloxicam una vez al día). Espere de 3 a 5 días para la recuperación antes de iniciar el ajuste de tetrode. El ratón implantado después del período de recuperación se muestra en la Figura 4C.

6. Recuperación de la sonda de silicio (Figura 4D)

  1. Inyectar anestésicos de ketamina (75 mg/kg) y dexmedetomidina (1 mg/kg) por vía intraperitoneal y confirma la ausencia del reflejo del dedo del pie. Arreglar el ratón anestesiado perfundiendo directamente 4% paraformaldehído a través del corazón usando una capucha. Los métodos quirúrgicos para roedores se describen anteriormente42.
  2. Afloje las tuercas del soporte de la férula con un alicate. A continuación, muévalo cuidadosamente a la parte superior del cuerpo girando el tornillo de ajuste para retraer completamente la sonda de silicio hacia el interior del cuerpo de la matriz de microunidades. Fije las tuercas para sostener la sonda en la posición superior.
  3. Saca el cerebro del ratón de la parte inferior rompiendo el cráneo desde el costado. La matriz de micromotores ahora está separada del animal.
  4. Retire completamente el tornillo micromotor en forma de L que impulsa la sonda de silicio. Afloje y saque las tuercas del soporte de la férula con alicates. Saque el componente A del soporte de la férula.
  5. Desenrosque el soporte del conector de la sonda y desenchufe del cuerpo de la unidad. Compruebe que el soporte del conector de la sonda puede desprenderse del cuerpo de la matriz de microunidades.
  6. Sostenga la parte superior de la lanzadera con pinzas y, a continuación, deslice cuidadosamente el conjunto de sondas de silicio fuera de la matriz de micromotores.
  7. Limpie la punta de la sonda con un limpiador de lentes de contacto (primero con enzima, luego un 3% de peróxido de hidrógeno) durante al menos 1 día. Limpie cuidadosamente la punta del electrodo con almohadillas de isopropanol bajo el microscopio. Mantenga la sonda en una caja de almacenamiento sin estática.
    NOTA: El soporte del conector de la lanzadera y de la sonda permanecen conectados a la sonda de silicio y se pueden reutilizar en la siguiente implantación.
    NOTA: Algunas sondas de silicio no son tolerables con peróxido de hidrógeno. En este caso, utilice la solución de lentes de contacto que contenga únicamente enzima proteolítica.
  8. Para reutilizar el cuerpo de la matriz de micromotores para la siguiente cirugía, retire el acrílico dental con una combinación de taladros de punta fina y pinfados. Luego, recupera los tornillos del cráneo sumergiendo el acrílico dental eliminado en acetona. Tenga en cuenta que la acetona disolverá las partes de plástico de la matriz de micromotores.
  9. Retire el epoxi entre el cuerpo del micromotor y el cono de protección usando un bisturí.
    NOTA: No es necesario volver a imprimir piezas adicionales para la siguiente cirugía si el micromotor no está roto.

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Representative Results

La matriz de micromotores fue construida en 5 días. La cronología de la preparación de micromotores se describe en la Tabla2. Usando este micromotor, se implantaron nueve tetrodes y una sonda de silicio en el hipocampo CA1 y MEC del ratón [21 semanas de edad/29 g de peso corporal macho pOxr1-Cre (fondo C57BL/6)], respectivamente. Este ratón transgénico expresa Cre en las neuronas piramidales de capa III meC. El ratón se inyectó con 200 nL de AAV5-DIO-ChR2-YFP (titer: 7.7 x 1012 gc/mL) en el MEC 10 semanas antes del implante de electrodo. Los PFP se registraron utilizando un filtro de paso bajo (1-500 Hz), y las unidades de espiga se detectaron utilizando un filtro de paso alto (0,8-5 kHz). La estimulación de la luz (450 nm) se realizó utilizando un ancho de pulso de 1 ms a una intensidad de 10,6 mW medida al final del conector de fibra. El electrodo de referencia para la grabación de tetrodes se colocó en la materia blanca utilizando un cable de tetrode dedicado. La referencia para la grabación de la sonda de silicio se estableció como el canal superior de la sonda.

Después del ajuste del tetrode, el rendimiento del comportamiento se probó en una pista lineal (Figura5A)y en un campo abierto (Figura5B). En ambos experimentos, el ratón exploró libremente durante 30 minutos (Figura5Aa,b,c; Figura 5Ba,b,c). Las señales electrofisiológicas se registraron con éxito sin ruido severo relacionado con el movimiento durante toda la sesión de grabación (Figura5Ad,e; Figura 5 Bd,e). A continuación, se realizó estimulación de la luz en el MEC para estimular las neuronas de capa III meC que se proyectan al CA143 (Figura6A). Las actividades espontáneas de pico (Figura6B,C)y LFP (Figura6D)se registraron desde los tetrodes y la sonda de silicio cuando el ratón estaba durmiendo. Los LPP registrados en los tetrodes mostraron grandes actividades de ondulación, lo que sugiere que todos los tetrodes se colocaron en las proximidades de la capa de células piramidales CA1. Las actividades de respuesta inducidas por la luz se observaron por primera vez en MEC, seguidas de ca1 con latencia de 13-18 ms (Figura6E).

Figure 1
Figura 1: Visión general de la matriz de Microdrive. (A) Una vista de esqueleto de la matriz de microunidades, desde el lado del tetrodo (a) y el lado de la sonda de silicio (b). (B) Una imagen real de la matriz de microunidades cargada, vista desde el lado del tetrodo (a) y desde el lado de la sonda de silicio (b). La matriz de microunidades se coloca en la etapa de la plantilla en el panel (b). (C) Piezas individuales de la matriz de microunidades impresas en 3D. (a-d) El cuerpo de la matriz de microunidades, visto desde cuatro ángulos diferentes (a: vista lateral de tetrodes; b: vista lateral de sondas de silicio; c: vista superior; d: vista inferior). En la Figura 2Ase muestra una vista ampliada de la línea discontinua en el panel (c). (e) El transbordador, que sostiene y permite el ajuste de la sonda de silicio. Se une una sonda de silicio en la línea discontinua del panel (e). (f) El soporte del conector de la sonda, que sostiene un conector de sonda de silicio de 32 canales. (g) El soporte de la férula de fibra, que sostiene una férula de fibra óptica para evitar el movimiento de la sonda al conectar/desenchufar el conector de fibra con la fuente de luz. Esta parte consta de dos componentes: [panel (g) y componentes A y B]. (h) El cono de protección impreso, que proporciona blindaje físico y eléctrico cuando se pinta con material conductor. La ventana del cono permite la capacidad de ver el interior de la estructura durante la preparación de la matriz de microunidades, que finalmente está cubierto por un pedazo de cinta o material impreso en 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación de postes guía y tornillos de micromotor en el cuerpo principal. (A) Guía posterior a la preparación. (a) Vista ampliada del cuerpo de la matriz de microunidades que se muestra en la Figura 1Cc. (b) Guía posterior a la inserción en los orificios del cuerpo. (B) Los diseños de tornillo micromotor. (a) El tornillo micromotor para una sonda de silicio, que consiste en un tornillo personalizado de paso de 300 m, tubo de soporte y tubo en forma de L. (b) El tornillo micromotor para un tetroda, que consiste en un tornillo personalizado de paso de 160 m y un tubo guía inoxidable de 30 G. (C) Fabricación de la pieza superior de los tornillos micromotor: a Preparación de patrones impresos en 3D del antimolde para el tornillo micromotor. La imagen muestra un patrón para el microtornillo de silicio-sonda. (b) El molde hecho con el patrón antimolde (a) y el material de caucho de silicio. Los tornillos de micromotor montados se producen insertando tornillos personalizados y cables/tubo, y vertiendo acrílico dental en cada pocal. Inset: vista ampliada de los pozos del molde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ensamblaje de matriz de microdrive. (A) Preparación de una sonda de optosilicio. (a) Colocación de dos tubos guía de plástico en el trans bordador. (b) Pegar la fibra óptica a la sonda de silicio. (c) Fijación del trans bordador a la sonda de optosilicio. En esta imagen, la parte inferior del transbordador (línea discontinua) se une a la base de la sonda de silicio [lado posterior de (b)]. El trans bordador y el vástago de la sonda de silicio deben estar en paralelo. (B) Carga del conjunto de transbordadores de la sonda de optosilicio en los postes guía del cuerpo de la matriz de microunidades. (C) Posición relativa del micromotor de la sonda de silicio cuando la sonda está completamente retraída en el cuerpo (a) y cuando se coloca en la parte más baja del cuerpo de la unidad (b). El cable en forma de L se inserta en la ranura de la lanzadera. (D) Una vista explosionada del soporte de la férula de fibra y del soporte del conector de la sonda. (E) Cono de protección acoplado. El material conductor está pintado dentro del cono. (F) Cono de blindaje alternativo con papel y cinta de aluminio. (a) Un papel patrón. (b) Un cono de blindaje alternativo adjunto, que reduce 1,1 g de peso en comparación con la versión impresa en 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Sellado de las sondas durante la cirugía y recuperación de la sonda de silicio. (A) La matriz de micromotores y el cráneo del ratón después de la craneotomía, antes de aplicar la grasa de silicio. La sonda de silicio se inserta alrededor de 2 mm en el cerebro en este momento. (B) Aplicación de grasa de silicio alrededor de los paquetes de sondas de silicio y tetrodes para proteger las sondas del acrílico dental. (C) El ratón implantado crónicamente después del período de recuperación, cuando el ratón está caminando (a), el aseo (b) y cuando se conecta al cable de grabación con el sistema de polea contra-equilibrio (c). (D) La sonda de silicio recuperada, antes de (a) y después de (b) la inmersión en la solución de limpieza. Los tejidos biológicos de (a) se extraen después del proceso de limpieza (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ejemplos de grabación simultánea de tetrode/sondas de silicio en el hipocampo CA1 y corteza entorínal medial (MEC) del ratón que se comporta. (A) Grabación en la pista lineal. (a) La pista lineal utilizada para la recodificación. (b) Trayectorias de la exploración del ratón durante 30 minutos en la pista. (c) Rendimiento conductual en la pista lineal. (d-e) Grabaciones Representativas de LFP del tetrodo (d) y la sonda de silicio (e). (B) Grabación en campo abierto. (a) La cámara de campo abierta utilizada para la recodificación. (b) Trayectorias de la exploración del ratón durante 30 min en la cámara. (c) Rendimiento conductual en campo abierto. (d,e) Grabaciones Representativas de LFP del tetrodo (d) y la sonda de silicio (e). El LED está conectado al amplificador de cabeza para registrar las posiciones del ratón. La vía lineal y la cámara de campo abierto están conectadas con el suelo eléctrico para reducir el ruido electrostático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados representativos de las grabaciones simultáneas en el CA1 y el MEC y la estimulación optogenética. (A) Expresión de AAV5-DIO-ChR2-YFP después de 4 semanas de inyección. MEC capa III neuronas piramidales que proyectan sus axónes desde MEC dorsal a CA1 dorsal. Líneas discontinuas: ori, oriens de estrato; palanca, estrato piramidal; rad, estrato radiatum; mol, lacunosum moleculare del estrato. (B) Grabación representativa de picos de uno de los tetódes. (a) Proyecciones de racimo 2D de picos registrados desde el tetrodo. (b) Ejemplos de la forma de onda de pico promedio de tres clústeres, que se indican mediante líneas discontinuas en (a). (C) Registro representativo de picos desde uno de los sitios de electrodos de sondas de silicio. (a) Proyecciones de clúster 2D de componentes principales de pico. (b) Ejemplos de la forma de onda de pico promedio de tres clústeres. Los clústeres de espigas (rosa y verde) se separan de los clústeres de ruido (azul). Los clústeres de (B,C) se calculan utilizando el software KlustaKwik. (D) Rastros de PFP espontáneos registrados simultáneamente desde los tetrodes en CA1 (a) y la sonda de silicio en MEC (b). Las flechas negras indican el tetrode que se muestra en (B) y el sitio de electrodos de sondas de silicio que se muestran en (C). (E) Respuestas LFP a la estimulación óptica pulsada (10,6 mW, 1 ms; punta de flecha roja llena) de los tetrodios en CA1 (a) y la sonda de silicio en MEC (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

gramos/uno Número suma [gramo]
cuerpo principal 1.25 1 1.25
Transporte 0.04 1 0.04
Montaje del conector de la sonda 0.19 1 0.19
soporte de férula de fibra 0.1 1 0.1
cono de protección 1.82 1 1.82 (0.72)*
pasta conductora 0.2 1 0.2
tornillo de la máquina (#00, 2 mm), para sujetar el BEI 0.05 2 0.1
Tornillo de la máquina (#0-80, 3,5 mm) 0.06 4 0.24
Tornillo de la máquina (#0-80, 6 mm) 0.09 2 0.18
Nuez 0.03 2 0.06
micromotor (tetrode) 0.05 9 0.45
micromotor (sonda de silicio) 0.29 1 0.29
sonda de silicio 0.28 1 0.28
placa de interfaz eléctrica 0.6 1 0.6
Total 5.8 (4.7)*

Tabla 1: Peso individual de cada parte de la matriz de microunidades. El peso total de la matriz de micromotores fue de 5,9 g después de fijar el cono protector con epoxi (*en el caso de utilizar un cono de protección alternativo utilizando un papel y cinta de aluminio).

Procedimientos hora
preparación de micromotores
Impresión de piezas 3D 1 día
preparación optrode
Prepare el molde para el cabezal de micromotor 1 día*
Preparación de la cabeza de Microdrive 3 h
Colocación de una fibra óptica 3 h
Adjuntar un trans bordador 3 h
preparación de tetrodes
Prepare el molde para el cabezal de micromotor 1 día*
Preparación de cabezales Microdrive 3 h
Carga de cables tetrode 1 día
Fijación del cono de protección
Pintura de pintura de escudo durante la noche*
Fijación al cuerpo del micromotor 3 h
* Este procedimiento se puede llevar a cabo en paralelo

Tabla 2: La cronología de la preparación de micromotores. La impresión de piezas 3D, a la espera de curar el caucho de silicona / acrílico dental / epoxi, y la carga de los cables de tetrode toma la mayor parte del tiempo de la preparación de la matriz de microunidades, en total 4-5 días.

Archivos Suplementarios: Los archivos complementarios incluyen datos de modelo 3D de cinco partes de microunidad es en formato .sldprt y .stl. Los archivos de modelo 3D originales se crearon con el software Solidworks2003. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El protocolo demuestra cómo construir e implantar una matriz híbrida de micromotores que permite el registro de actividades neuronales desde dos áreas cerebrales utilizando tetrodes ajustables independientes y una sonda de silicio en ratones que se comportan libremente. También demuestra experimentos optogenéticos y la recuperación de la sonda de silicio después de los experimentos. Mientras que la sonda de silicio ajustable33 o la implantación de la sonda de optosilicio36 se han demostrado previamente en ratones, este protocolo tiene claras ventajas en la matriz de tetrode simultánea y la implantación de la sonda de optosilicio para proporcionar elección de los tipos de sondas implantadas. El tipo de sonda implantada se puede cambiar dependiendo del objetivo del experimento, como las sondas multivástago27,44 o Neuropíxeles 21 de ultradensidad 21,45. La coordinación y el ángulo de implantación7 se pueden modificar fácilmente en la etapa de diseño de objetos 3D según sea necesario. Por ejemplo, la grabación de doble sitio o incluso triple sitio es posible durante las tareas de aprendizaje en estructuras cerebrales relacionadas con la memoria, como el hipocampo46,la corteza entorhinal47,la corteza prefrontal48,la amígdala49, y cingular corteza50.

Existen varios procedimientos críticos para el éxito del implante y la grabación. Debido a la fragilidad de las sondas a base de silicio, cualquier vibración mecánica o impacto en la matriz de microunidades debe minimizarse durante el montaje. Por ejemplo, la apertura de los agujeros obstruidos con un taladro debe terminarse antes de cargar la sonda de silicio en la matriz de microunidades. Además, se debe enfatizar para comprobar cuidadosamente la conexión a tierra en cada paso durante la construcción de la matriz de microunidades y la cirugía de implantes para garantizar la estabilidad de los datos registrados. Las conexiones inestables o de alta impedancia al suelo causan ruidos pesados y artefactos relacionados con el movimiento durante la sesión de grabación. Para grabaciones estables, se recomienda esperar 1-2 semanas después de la cirugía para evitar la deriva del electrodo porque el tejido cerebral se ve afectado negativamente por la cirugía de implante. Sin embargo, la calidad de la señal en la sonda de silicio se recupera después de 1-2 semanas del trauma quirúrgico basado en la experiencia previa. Se recomienda utilizar una sola carcasa para evitar daños en la matriz de micromotores implantados por otros ratones. Para el experimento optogenético, es importante tener en cuenta que la mayoría de las sondas de silicio inducen fotoartefactos en respuesta a las estimulaciones deluz 51,mientras que otros están diseñados para minimizar los fotoartefactos52 (hay fotoartefactos reducidos sondas de silicio que están disponibles comercialmente).

El peso de la matriz de micromotores (5,9 g) es más pesado que los micromotores típicos descritos en los artículos anteriores12,53, principalmente debido al cuerpo de la matriz de microunidades (21% del peso total), cono de protección (31%) y piezas metálicas (tornillos y nueces: 22%). Se recomienda utilizar ratones con pesos de más de 25 g (2-3 meses de edad para ratones C57BL/654,55)para la cirugía de implantes, ya que los ratones con pesocorporal adecuado tienden a recuperarse antes. Por esta razón, esta matriz de micromotores puede no ser la mejor solución para ratones juveniles. Mientras que los dispositivos que son 5%-10% del peso corporal del ratón a menudo se guían para ser tolerados para los implantes12,56 (aunque no hay datos publicados de apoyo para este57), esta matriz de microunidades pesa el 24% del peso corporal de 25 g de ratones (19% cuando se utiliza el cono alternativo que se describe a continuación).

Sin embargo, los ratones adultos implantados fueron capaces de moverse libremente y saltar en las jaulas de casa. Los ratones implantados con un peso de matriz de microunidades similar (4,5 g) se han demostrado previamente para realizar la tarea de comportamiento (tarea de laberinto lineal) incluso bajo restricción de alimentos13,17. La desventaja del peso no es un problema durante la grabación, ya que un sistema de contrapeso18,34,58 o sistema de poste de cabeza59 soportará la matriz de microunidades. Además, el peso total de la matriz de microunidades se puede reducir reduciendo la altura o reduciendo el grosor del cono de blindaje y modificando el diseño para utilizar tornillos más pequeños.

Usando el material de impresión 3D actual, el espesor del cono de protección se puede reducir hasta 0,3 mm (a partir del espesor actual de 0,6 mm). La altura del cono se puede reducir 5 mm, siempre y cuando los cables de tetrode todavía se puedan cubrir. La exposición de los cables de tetrode dará lugar a la rotura de los cables y el fallo de la grabación a largo plazo. Alternativamente, la preparación del cono de protección con papel y cinta de aluminio puede reducir el peso del cono a 0,7 g (15% del peso total; reducido un 20% del peso total de la matriz de micromotores original); aunque, estos son un equilibrio con la fuerza física. Además, el tamaño del micromotor (cono de protección de corriente: 4,2 x 4,0 x 2,6 cm á eje mayor x eje menor x altura) puede ser un obstáculo para el acceso a alimentos y agua si se proporcionan desde la parte superior de la jaula del animal. Siempre y cuando se proporcionen en el suelo de la jaula o desde la pared lateral, el micromotor no perturba los comportamientos naturales de los ratones, como comer, beber, acicalar, criar o anidar60.

En conclusión, este protocolo de microimpulsión proporciona a los investigadores opciones flexibles para grabar desde múltiples áreas cerebrales en ratones que se mueven libremente para comprender la dinámica y las funciones de los circuitos neuronales de largo alcance.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de las Becas de Investigación en el Extranjero de la Ciencia (HO), el Programa de Académicos Dotados (TK), el Programa de Ciencia de la Frontera Humana (TK), la Fundación para la Investigación Cerebral (TK), la Adquisición de Ciencia sindicación y tecnología y Programa de Retención (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), y por The Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Investigator Research Grant (JY). Agradecemos a W. Marks por valiosos comentarios y sugerencias durante la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#00-90 screw J.I. Morris #00-90-1/8 EIB screws
#0-80 nut Small Parts B00DGB7CT2 brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw Small Parts B000FMZ57G brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes Small Parts SLPT-22-24 for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing Small Parts HTX-23R for tetrode
23 Ga stainless wire Small Parts HTX-23R-24-10 for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire Small Parts GWX-0200 for guide-posts
30 Ga stainless wire Small Parts HTX-30R for tetrode
3-D CAD software package Dassault Systèmes SolidWorks 2003
3D printer FormLab Form2
5.5mil polyimide insulating tubes HPC Medical 72113900001-012
aluminum foil tape Tyco Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape for the alternative shielding cone
conductive paste YSHIELD HSF54 for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive AMT UNM1.25-HalfMoon half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive AMT Yamamoto_0000-160_9mm slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic Stoelting 51459
dental model resin FormLab RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool Dremel model 800 a grinder
drill bit Fine Science Tool 19007-05
electric interface board Neuralynx EIB-36-Narrow
epoxy Devcon GLU-735.90 5 minutes epoxy
eye ointment Dechra Puralube Ophthalmic Ointment to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet Thorlabs LFG5P for polishing the optical fiber
fine tweezers Protech International 15-368 for loading/recovering the silicon probe
gold pins Neuralynx EIB Pins Small
ground wire A-M Systems 781500 0.010 inch bare silver wire
headstage preamp Neuralynx HS-36
impedance meter BAK electronics Model IMP-2 1 kHz testing frequency
mineral oil ZONA 36-105 for lubricating screws and wires
optical fiber Doric MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system Neuralynx Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe Thorlabs S90R for cleaving the optical fiber
silicon grease Fine Science Tool 29051-45
silicon probe Neuronexus A1x32-Edge-5mm-20-177 Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe Neuronexus A1x32-6mm-50-177 Fig. 4C
silicon probe washing solution Alcon AL10078844 contact lens cleaner
silicone lubber Smooth-On Dragon Skin 10 FAST for preparation of microdrive mold
silver paint GC electronic 22-023 silver print II coating, used for ground wires
skull screw Otto Frei 2647-10AC 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors ROBOZ RS-5880
stereotaxic apparatus Kopf Model 942
super glue Loctite LOC230992 for applying to guide-posts
surgical tweezers ROBOZ RS-5135
Tetrode Twister Jun Yamamoto TT-01
tetrode wires Sandvik PX000004

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