금속 결합 올리고펩타이드의 금속 이온 인식 및 Redox 활성의 구조 및 메커니즘을 결정하기 위한 이온 이동성 질량 분광법 기술

Chemistry

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Summary

이온 이동성 질량 분광법 및 분자 모델링 기술은 설계된 금속 결합 펩타이드 및 구리 결합 펩티드 메탄오박틴의 선택적 금속 킬레이트화 성능을 특성화할 수 있다. 금속 킬레이트 펩티드의 새로운 클래스를 개발하는 것은 금속 이온 과다 균형과 관련된 질병에 대한 치료제로 이어질 도움이 될 것입니다.

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Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

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Abstract

전기 분무 이온화 (ESI)는 질량, 전체 전하, 금속 결합 상호 작용 및 형태 모양을 보존하면서 수성 상 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 가스 상으로 전달할 수 있습니다. ESI와 이온 이동성 질량 분석법(IM-MS)을 결합하면 화학조량계, 프로토네이션 상태와 관련된 펩타이드의 질량 대 충전(m/z) 및 충돌 단면(CCS)을 동시에 측정할 수 있는 기법 기술을 제공합니다. 및 형태 모양. 펩티드 복합체의 전체 전하는 1) 펩티드의 산성 및 기본 부위및 2) 금속 이온의 산화 상태의 프로토네이션에 의해 조절된다. 따라서, 복합체의 전체 전하 상태는 펩티드 금속 이온 결합 친화도에 영향을 미치는 용액의 pH의 함수이다. ESI-IM-MS 분석의 경우, 펩타이드 및 금속 이온 용액은 수성 전용 솔루션에서 제조되며, pH는 희석 된 수성 아세트산 또는 수산화 암모늄으로 조정됩니다. 이는 pH 의존성 및 금속 이온 선택성을 특정 펩티드에 대해 결정하도록 허용한다. 또한 펩타이드 복합체의 m/z 및 CCS는 B3LYP/LanL2DZ 분자 모델링과 함께 사용하여 복합체의 금속 이온 조정 및 삼차 구조의 결합 부위를 식별할 수 있습니다. 결과는 ESI-IM-MS가 대체 메탄백틴 펩타이드 세트의 선택적 킬레이트화 성능을 특성화하고 이를 구리 결합 펩티드 메탄노박틴과 비교할 수 있는 방법을 보여준다.

Introduction

구리 와 아연 이온은 살아있는 유기체에 필수적이며 산화 보호, 조직 성장, 호흡, 콜레스테롤, 포도당 대사 및 게놈 판독을 포함한 과정에 매우 중요합니다1. 이러한 기능을 활성화하기 위해, Cys의 티오레이트, 그의2,3의imidazole , (더 드물게) 메티오닌의 티오에테르, 글루와 Asp의 카르복실레이트와 같은 그룹은 금속을 활성 부위에 보조 인자로 선택적으로 통합합니다. 금속 효소. 이러한 조정 그룹의 유사성은 그와 Cys 리간드가 올바른 기능을 보장하기 위해 Cu (I / II) 또는 Zn (II)을 선택적으로 통합하는 방법에 관한 흥미로운 질문을 제기합니다.

선택적 결합은 종종 Zn (II) 또는 Cu (I / II) 이온 농도를 제어하는 펩티드를 획득하고 인신 매매하여 수행됩니다4. Cu (I/II)는 반응성이 높고 효소에 산화 손상 또는 모험적 결합을 일으키므로 자유 농도는 구리 보호막과 구리 조절 단백질에 의해 단단히 조절되어 세포의 다양한 위치로 안전하게 운반하고 단단히 운반합니다. 그것의 항상성제어 5,6. 구리 대사 또는 항상성의 중단은 Menkes 및 Wilson의 질병7뿐만 아니라 암7 및 신경 질환, 예컨대 프리온8 및 알츠하이머 병9에직접적으로 연루된다.

윌슨의 질병은 눈의 증가 구리 수준과 관련, 간 및 뇌의 섹션, Cu의 레독스 반응 (I/II) 반응성 산소 종을 생산, 간 장 성 및 신경 변성을 일으키는. 기존 킬레이트 요법은 작은 티올 아미노산 페니실라민과 트리에틸네테트라민입니다. 대안적으로, 메탄영양구리-펩타이드(mb)10,11은 Cu(I)에 대한 그들의 높은 결합 친화도 때문에 치료적 잠재력을나타낸다.12. 메틸로시누스 트리코스포륨 OB3b로부터의 메탄백박틴(mb-OB3b)이 윌슨병의 동물 모델에서 연구되었을 때, 구리는 간에서 효율적으로 제거되고 담즙13을통해 배설되었다. 시험관내 실험에서 mb-OB3b는 간시토졸(13)에함유된 구리 메탈로티오닌으로부터 구리를 킬레이트할 수 있음을 확인하였다. 레이저 절제 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 이미징 기술은 윌슨 병 간 샘플14,15,16에서 구리의 공간 분포를 조사하고 MB-OB3b를 나타내고 있다. 단 8 일17의짧은 처리 기간으로 구리를 제거합니다.

mb-OB3b는 또한 Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) 및 Zn(II)18,19를포함하는 다른 금속 이온과 결합한다. 생리학적 Cu(I) 결합 부위에 대한 경쟁은 Mb-OB3b 복합체로부터 Cu(I)를 대체할 수 있기 때문에 Ag(I)에 의해 전시되며, Ag(I) 및 Ni(II)는 또한 Cu(I)19에의해 변위될 수 없는 MB에 돌이킬 수 없는 결합을 나타낸다. 최근, 2His-2Cys 결합 모티프를 가진 일련의 대체 메탄백액틴(amb) 올리고펩티드가20,21,및 그들의 Zn(II) 및 Cu(I/II) 결합 특성을 특징으로 하는 것으로 연구되었다. 그들의 1 차적인 아미노산 서열은 유사하고, 그들은 모두 2His-2Cys 모티프, 프로 및 아세틸화 된 N-종단을 함유하고 있습니다. 그들은 주로 2His-2Cys 모티프가 mb-OB3b의 두 enethiol 옥사졸론 결합 부위를 대체하기 때문에 mb-OB3b와 주로 다릅니다.

이온 이동성 질량 분석법(ESI-IM-MS)과 결합된 전기 분무 이온화는 질량 대충전(m/z)및 충돌을 측정하기 때문에 펩타이드의 금속 결합 특성을 결정하는 강력한 기법을 제공합니다. 용액 상에서 질량, 전하 및 형태 형상을 보존하면서 단면(CCS)을 m/z 및 CCS는 펩티드 stoichiometry, protonation 상태 및 형태 모양과 관련이 있습니다. Stoichiometry는 종에 존재하는 각 요소의 정체성 그리고 수가 명시적으로 식별되기 때문에 결정됩니다. 펩티드 복합체의 전체 전하는 산성 및 기본 부위의 프로토네이션 상태 및 금속 이온의 산화 상태에 관한 것이다. CCS는 복합체의 삼차 구조와 관련된 회전 평균 크기를 측정하기 때문에 펩타이드 복합체의 형태 형성에 대한 정보를 제공한다. 복합체의 전체 전하 상태는 또한 pH의 기능이며, 카르복실, 그의, Cys 및 Tyr와 같은 탈프로톤화된 기본 또는 산성 부위가 또한 금속 이온에 대한 잠재적 결합 부위이기 때문에 펩티드의 금속 이온 결합 친화도에 영향을 미친다. 분석을 위해 펩타이드 및 금속 이온은 희석 된 아세트산 또는 수산화 암모늄에 의해 조정 된 pH로 수성 용액으로 제조됩니다. 이는 펩티드에 대해 pH 의존성 및 금속 이온 선택성을 결정할 수 있게 한다. 또한 ESI-IM-MS에 의해 결정된 m/z 및 CCS는 B3LYP/LanL2DZ 분자 모델링과 함께 사용하여 복합체의 금속 이온 조정 및 삼차 구조의 유형을 발견할 수 있습니다. 이 문서에 나타난 결과는 ESI-IM-MS가 암펩티드 세트의 선택적 킬레이트화 성능을 특성화하고 이를 구리 결합 펩티드 mb-OB3b와 비교할 수 있는 방법을 보여줍니다.

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Protocol

1. 시약의 준비

  1. 배양 메틸로시누스 트리코스포륨 OB3b는 Cu(I)-무음 MB-OB3b18,22,23,동결건조시 시료를 동결건조시키고 사용전까지 -80°C에서 보관한다.
  2. 앰브 펩티드 (amb;98 % 순도 amb1,amb2,amb4;>70% 순도 amb7)샘플을 동결 건조하고 사용할 때까지 -80 °C에 보관하십시오.
  3. 구매 >98% 순도 망간 (II) 염화물, 코발트(II) 염화물, 니클(II) 염화물, 구리(II) 염화물, 구리(II) 질산염, 은(I) 질산염, 아연(II) 염화물, 철(III) 염화물 및 납(II) 염화물.
  4. 암종 및 HPLC 등급 이상의 수산화암모늄, 빙하 아세트산 및 아세토니트릴의 충돌 단면을 측정하기 위한 캘리브란트로 사용되는 폴리-DL-알라닌 폴리머를 구입한다.

2. 재고 솔루션 준비

  1. 펩타이드 스톡 솔루션
    1. 1.7 mL 플라스틱 바이알에서 MB-OB3b 또는 앰브의 질량10.0-20.0 mg의 질량을 사용하여 적어도 3개의 유의한 수치를 사용하여 정확하게 계량한다.
      참고: 계량된 질량은 1.00 mL의 탈이온화(DI) 물이 첨가될 때 펩티드의 용해도에 따라 12.5 mM 또는 1.25 mM을 산출해야 한다.
    2. 파이펫을 사용하여 1.00 mL의 탈이온수 (>17.8 MΩ cm)를 계량 된 펩티드 샘플에 추가하여 12.5 mM 또는 1.25 mM 용액을 산출합니다. 캡을 단단히 놓고 적어도 20 개의 반전과 철저히 섞습니다.
    3. 마이크로파이펫 디스펜스 50.0 μL aliquots를 펩티드 샘플로부터 개별적으로 라벨이 부착된 1.5 mL 바이알로 추출하고 사용 전까지 -80°C에 보관하였다.
  2. 금속 이온 스톡 솔루션
    1. 1.7 mL 바이알에서 적어도 3개의 유의한 수치를 사용하여, 금속 염화물 또는 질산은 10.0-30.0 mg의 질량을 사용하여 정확하게 계량한다.
      참고: 1.00 mL의 DI 물을 추가하면 계량 질량은 125 mM을 산출해야합니다.
    2. 1.7 mL 바이알의 계량 된 금속 샘플에 1.00 mL의 DI 물을 추가하여 125 mM 용액을 산출하십시오. 캡을 단단히 놓고 적어도 20 개의 반전과 철저히 섞습니다.
  3. 수산화 암모늄 스톡 솔루션: DI 물로 99.5 % 아세트산 용액의 57 μL을 최종 부피 1.00 mL로 희석하여 1.0 M 아세트산 용액을 준비합니다. DI 물로 21% 수산화암모늄 용액의 90 μL을 1.00 mL의 최종 부피로 희석하여 1.0 M 수산화 암모늄 용액을 준비합니다. 1.0 M 용액의 100 μL을 복용하여 0.10 M 및 0.010 M 아세트산 및 수산화 암모늄 용액을 사용하여 각 용액을 연속적으로 희석시다.
  4. 폴리-DL-알라닌 스톡 솔루션: PA 1.0 mg의 무게를 측정하고 1.0 mL의 DI 물에 용해하여 폴리 DL 알라닌 (PA)을 준비하여 1,000 ppm을 제공합니다. 철저히 섞으세요. 마이크로파이펫을 사용하여 50.0 μL 의 별칭을 분배하고 각각 1.7 mL 바이알에 넣고 -80°C에 보관합니다.

3. 전기 분무 이온 이동성 질량 분석

  1. ESI 입구 튜브와 바늘 모세관을 0.1 M 빙하 아세트산, 0.1 M 암모늄 수산화물, 그리고 마지막으로 DI 물로 약 500 μL로 철저히 청소합니다.
  2. 1,000 ppm PA 스톡 용액의 50.0 μL aliquot를 해동하고 450 μL의 DI 물로 희석하여 100 ppm PA를 제공합니다. 이 용액의 파이펫 100.0 μL을 1.00 mL로 희석하고 DI 물 500 μL과 아세토니트릴 500 μL로 10 ppm PA 용액을 제공합니다.
  3. 토론 섹션에 기재된 바와 같이 네이티브 ESI-IM-MS 조건을 사용하여 각각 10 ppm PA 용액의 음수 및 양성 이온 IM-MS 스펙트럼을 수집한다.
  4. 12.5 mM 또는 1.25 mM 의 50.0 μL aliquot를 해동하고 DI 물로 연속희석하여 0.125 mM 의 최종 농도를 부여합니다. 희석할 때마다 완전히 섞으세요.
  5. 125 mM 금속 이온 스톡 용액의 파이펫 100.0 μL, 1.7 mL 바이알에 놓고 DI 물로 1.00 mL로 희석하여 12.5 mM 금속 이온을 제공합니다. 최종 0.125 mM 금속 이온 농도를 제공하기 위해 두 개의 연속 희석을 반복합니다. 희석할 때마다 완전히 섞으세요.
  6. 0.125 mM amb의 파이펫 200.0 μL을 1.7 mL 바이알에 넣고 500 μL의 DI 물로 희석하고 용액을 철저히 혼합합니다.
  7. 1.0 M 아세트산 용액의 50 μL을 추가하여 시료의 pH를 3.0으로 조정합니다.
  8. 0.125 mM 금속 이온의 200.0 μL을 pH 조정 샘플에 추가합니다. DI 물을 추가하여 시료의 최종 부피를 1.00 mL산출하고, 철저히 혼합하고, RT에서 10분 동안 시료가 평형화되도록 하십시오.
  9. 무딘 코 주사기를 사용하여 샘플의 500 μL을 취하고 각각 5 분 동안 음의 양성 이온 ES-IM-MS 스펙트럼을 수집합니다. 시료의 나머지 500 μL을 사용하여 교정된 마이크로 pH 전극을 사용하여 최종 pH를 기록합니다.
  10. 3.6-3.9단계를 반복하면서 pH를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 또는 10.0으로 조정하면서 0.010 M, 0.10 M, 또는 1.0 M 아세트산 또는 암모늄 수산화액의 새로운 부피를 추가한다.
  11. 각각 10 ppm PA 용액의 음수 및 양성 이온 ESI-IM-MS 스펙트럼을 수집합니다.

4. 암두 시료의 금속 이온 적정 준비

  1. 3.1-3.5 단계에 설명된 단계를 따릅니다.
  2. 0.125 mM amb의 파이펫 200.0 μL을 1.7 mL 바이알에 넣고 500.0 μL의 DI 물로 희석하고 용액을 철저히 혼합합니다.
  3. 0.010 M 수산화 암모늄 용액의 80 μL을 첨가하여 시료의 pH를 pH = 9.0으로 조정한다.
  4. 0.125 mM 금속 이온 용액의 28 μL을 추가하여 금속 이온의 0.14 어금니와 동등한 것을 주고, DI 물을 추가하여 샘플의 최종 부피를 1.00 mL로 만들고, 철저히 혼합하고, RT에서 10 분 동안 평형을 처리합니다.
  5. 무딘 코 주사기를 사용하여 샘플의 500 μL을 취하고 각각 5 분 동안 음의 양성 이온 ESI-IM-MS 스펙트럼을 수집합니다. 시료의 나머지 500 μL을 사용하여 교정된 마이크로 pH 전극을 사용하여 최종 pH를 기록합니다.
  6. 4.2-4.5단계를 반복하면서, 0.125 mM 금속 이온 용액의 적절한 부피를 추가하여 0.28, 0.42, 0.56, 0.70, 0.84, 0.98, 1.12, 1.26, 또는 1.40 모금 등가물을 부여한다.
  7. 각각 10 ppm PA 용액의 음수 및 양성 이온 IM-MS 스펙트럼을 수집한다.

5. ESI-IM-MS pH 적정 데이터 분석

  1. IM-MS 스펙트럼에서 암스의 충전 된 종은 이론적 인 m / z 동위 원소 패턴과 일치하여 존재하는 것을 식별합니다.
    1. MassLynx를 열고 크로마토그램창을 클릭하여 크로마토그램 창을 엽니다.
    2. 파일 메뉴로 이동하여 열기로 이동하여 IM-MS 데이터 파일을 찾아 엽니다.
    3. 오른쪽 단추로 클릭하고 크로마토그램을 가로질러 드래그하여 IM-MS 스펙트럼을 추출하고 해제합니다. IM-MS 스펙트럼을 보여주는 스펙트럼 창이 열립니다.
    4. 스펙트럼 창에서 도구동위원소 모델을클릭합니다. 동위원소 모델링 창에서 앰브 종의 분자 공식을 입력하고 충전 된 이온 표시 상자를 확인하고 충전 상태를 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
    5. 반복하여 IM-MS 스펙트럼의 모든 종을 식별하고 m/z 동위원소 범위를 기록합니다.
  2. 각 암종종에 대해 우연한 m/z 종을 분리하고 m/z 동위원소 패턴을 사용하여 도착 시간 분포(ATD)를 추출하여 식별합니다.
    1. MassLynx에서 프로그램을 엽니 다 드리프트 스코프를 클릭합니다. 드리프트 스코프에서 파일을 클릭하고 열기를 클릭하여 IM-MS 데이터 파일을 찾아 엽니다.
    2. 마우스를 사용하고 왼쪽 클릭을 사용하여 amb 종의 m/z 동위원소 패턴을 확대합니다.
    3. 선택 도구와 왼쪽 마우스 단추를 사용하여 동위원소 패턴을 선택합니다. 현재 선택 수락 단추를 클릭합니다.
    4. 우연히 m/z 종을 분리하려면 선택 도구와 왼쪽 마우스 버튼을 사용하여 AMB 종의 동위원소 패턴과 정렬된 ATD 시간을 선택합니다. 현재 선택 수락 단추를 클릭합니다.
    5. ATD를 내보내려면 FILE | 으로 이동 MassLynx로 내보낸다음 드리프트 시간 유지를 선택하고 파일을 적절한 폴더에 저장합니다.
  3. ATD의 중심을 결정하고 종 인구의 척도로 ATD 곡선 아래의 영역을 통합합니다.
    1. MassLynx의 크로마토그램 창에서 저장된 내보낸 파일을 엽니다. 프로세스 | 클릭 메뉴에서 통합합니다. ApexTrack 피크 통합 확인란을 선택하고 확인을클릭합니다.
    2. 크로마토그램 창에 표시된 대로 중심 ATD(tA)와통합 영역을 기록합니다. 저장된 모든 앰브 및 PA IM-MS 데이터 파일에 대해 반복합니다.
  4. 각 적정 점에서 양수 또는 음이온의 추출된 모든 암브 종에 대해 통합 ATD를 사용하여 상대백분율 척도로 정규화합니다.
    1. 각 pH에서 앰브 종의 ID와 통합 ATD를 스프레드시트에 입력합니다.
    2. 각 pH에 대해 통합 ATD의 합계를 사용하여 개별 앰브의 ATD를 백분율 척도로 정규화합니다.
    3. 그래프에서 각 암종 과 pH의 백분율 강도를 플롯하여 각 종의 개체수가 pH 의 함수로 어떻게 변하는지 보여줍니다.

6. 충돌 단면

  1. 스프레드시트를 사용하여, HE 버퍼 가스28에서 측정된 PA 음수25,26 및 양수27 이온의 CCS(Ω)를 아래 방정식 1을 사용하여 수정된 CCS(Ωc)로변환합니다. 전자 (것)이 c = 전자 전하 (1.602 × 10-19 C); m (것)m N 2 = N2 가스 (Da)의 질량; m 이온 = 이온 질량. 29세

Equation 1

  1. PA 캘리브란트 및 앰브 종의 평균 도착 시간(tA)을아래 방정식 2를 사용하여 드리프트 시간(tD)으로변환합니다: c= 향상된 듀티 사이클 지연 계수(1.41) 및 m/z는 펩티드 이온의 질량-전하이다.

Equation 2

  1. PA 교정란트의 tD 대 Ωc를플로팅합니다. 그런 다음 아래 그림과 같은 방정식 3의 최소 제곱 회귀 적합을 사용하여 A' 및 B 값을 결정합니다. 및 B는 IM 장치의 비선형 효과를 보정합니다.

Equation 3

  1. 이러한 A' 및 B 값과 앰브의 ATD에서 중심 tD 값을 사용하면 방정식 3을 사용하여 Ω c와 방정식 1을사용하여Ω을 결정합니다. 이 방법은 약 2%25,26,27의추정 절대 오차를 가진 펩티드 종에 대한 CCS를 제공한다.

7. 전산 방법

  1. 베케 3 파라미터 하이브리드기능(30)과 Dunning 기초 세트31 및 전자 코어 전위32,33,34로 구성된 B3LYP/LanL2DZ 이론 레벨을 사용하여 찾을 수 있습니다. 관측 된 m / z amb 종35의모든 가능한 조정 유형에 대한 지오메트리 최적화 된 응수 .
    참고: 계산을 빌드하고 제출하는 방법에 대한 자세한 내용은 보충 파일의GaussView 사용을 참조하십시오.
  2. 각각의 응셈자의 예측된 자유 에너지를 비교하고 시그마프로그램(36)으로부터이온 스케일렌나드 존스(LJ) 방법을 사용하여 그들의 이론적 CCS를 계산한다.
  3. 가장 낮은 자유 에너지 순응자로부터 실험에서 관찰된 응수자에 대한 삼차 구조 및 조정 유형을 식별하기 위해 IM-MS 측정 CCS에 동의하는 LJ CCS를 나타내는 컨포머가 결정됩니다.

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Representative Results

Amb1의 금속 결합
IM-MS 연구20 amb1 (그림 1A)은구리 와 아연 이온 이온이 모두 pH 의존적 방식으로 amb1에 결합되는 것으로 나타났다(그림2). 그러나, 구리와 아연은 상이한 조정 부위에서 상이한 반응 메커니즘을 통해 amb1에 결합한다. 예를 들어, Cu(II)를 amb1에 첨가하면 이황화 교량 형성에 의해 amb1(amb 1ox)의산화가 발생하였고, pH에서 >6, [amb 1ox-3H+Cu(II)]-이온(도2A)이형성되었다. 이것은 Cu (II)를 조정하고 있던 2개의 imidazoliums, carboxyl 단 및 2개의 추가 사이트의 deprotonation를 표시했습니다.

[amb1ox-3H+Cu(II)]의 분자 모델링- B3LYP/LanL2DZ를 이용한 이온은 가장 낮은 에너지 복합체가 Cu(II)가 그의1의 이미다졸 δN과 Cys 2의 백본 아미드 그룹의 탈프로톤질소를 통해 조정되었다고 판단했습니다. 및 글리3. 그러나, 6의 pH 이하, Cu(II)를 amb1에 첨가하면 Cu(I) 결합에 의해서만 설명될 수 있는 m/z 동위원소 패턴을 형성하고, [amb1ox+Cu(I)]+이온을 형성하였다(도 2B). 대조적으로, pH가 6보다 높면 m/z 동위원소 패턴이 1 m/z 감소하는 원인이 며, 양전하 [amb 1ox-H+Cu(II)]+ 이온에 의해 고려된다. Zn(II)을 첨가하면 AMB1을산화시키지 않았고, Zn(II) 결합은 pH에서 관찰되었고>6, 주로 [amb 1-3H+Zn(II))]-이온(도2C)을형성하였다. 이것은 이미다졸리온, 티올 및 카르복실 군의 비프로토스를 나타냈다. [AMB1-3H+Zn(II)]의 분자 모델링- 이온은 2His-2Cys 또는 His-2Cys 및 C-종단의 카복실레이트를 통한 사위 Xn(II) 조정중 하나인 가장 낮은 에너지 순응자를 결정했습니다.

AMB2의 다중 Cu(I) 바인딩
Cu(II)와 AMB2(그림 1B)사이의 산화반소 반응은 Cu(I) 결합을 초래하였다. 이는 IM-MS, UV-Vis 분광도법 및 B3LYP 분자 모델링37을사용하여 보다 자세하게 연구되었다. 5의 pH에서 Amb2의 Cu(II) 적정의 주요 제품은 amb2 산화(이황화물 교량 형성을 통해) 및 3개의 Cu(I) 이온을 조정하는 무산화 된 amb2 종이었다.

B3LYP/LanL2DZ 방법을 사용한 검색은 3Cu(I) 조정 된 종에 대해 경쟁하는 두 개의 저에너지 복합체를 위치시켰습니다. 첫 번째는 그림 3A에표시된 복합체로, 3Cu(I) 이온은 Cys2와 Cys6(그의 1)의브리징 티올레이트 그룹38과 δN1 및 δN5(그의 5중 5개)를 통해 조정되었습니다. ). 두 번째 복합체(3c)는 양성자 인 그의1 측 그룹과 C 말단 카르복실레이트 그룹 사이에 소금 다리를 가지고 있다. 이러한 결과는 3.0-6.0의 pH에서, 주요 amb2+3Cu(I) 복합체는 최소한의 구조적 재배열만으로 용액에서 가스 상으로 성공적으로 이송될 수 있는 염절교구조입니다.

209 ±6Å2의이론적 LJ CCS는 복잡한 3c에 대해 시그마프로그램(36)을 사용하여 계산되었으며, IM-MS 측정 CCS와 합의하여 3c가 pH 3.0-6.0에서 [amb 2-2H+3Cu(I)]+ 형태를 나타낸다는 것을 나타낸다. 그러나, >6의 pH에서, 이 복합체는 IM-MS에 의해 관찰되지 않았을 것이고, 아마도 그의1(p Ka= 6.0)의 추가 분해가 전체 중성 복합체를 초래하기 때문일 것이다. 그의1의 imidazoleum 그룹이 deprotonated되면, 3Cu (I) 조정은 Cys2와 Cys6의 브리징 티오레이트 그룹뿐만 아니라 δN1 및 δN5 그의1과 그의5, (3a) 각각.

AMB4 Cu(I/II)-결합 및 산화환원 활성의 pH 의존성
IM-MS 및 B3LYP 기술은 AMB4의 Cu(II) 및 pH 적정을 조사하는 데 사용되었으며(그림1C)및 확인된 단량체, 디머, 트리머 및 최대 3개의 Cu(I) 이온 또는 2개의 Cu(II)를 포함하는 amb4의 테트라머 복합체를 확인했습니다. ) 각 단량체 분단위에 대한 이온(39). 상기 복합체는 또한 다양한 수의 이황화물 교량을 포함했으며, 이들 제품은 AMB4를 가진 Cu(II) 반응이 혐기성 또는 호기성 수성 액액으로 진행되었는지 여부에 관계없이 생산되었다.

IM-MS 기술을 사용하여, 이러한 개별 종은 그들의 도착 시간의 차이로 인해 동위원소 패턴이 겹쳐도 분리되고 정량화 될 수 있음을 보여주었다(그림 4). 이러한 밀접하게 관련된 종의 식별 및 정량화는 다른 도구 또는 분석 기술이 달성 할 수없는 작업입니다. 이러한 IM-MS 연구는 pH 의존적 산화환원 반응에 대한 상당한 통찰력을 제공하고 정확하게 각 복합체에서 다름의 수 또는 분자 내 이황화물 교량의 수, Cu(I) 또는 Cu(II) 이온의 수, 및 폭발 부위의 수를 확인하였다( 그림 5).

또한, 복합체 CCS를 측정하면 개별 종의 각 형태 크기를 측정할 수 있었으며, 광범위한 B3LYP/LanL2DZ 검색과 함께 사용되어 올바른 분자모두에 동의한 구조와 일치하는 구조를 찾아냈습니다. IM-MS에 의해 측정된 석양측정및 CCS. 이 방법을 통해 다양한 복합체의 Cu(I/II) 조정이 확인되었다. Cu (II)와 amb4 사이의 반응은 용액의 pH에 따라 Cu (I) 또는 Cu (II)를 조정하는 디머, 트리머 및 테트라머의 형성을 포함했다.

예를 들어, 경미한 산성(pH = 3.0-6.0)인 용액에서, 그들은 주로 Cu(I) 이온을 결합하고 산화되지 않은 반면, 약간 기본적인 용액(pH = 8.0-11.0)인 용액에서는 주로 Cu(II) 이온을 결합하고 모든 Cys 형성 이황화물에 의해 산화되었습니다. 채권(그림 6). B3LYP/LanL2DZ는 Cu(I) 이온이 티오레이트와 이미다졸 그룹에 의해 선형및 브리지된 것으로 판단했으며, Cu(II) 이온은 이미다졸에 의한 왜곡된 T자형 또는 사각형 평면 형상과 의 분해된 백본 질소를 통해 킬레이트된 것으로 확인되었습니다. 아마이드 그룹.

MB-OB3b의 IM-MS 분석
IM-MS 연구19,40 mb-OB3b의(그림 1D)가스 상에서, Cu (I)-무료 MB-OB3b 는 세 가지 부정적인 충전 종으로 존재 것으로 나타났다: [mb-OB3b-H] –[mb-OB3b-2H] 2그리고 [mb-OB3b-3H] 3 –예상 솔루션 단계 동작과 일치합니다. 개별 금속 이온 적정은19를 수행하여 mb-OB3b의 금속 이온 선택성을 결정하였다. 도 7은 선택된 금속 이온 적첩의 결과를 나타내고 MB-OB3b의 명백한 결합 선택도가 3개의 주요 그룹으로 분류될 수 있음을 나타낸다: 1) Cu(I) 및 Ag(I); 2) Ni(II), Zn(II) 및 Co(II); 및 3) Pb(II), Fe(II) 및 Mn(II)을 사용합니다. 이러한 결합 선택성 순서는 형광 담금질실험(19) 및 등온 적정 열량계(18)에 의해발견되는 것과 일반적으로 일치하는 것으로 나타났다.

MB-OB3b와 앰브의 비교 7명 금속 바인딩 선택성
mb-OB3b의 명백한 결합 선택성은 7의 pH에서 amb7의 결합 선택도와 비교되었다. amb7은 mb-OB3b와 동일한 아미노산 서열로 설계되었지만, 두 개의 에네티올 옥사졸론 그룹이 2개의 His-Cys 그룹으로 대체되었다. Amb7 (그림 1E)은Cys 6과 Cys12 사이의 단일 이황화 결합을 가합니다. 음전하 복합체의 형성결과(도 8)Amb7이 Ni(II) 및 Zn(II) (60%)에 대해 바람직한 결합 선택도를 보였으며, 그 다음으로 Co(II) 및 Pb(II) (40%)가 그 뒤를 이었다. 더욱이, 약 20% Cu(II) 결합이 있었다. 아그(I), Mn(II) 또는 Fe(II)의 흔적 또는 AMB7 결합이 없었다. 이는 Cu(I) 및 Ag(I) 결합에 대해 MB-OB3b의 바람직한 결합 선택도90% 이상과 비교하였다.

Figure 1
도 1: 대안메탄노박틴(amb) 및 메탄백틴(mb-OB3b) 펩티드의 1차 구조. (A) 아세틸 - 그의1-Cys2-Gly3-Pro4-그의5-Cys6 (Amb1); (B) 아세틸 - 그의1-Cys2-Tyr3-Pro4-그의5-Cys6 (Amb2); (C) 아세틸 - 그의1-Cys2-Gly3-Ser4-Tyr5-Pro6-그의7-Cys8-Ser9 (amb4); (D) 1-(N-[메르카프토-(5-옥소-2-(3-메틸부타노일)옥사졸-(Z)-4-일리덴]-글리1--Ser2– Cys3–Tyr 4)-피롤리딘-2-yl-(메르카포-[5-옥소-옥사졸-(Z)-4-ylidene]메틸)-세르5 - Cys6–Met7 (mb-OB3b); (E) 아세틸 - 루1- 그의2-Cys3-글리4-Ser5-Cys6-Tyr7-Pro8-그의9-Cys10-Ser11-Cys12-Met 13 (AMB7). 샤딩은 : 2His-2Cys 또는 enethiol-oxazoloneIcon결합 부위 (); 프롤린 또는 피롤리딘Icon경첩 (); 아세틸 또는 메틸부탄놀 군 N-종단 ();Icon 및 티로신, 이는 제2 용해 쉘 π-양이온 상호작용()을Icon통해 금속 이온 조정을 안정화시킬 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 대체 메탄백액틴(amb1)의상대적 강도를 평균하는 아세틸-그의1-Cys2-Gly3-Pro4-그의5-Cys6 및 금속 결합 복합체(amb1+X)(여기서 X = Cu 또는 Zn). amb의 1:1 몰 비 용액의 음과 양성 이온 질량 분석 분석 동안 관찰이 이루어졌다:XCl2 는 3.0-11.0의 pH 범위에 걸쳐. 오차 막대는 3개의 복제 pH 적정 실험으로부터 상대 강도 및 pH 둘 다의 평균 편차를 보여준다. amb:CuCl2의 1:1 어금니 용액은 Cys2 및 Cys6이있는 amb(ambox)의산화를 초래하여 이황화 다리를 형성하였다. (A) AMB의 음의 이온 분석 :CuCl2 [앰브-H]를 보여주는- [앰브옥스-3H + Cu(II)]]- -. (B) amb:CuCl2 [앰브소]+ 및 [암마소 +Cu(I/II)]+를 보여주는 양성 이온분석; 복합체에서 Cu의 산화 상태는 pH 의존적이었고, [앰브+Cu(I)]];  아래 pH 8 [앰브-H + Cu (II)]+; 8의 pH 이상. (C) amb:ZnCl2의 음이온 분석 [amb]n−과 [amb+Zn(II)]n−을보여주는 . (D) amb:ZnCl2 [amb]n+와 [amb+Zn(II)]n+를보여주는 양성 이온 분석 . 이 수치는 이전 발행물20에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 이론의 B3LYP/LanL2DZ 수준에서 위치한 가장 낮은 에너지 및 형상 최적화 구조를 사용하여 [amb2+3Cu(I)]+ 제안된 구조. (a)3 Cu(I) δN1δN5의 그의1 및 그의5 및 Cys2 및 Cys6의 이론적 단면을 217±6Å2의이론적 단면을 가진 티오슬레이트 브리징 그룹. (B)δN1δN5 및 티오레이트 브리징 조정의 그림. (c)카복실레이트 단말(Cys6),δN5,및 209±6Å2의이론적 단면을 가진 티오레이트 브리징을 통한 3Cu(I) 협응을 나타내는 염트 브리지 구조. (D)카르복실레이트 단말의 그림, δN5,및 티오레이트 브리징 조정. 본딩 거리 A, B, C, D, E 및 F는 Å의 단위에 도시되어 있습니다. 이 수치는 이전 출판물37에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: pH =4.4에서 amb 4:Cu(II)의 1:1 혼합물의 제품의 IM-MS 분석.  (A) [AMB4-2H+3Cu(I)]+[디아브4 -4H+6Cu(I)]2+및 [트리암브4-6H+9Cu(I)]3+ 및 [테트라암4 -8H+12Cu(I)]4개 이상 종에 대한 추출된 동위원소 패턴. (B) [AMB4-2H+3Cu(I)]+[디아브4 -4H+6Cu(I)]2++ [트리암브4-6H+9Cu(I)]3+ 및 [테트라암4 -8H+12Cu(I)]의 추출된 도착 시간의 통합4+ 상대적 강도를 계산하는 데 사용되었습니다. 백분율 상대 강도를 계산하기 위해 각 적정점에 대해 추출된 모든 종에 대한 통합 영역의 합계를 백분율 배율로 정규화하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: Cu(II)의 어금니 등가물의 pH 적정 동안관찰된 singly Cu(I/II) 바운드 amb에 대한 동위원소 패턴 의 변화:pH=4.04에서 amb4, 6.02, 및 9.98. pH = 4.04에서 실험 결과는 주로 [AMB4+Cu(I)]+에대한 동위원소 모델과 일치합니다. pH = 6.02에서, 이황화 교량의 형성을 의미하는 -2 m/z의 변화가 있다(amb4ox의산화로 표시됨) 및 [amb4ox+Cu(I)]에 대한 동위원소 패턴과의 합의+. pH = 9.98에서 Cu(II) 바인딩을 의미하고 +1 충전 상태를 유지하기 위해 양성자의 제거를 의미하는 -1 m/z의 추가 변화가 있으며, 이는 [amb4ox-H +Cu(II)]에 대한 동위원소 패턴과일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 3.0-11.0의 pH 범위에서 amb4의 단량체, 이량체 및 트리머의 Cu(I/II) 복합체의 상대적 ID 강도를 변경합니다.  (A) 1개의 Cu(I/II) 이온을 가진 단량체, (B) 2Cu(I/II) 이온으로 이량, (C) 3Cu(I/II) 이온이 있는 (C) 트리머. 캡션은 단지에 얼마나 많은 이황화물 결합이 존재했는지 를 기록합니다. 이 수치는 이전 출판물39에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: Cu(I), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) 또는 페(II) 메탄백틴 복합체의 형성비율. 메탄백틴의 개별 금속 이온 적정 동안 관찰. Cu(I) 결합은 Fe(III)의 첨가로부터 Cu(II) 및 Fe(II)의 첨가로부터의 결합으로부터 의한 결과임을 주목해야 한다. 이 수치는 이전 출판물19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: Cu(I/II), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) 또는 Fe(II) 분화의 백분율을 비교하여 mb-OB3b 및 amb7을 pH=7로 비교합니다. 비교는 음전하 이온의 형성을위한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

중요한 단계: ESI-IM-MS를 통한 검사를 위한 솔루션 단계 거동 보존
네이티브 ESI 기악 설정은 펩티드 stoichiometry, 전하 상태 및 형태 구조를 보존하는 데 사용되어야 합니다. 기본 조건의 경우 원뿔 전압, 온도 및 가스 흐름과 같은 ESI 소스의 조건을 최적화해야 합니다. 또한 소스, 트랩, 이온 이동성 및 전송 이동 파(특히 IM 셀로의 사출 전압을 제어하는 DC 트랩 바이어스)의 압력과 전압이 충전 상태 및 이온 이동성 분포에 미치는 영향을 확인해야 합니다.

다음은 이 작업에 사용된 일반적인 작동 조건입니다. 수성 펩타이드 시료를 10 μLmin-1 유량, 2.0 kV 모세관 전압을 사용하여 무딘 코 1.0 mL 주사기를 사용하여 주입하였고, 음이온에 대한 2.0 kV (+) 또는 -1.8 kV 음이온(-), 130°C 소스 온도, 250°C 응축, 20V 샘플링 콘, 4.0 V 샘플링 콘, 4.0 V샘플링 콘, 추출 원뿔. IM 섹션은 1.5 mL /min 유량을 사용하여 2.25 x 10-2 mbar의 아르곤 압력으로 트랩 셀에 6.0V 입구 전압으로 작동했습니다. IM 셀에 이온(트랩 DC 바이어스)을 주입하기 위한 전압은 질소 버퍼 가스와 처음 충돌했을 때 이온의 해리를 피하기 위해 12V로 설정되었습니다. IM 셀은 전하 및 충돌 단면에 따라 이온을 분리하고 0.52 mbar 질소 압력과 20.0 mL min-1 유량을 활용했습니다. IM은 12.0-20.0V(+) 또는 8.0-30.0V(−) 주행 웨이브 높이로 작동했으며 IM 주행 파의 셀을 통과하는 모든 스윕에 대해 800-1,500ms-1(+) 또는 250-1,000ms-1(−) 속도로 진입했습니다. 이송 셀은 트랩 셀과 동일한 아르곤 압력으로 작동되었고 IM 해결 이온을 직교 비행 시간 질량-전하 분석기로 유도했습니다. 이온 이동성 질량 스펙트럼은 이온의 문이 닫힌 방출을 비행 시간 질량-전하 분석기와 IM 셀에 동기화하여 획득했습니다.

기본 ESI 조건을 사용하면 IM-MS 분석 중에 전하 상태 및 형태 상태와 같은 솔루션 상 특성이 보존됩니다. 예를 들어, IM-MS분석(20)동안 관찰된 MB-OB3b 및 앰브의 충전 상태는 용액 단계40에서예상되는 전하 상태와 밀접한 관련이있었다. 상기 MB-OB3b 펩타이드는 테트라프로틱이며 IM-MS분석(40)동안에만 음전하 이온을 형성하며, Cu(I)-바운드 또는 Cu(I)-프리, C-종단(pKa < 1.7), 2개의 에네티올 옥사졸론 군(pKa= 5.0 및 9.7) 및 Tyr 그룹(pKa = 11.0)42. 완전히 프로톤화된 형태의 앰브는 C-종점(pKa = 2), 2개의 그(pKa = 6.0), 두 개의 Cys(pKa = 8.3), Tyr(pKa = 11.0) 사이트19,41로인해 +2의 전체 전하를 갖습니다. 따라서, 그들은 일반적으로 <6의 pH에서 양전하 이온을 형성하고 >6의 pH에서 음전하 이온을 형성합니다.

앰브는 또한 낮은 pH에서 Cu(I)-결합이 더 높은 pH에서 Cu(II) 결합으로 전환되는 명확한 pH 의존적 Cu(I/II) 결합 거동 및 레독스 활성을 보였다. Cu(I/II) 반응은 이황화 결합 및 다양한 다중 및 다중 Cu(I/II) 결합을 포함하는 산화된 암종(ambox)을형성하는 것을 포함하였다(도5도 6). 이러한 레독스 반응은 시간에 따라 달라지며 시료 제제와 IM-MS 분석 사이의 시간 간격(최대 210분)이 더 길어지고 더 많은 산화된 제품이37로관찰되었다는 것을 보여주었다. 따라서 제품의 관찰에 대한 반응 시간 의존도를 신중하게 고려해야 합니다.

제한 사항: IM-MS 및 이론적 충돌 단면은 각 금속 이온이 선호하는 조정 유형을 식별합니다.
IM-MS m/z 및 CCS 데이터를 해석하기 위해 B3LYP/LanL2DZ 수준의 이론을 사용하여 광범위한 검색을 수행했습니다. 서로 다른 조정 부위를 가진 기하학적 최적화된 응체는 IM-MS에 의해 측정된 CCS와의 예측된 자유 에너지 및 계약 사이에서 비교되었고, 이들 펩타이드및 그 복합체의 분자 모델링은 전자의 종류에 의해 제한된다. 상대적으로 큰 시스템에 적용할 수 있는 구조 계산. 연구되거나 권장된 다른 방법은 트루흐라 외43에의한 작업을 포함하며, 누가 M05-2X가 최고의 DFT 기능및 PM7 및 MNDO/d가 Zn(II)함유화합물(44)에대해 양호한 NDDO 반 경험적 방법이었다는 것을 발견했다. 이러한 펩타이드는 큰 형태 공간을 가지며 가장 낮은 에너지 순응자를 찾기 위한 철저한 조사를 통해 다양한 금속 킬레이트화 부위, 다양한 시스 및 트랜스 펩타이드 결합, 염-브리지, 수소 결합 및 π-양이온을 비교해야 합니다. 방향족 Tyr 측단과 금속 양이온 사이의 상호 작용.

기존 방법에 대한 중요성 : Cu (I / II) 및 MB-OB3b와 앰브 사이의 비교 다른 선택 된 금속 이온 바인딩
X선 결정학 및 NMR 분광법은 펩티드 삼차 구조의 원자 분해를 결정하는 데 사용되는 가장 일반적인 기술입니다. 그러나, 금속로펩타이드의 X선 결정학 연구는 이들복합체(45)의결정화에 대한 문제로 인해 부족하다. NMR은 또한 밀접하게 관련된 개별 올리고펩타이드종(46)이존재하는 샘플의 해석에 적합하지 않다. 따라서 IM-MS 및 DFT 분자 모델링은 특히 복잡한 산화독및 Cu(I/II) 결합반응20, 37,40, 47. IM-MS의 강점은 각 제품을 해결하고 stoichiometry, protonation 상태 및 형태 구조와 관련된 m / z 및 도착 시간을 동시에 측정하여 분자 구성을 식별 할 수 있다는 것입니다.

예를 들어, mb-OB3b는 다양한 금속 이온을 킬레이트하고, 각 이온을 향한 선택성은 IM-MS 금속 이온 적정에 의해 표시되었다(도7). 결과는 Cu(I) 및 Ag(I)를 결합하기 위한 MB-OB3b 선호도를 보였으며, 7의 pH에서 결과를 amb7과비교하였다. 도 8은 Amb7이 우선적으로 Zn(II) 및 Ni(II)를 나타낸다. 일반적으로, amb 연구는 2His-2Cys로 두 enethiol-oxazolones를 대체하는 것이 Cu (I/II) 결합을 배제하지 않았다는 것을 보여주었습니다, 그러나 단핵 Cu (I)와 반대로 선형 브리징 조정을 통해 다중 Cu (I)결합귀착되게 했습니다(그림 3) mb-OB3b의 적층 조정의 바인딩48. Cu(II) 환감소는 또한 아포-mb-OB3b의 기존 이황화물 교량과 대조적으로 티올 산화 및 이황화 교량 형성에 의해 매개되었으며, Cu(I) 49에 대한 강한 선호도를 지지하는 구리 적재 MB-OB3b에 대한 높은 환원 전위 .

향후 응용 프로그램
Amb 펩티드의 추가 IM-MS 연구는 진행 중이며, 티르 잔류물은 글리 또는 Phe로 대체되는 동안, 그들의 1 차적인 순서는 글리 또는 Asp로 그의 또는 Cys를 대체하여 수정됩니다. 이러한 연구는 또한 10.0 mM 암모늄 아세테이트에서 수행되고 있으며, pH는 각 샘플에 대한 총 이온 강도를 일정하게 유지하기 위해 수산화 암모늄 (pH = 7, 8 및 9)으로 변형되었습니다. 이러한 결과는 곧 게시될 예정입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 자료는 1764436, NSF 기기 지원(MRI-0821247), 웰치 재단(T-0014), 에너지부(TX-W-20090427-0004-50) 및 L3 통신의 컴퓨팅 리소스에 따라 국립 과학 재단이 지원하는 작업을 기반으로 합니다. . 우리는 시그마 프로그램과 아요바미 Ilesanmi비디오에서 기술을 시연에 대한 공유 산타 바바라 캘리포니아 대학의 바우어의 그룹에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

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