Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ion Mobility-massaspectrometrie en moleculaire modelleringstechnieken kunnen de selectieve metaal chelerende werking van ontworpen metaal bindende peptiden en de koper bindende peptide methanobactin karakteriseren. Ontwikkeling van nieuwe klassen van metaal chelerende peptiden zal helpen leiden tot therapieën voor ziekten in verband met metaalionen misbalans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektro spray ionisatie (ESI) kan een waterige-fase peptide of peptide complex overdragen naar de gasfase terwijl het de massa, totale lading, metaal bindende interacties en conformationele vorm behouden. Koppeling ESI met Ion Mobility-massaspectrometrie (IM-MS) biedt een instrumentale techniek die gelijktijdige meting van de massa-to-charge (m/z) en Collision cross sectie (CCS) van een peptide die betrekking hebben op zijn stoichiometry, protonatie toestand, en conformationele vorm. De totale lading van een peptide complex wordt gecontroleerd door de protonatie van 1) de peptide zure en fundamentele sites en 2) de oxidatietoestand van de metalen Ion (s). Daarom is de totale charge toestand van een complex een functie van de pH van de oplossing die de peptiden metaal ion binding affiniteit beïnvloedt. Voor ESI-IM-MS-analyses worden peptide-en metaalionen oplossingen bereid uit waterige oplossingen, waarbij de pH wordt aangepast met verdund waterig azijnzuur of ammoniumhydroxide. Dit maakt het mogelijk om pH-afhankelijkheid en metaalionen selectiviteit te bepalen voor een specifiek peptide. Verder kan de m/z en CCS van een peptide complex worden gebruikt met B3LYP/LanL2DZ moleculaire modellering om bindende locaties van de metaalionen coördinatie en tertiaire structuur van het complex te onderscheiden. De resultaten laten zien hoe ESI-IM-MS de selectieve chelerende werking van een set alternatieve methanobactin peptiden kan karakteriseren en vergelijken met de koper bindende peptide methanobactin.

Introduction

Koper en zink ionen zijn essentieel voor levende organismen en cruciaal voor processen met inbegrip van oxidatieve bescherming, weefsel groei, ademhaling, cholesterol, glucose metabolisme, en genoom lezing1. Om deze functies mogelijk te maken, nemen groepen zoals het thiolaat van CYS, imidazol van zijn2,3, (meer zelden) verschillende van methionine en carboxylaat van Glu en ASP selectief metalen op als cofactoren in de actieve gebieden van metalloenzymen. De gelijkenis van deze coördinatiegroepen werpt een intrigerende vraag op over hoe de liganden van zijn en CYS selectief cu (I/II) of Zn (II) opnemen om een correcte werking te garanderen.

Selectieve binding wordt vaak bewerkstelligd door peptiden voor acquisitie en handel, die Zn (II) of cu (I/II) ionen concentraties controleren4. Cu (I/II) is zeer reactief en veroorzaakt oxidatieve schade of onvoorziene binding aan enzymen, dus de vrije concentratie is strak gereguleerd door koperen chaperonnes en koper-regulerende eiwitten die het veilig vervoeren naar verschillende locaties in de cel en strak controle van de homeostase5,6. Verstoring van het koper metabolisme of homeostase is direct betrokken bij Menkes en de ziekte van Wilson7 evenals kanker7 en neurale aandoeningen, zoals prion8 en de ziekte van Alzheimer9.

De ziekte van Wilson wordt geassocieerd met verhoogde koper niveaus in de ogen, de lever en de delen van de hersenen, waar de redoxreacties van Cu (I/II) reactieve zuurstof soorten produceren, waardoor hepatolenticulaire en neurologische degeneratie. Bestaande chelatie therapieën zijn het kleine thiolaminozuur Penicillamine en Triethyleentetramine. Als alternatief, de methanotrofische koper-acquisitie peptiden methanobactin (MB)10,het therapeutischepotentieel vertonen door hun hoge binding affiniteit voor cu (I)12. Toen de methanobactin (MB-OB3b) uit Methylosinus trichosporium OB3b werd bestudeerd in een diermodel van de ziekte van Wilson, werd koper efficiënt uit de lever gehaald en uitgescheiden via de gal13. In vitro experimenten bevestigd dat MB-OB3b het koper kan cheleren uit de koper metallothioneïneproductie opgenomen in de lever cytosol13. Laser ablatie inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie beeldvormende technieken hebben de ruimtelijke verdeling van koper in de ziekte van Wilson lever monsters14,15,16 onderzocht en aangetoond dat MB-OB3b verwijdert het koper met korte behandelingsperioden van slechts 8 dagen17.

De MB-OB3b zal ook binden aan andere metaalionen, waaronder AG (I), au (III), PB (II), MN (II), Co (II), Fe (II), ni (II) en Zn (II)18,19. Competitie voor de fysiologische cu (I) binding site wordt tentoongesteld door AG (I) omdat het cu (I) kan verdringen van het MB-OB3b complex, met zowel AG (I) en ni (II) ook tonen onomkeerbare binding aan MB die niet kan worden verplaatst door cu (I)19. Onlangs is een reeks alternatieve methanobactin (amb) oligopeptides met het 2his-2cys binding motief onderzocht20,21, en hun Zn (II) en cu (I/II) binding eigenschappen gekarakteriseerd. Hun primaire aminozuur sequenties zijn vergelijkbaar, en ze bevatten allemaal de 2His-2Cys motief, Pro en een geacetseerd N-Terminus. Ze verschillen voornamelijk van MB-OB3b omdat het 2His-2Cys motief de twee enethiol oxazolone binding sites van MB-OB3b vervangt.

Elektro spray-ionisatie in combinatie met ionen mobiliteit-massaspectrometrie (ESI-IM-MS) voorziet in een krachtige instrumentale techniek voor het bepalen van de metaal bindende eigenschappen van peptiden omdat het hun massa-tot-lading (m/z) en botsing doorsnede (CCS) terwijl de massa, lading en conformatie vorm van de oplossingsfase behouden blijven. De m/z en CCS hebben betrekking op de peptiden stoichiometrie, protonatie toestand en conformationale vorm. Stoichiometrie wordt bepaald omdat de identiteit en het nummer van elk element dat aanwezig is in de soort expliciet worden geïdentificeerd. De totale lading van het peptide complex heeft betrekking op de protonatie toestand van de zure en fundamentele plaatsen en de oxidatietoestand van het metaal ion (s). De CCS geeft informatie over de conformationele vorm van het peptide complex, omdat het de rotatie gemiddelde grootte meet die betrekking heeft op de tertiaire structuur van het complex. De totale laadtoestand van het complex is ook een functie van pH en beïnvloedt de metaalionen binding van de peptide, omdat de gedeprotoneerde basis-of zure plaatsen zoals de carboxyl, his, CYS en Tyr ook de potentiële bindingsplaatsen voor het metaal-ion zijn. Voor de analyses worden de peptide en het metaal ion bereid in waterige oplossingen met de pH aangepast door verdund waterig azijnzuur of ammoniumhydroxide. Hierdoor kan de pH-afhankelijkheid en de selectiviteit van de metaalionen worden bepaald voor de peptide. Bovendien kunnen de m/z en CCS bepaald door ESI-im-MS worden gebruikt met B3LYP/LanL2DZ moleculaire modellering om het type van de metaalionen coördinatie en tertiaire structuur van het complex te ontdekken. De resultaten in dit artikel laten zien hoe ESI-IM-MS de selectieve chelerende werking van een set amb peptiden kan karakteriseren en vergelijken met de koper bindende peptide MB-OB3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van de reagentia

  1. Cultuur methylosinus trichosporium OB3b, Isoleer de Cu (I)-gratis MB-OB3b18,22,23, Vries droog het monster en bewaar bij-80 °c tot gebruik.
  2. Synthetiseren van de amb peptiden (> 98% zuiverheid voor amb1, amb2, amb4; > 70% zuiverheid voor amb7), vriesdrogen de monsters, en bewaar ze bij-80 °c tot gebruik.
  3. Aankoop > 98% zuiverheid mangaan (II) chloride, kobalt (II) chloride, nickle (II) chloride, koper (II) chloride, koper (II) nitraat, zilver (I) nitraat, zink (II) chloride, ijzer (III) chloride en lood (II) chloride.
  4. De poly-DL-alanine polymeren die worden gebruikt als kalibrantia voor het meten van de botsing doorsneden van de amb-soorten en HPLC-kwaliteit of hoger ammoniumhydroxide, ijsazijn en acetonitril kopen.

2. bereiding van de stamoplossing

  1. Peptide Stock Solution
    1. Weeg nauwkeurig, met behulp van ten minste drie significante cijfers, de massa van 10,0 – 20,0 mg van de MB-OB3b of amb in een plastic Injectieflacon van 1,7 mL.
      Opmerking: de gewogen massa moet 12,5 mM of 1,25 mM opleveren, afhankelijk van de oplosbaarheid van de peptide, wanneer 1,00 mL gedeïoniseerd (DI) water wordt toegevoegd.
    2. Voeg met behulp van een pipet 1,00 mL gedeïoniseerd water (> 17,8 MΩ cm) toe aan het gewogen peptide monster om de oplossing van 12,5 mM of 1,25 mM te leveren. Plaats de dop stevig en meng grondig met minstens 20 inversies.
    3. Met behulp van een micropipet dosering 50,0 μL aliquots uit het peptide monster in individueel gelabelde injectieflacons van 1,5 mL en bewaren ze bij-80 °C tot gebruik.
  2. Metalen Ion stockoplossingen
    1. Weeg nauwkeurig, met ten minste drie significante cijfers, de massa van 10,0 – 30,0 mg metaal chloride of zilvernitraat in een Injectieflacon van 1,7 mL.
      Opmerking: de gewogen massa moet 125 mM opleveren wanneer 1,00 mL DI water wordt toegevoegd.
    2. Voeg de 1,00 mL DI water toe aan het gewogen metalen monster in de Injectieflacon van 1,7 mL om de 125 mM oplossing te leveren. Plaats de dop stevig en meng grondig met minstens 20 inversies.
  3. Ammonium hydroxide stockoplossingen: bereid een 1,0 M azijnzuur oplossing door het verdunnen van 57 μL van de 99,5% azijnzuur oplossing met di water tot een eindvolume van 1,00 ml. Bereid een ammoniumhydroxideoplossing van 1,0 M door 90 μL van de 21% ammoniumhydroxideoplossing met DI water te verdunnen tot een eindvolume van 1,00 mL. Maak twee opeenvolgende verdunningen van elke oplossing door 100 μL van de 1,0 M-oplossingen te nemen om 0,10 M en 0,010 M azijnzuur en ammoniumhydroxide-oplossingen te bereiden.
  4. Poly-DL-alanine Stock Solution: bereid de poly-DL-ALANINE (PA) door weging 1,0 mg pa en oplossen in 1,0 ml di water te geven 1.000 ppm. Meng. Verdeel met behulp van een micropipet 50,0 μL aliquots en plaats ze in een Injectieflacon van 1,7 mL en bewaar bij-80 °C.

3. elektro spray-Ion mobiliteit-massaspectrometrie analyse

  1. Reinig de ingangs slang en naald capillair van de ESI grondig met ongeveer 500 μL van 0,1 M ijsazijn, 0,1 M ammoniumhydroxide en ten slotte DI water.
  2. Ontdooi een aliquot van 50,0 μL van de 1.000 ppm PA-stamoplossing en Verdun deze met 450 μL DI-water om een 100 ppm PA te geven. Pipet 100,0 μL van deze oplossing en Verdun deze tot 1,00 mL met 500 μL DI-water en 500 μL acetonitril om 10 ppm PA-oplossing te geven.
  3. Verzamel de negatieve en positieve Ion IM-MS spectra van de 10 ppm PA oplossing voor 10 min elk met behulp van native ESI-IM-MS voorwaarden zoals beschreven in de sectie discussie.
  4. Ontdooi een aliquot van 50,0 μL van de amb-stamoplossing van 12,5 mM of 1,25 mM en maak opeenvolgende verdunningen met DI-water om een eindconcentratie van 0,125 mM amb te geven. Meng elke verdunning grondig.
  5. Pipet 100,0 μL van de 125 mM metalen Ion stockoplossing, plaats in een Injectieflacon van 1,7 mL en Verdun tot 1,00 mL met DI water om 12,5 mM metaal ion te geven. Herhaal dit met twee opeenvolgende verdunningen om een uiteindelijke metaalionen concentratie van 0,125 mM te geven. Meng elke verdunning grondig.
  6. Pipet 200,0 μL van de 0,125 mM amb in een Injectieflacon van 1,7 mL, Verdun met 500 μL DI-water en meng de oplossing grondig.
  7. Stel de pH van het monster in op 3,0 door toevoeging van 50 μL 1,0 M azijnzuur oplossing.
  8. Voeg 200,0 μL van het metalen Ion van 0,125 mM toe aan het pH-gecorrigeerde monster. Voeg DI water toe om een eindvolume van 1,00 mL van het monster te geven, meng grondig en laat het monster 10 minuten op RT laten equilibraten.
  9. Neem met een stompe neus spuit 500 μL van het monster en verzamel de negatieve en positieve Ion ES-IM-MS Spectra gedurende 5 min. Gebruik de resterende 500 μL van het monster om de uiteindelijke pH op te nemen met een gekalibreerde micro-pH-elektrode.
  10. Herhaal de stappen 3.6 – 3.9 en pas stap 3,7 aan om de pH te wijzigen in 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 of 10,0 door nieuwe volumes van de 0,010 M, 0,10 M, of 1,0 M azijnzuur of ammoniumhydroxide oplossingen toe te voegen.
  11. Verzamel de negatieve en positieve ionen ESI-IM-MS spectra van de 10 ppm PA-oplossing gedurende 10 minuten per stuk.

4. bereiding van de metaaliontitratie van amb-monsters

  1. Volg de stappen die worden beschreven in stappen 3.1 – 3.5.
  2. Pipet 200,0 μL van de 0,125 mM amb in een Injectieflacon van 1,7 mL, Verdun met 500,0 μL DI-water en meng de oplossing grondig.
  3. Stel de pH van het monster in op pH = 9,0 door toevoeging van 80 μL van de 0,010 M ammoniumhydroxideoplossing.
  4. Voeg 28 μL van de 0,125 mM metalen Ion-oplossing toe om 0,14 molaire equivalenten van het metaal ion te geven, voeg DI water toe om het eindvolume van het monster 1,00 mL te maken, meng grondig en laat het monster 10 minuten op RT laten equilibreren.
  5. Gebruik een stompe neus spuit 500 μL van het monster en verzamel de negatieve en positieve Ion ESI-IM-MS Spectra gedurende 5 min elk. Gebruik de resterende 500 μL van het monster om de uiteindelijke pH op te nemen met een gekalibreerde micro-pH-elektrode.
  6. Herhaal de stappen 4.2 – 4.5 en wijzig stap 4,3 om een geschikt volume van de 0,125 mM metaal-ion-oplossing toe te voegen om 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 of 1,40 molaire equivalenten te geven.
  7. Verzamel de negatieve en positieve ionen IM-MS spectra van de 10 ppm PA-oplossing gedurende 10 minuten per stuk.

5. analyse van de gegevens van de ESI-IM-MS pH-titratie

  1. Uit de IM-MS-Spectra bepalen welke geladen soorten amb's aanwezig zijn door ze te matchen met hun theoretische m/z-isotoop patronen.
    1. Open MassLynx en klik op chromatogram om het chromatogram venster te openen.
    2. Ga naar het menu bestand en Open om het im-MS-gegevensbestand te zoeken en te openen.
    3. Pak het IM-MS-spectrum uit door met de rechtermuisknop te klikken en over het chromatogram te slepen en los te laten. Het spectrum venster wordt geopend en toont het spectrum van de IM-MS.
    4. In het spectrum venster, klik op gereedschap en isotoop model. In het venster isotoop modellering voert u de molecuulformule van de amb-soort in, controleert u het vakje opgeladen Ion weergeven en voert u de laadstatus in. Klik op OK.
    5. Herhaal dit om alle soorten in het IM-MS-spectrum te identificeren en hun m/z-isotopen bereik op te nemen.
  2. Voor elke amb-soort, scheid eventuele toevallige m/z-soorten en extraheer hun aankomsttijd verdelingen (ATD) met behulp van hun m/z-isotoop patronen om ze te identificeren.
    1. In MassLynx klikt u op de Driftscope om het programma te openen. Klik in DriftScope op bestand en Open om het im-MS-gegevensbestand te zoeken en te openen.
    2. Gebruik de muis en klik met de linkermuisknop om in te zoomen op het m/z-isotoop patroon van de amb-soort.
    3. Gebruik het gereedschap selecteren en de linker muisknop om het isotoop patroon te selecteren. Klik op de knop huidige selectie accepteren .
    4. Om eventuele toevallige m/z-soorten te scheiden gebruikt u het gereedschap selecteren en de linkermuisknop om de ATD-tijd te selecteren die is uitgelijnd met het isotoop patroon van de amb-soort. Klik op de knop huidige selectie accepteren .
    5. Als u de ATD wilt exporteren, gaat u naar bestand | Exporteer naar MassLynxen selecteer vervolgens drift tijd behouden en bestand opslaan in de juiste map.
  3. Bepaal het zwaartepunt van de ATD en Integreer het gebied onder de ATD-curve als een maat voor de populatie van de soorten.
    1. Open het opgeslagen geëxporteerde bestand in het chromatogram venster van MassLynx. Klik op proces | Integreer in het menu. Vink het selectievakje ApexTrack Peak Integration aan en klik op OK.
    2. Noteer het zwaartepunt ATD (ta) en het geïntegreerde gebied zoals weergegeven in het chromatogram venster. Herhaal dit voor alle opgeslagen amb-en PA IM-MS-gegevensbestanden.
  4. Gebruik de geïntegreerde ATD voor alle geëxtraheerde amb-soorten van ofwel de positieve of negatieve ionen op elk titratie punt om te normaliseren naar een relatieve percentage schaal.
    1. Betreed de identiteit van de amb-soorten en hun geïntegreerde ATD bij elke pH in een spreadsheet.
    2. Gebruik voor elke pH de som van de geïntegreerde Atd's om de ATD van het individuele amb te normaliseren tot een percentage schaal.
    3. Plot de procentuele intensiteiten van elke amb-soort versus pH in een grafiek om te laten zien hoe de populatie van elke soort varieert als een functie van pH.

6. doorsneden door botsingen

  1. Converteer met behulp van een spreadsheet de CCSS (ω) van PA Negative25,26 en positieve27 ionen gemeten in buffergas28 om CCS (ωc) te corrigeren met behulp van vergelijking 1 hieronder, waarbij: z = Ion charge; e c = elektronen lading (1.602 × 10-19 c); m N 2 = massa van N2 gas (da); en mIon = ionen massa. 29

Equation 1

  1. Zet de gemiddelde aankomsttijden (tA) van de PA-kalibranten en de amb-soorten om in drift tijden (tD) met behulp van vergelijking 2 hieronder, waarbij: c = de vertragings coëfficiënt met verbeterde Duty Cycle (1,41) en m/z is de massa-aan-lading van het peptide-ion.

Equation 2

  1. Plot de PA-kalibrantia ' tD vs. hun Ωc. Vervolgens, met behulp van een regressie van de kleinste kwadraten van vergelijking 3 hieronder weergegeven, bepaal de a ' en B waarden, waarbij: a ' is de correctie voor de temperatuur, druk, en elektrische veld parameters; en B compenseert het niet-lineaire effect van het IM-apparaat.

Equation 3

  1. Met behulp van deze A ' en B waarden en de centroïde tD waarde van de ATD van de ambs bepalen hun ωc met behulp van vergelijking 3 en hun ω met behulp van vergelijking 1. Deze methode biedt CCSS voor de peptide soorten met geschatte absolute fouten van ongeveer 2%25,26,27.

7. computationele methoden

  1. Gebruik de B3LYP/LanL2DZ niveau van theorie, bestaande uit de becke 3-parameter Hybrid functionals30 en de Dunning basis set31 en elektron Core mogelijkheden32,33,34 te lokaliseren geometrie-geoptimaliseerde conformatoren voor alle mogelijke soorten coordinaties van de waargenomen m/z amb-soorten35.
    Opmerking: voor meer informatie over het bouwen en verzenden van berekeningen verwijzen naar de GaussView gebruik in het aanvullende bestand.
  2. Vergelijk de voorspelde vrije energie van elk van de conformers en bereken hun theoretische CCSs met behulp van de Ion-geschaalde Lennard-Jones (LJ)-methode uit het Sigma-programma36.
  3. Van de laagste vrije energie-conformers bepalen welke conformer de LJ CCS vertoont die instemt met de IM-MS gemeten CCS om de tertiaire structuur en het type van de coördinatie voor de in het experiment waargenomen conformatoren te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metalen binding van amb1
De IM-MS studie20 van amb1 (Figuur 1A) toonde aan dat zowel koper-als zink ionen gebonden aan amb1 in een pH-afhankelijke manier (Figuur 2). Echter, koper en zink gebonden aan amb1 door middel van verschillende reactiemechanismen op verschillende coördinatie-sites. Bijvoorbeeld, het toevoegen van Cu (II) aan amb1 resulteerde in oxidatie van amb1 (amb1ox) door bisulfide brug vorming, en bij een pH van > 6, de [amb1ox− 3H + cu (II)] Ion (Figuur 2a) werd gevormd. Dit gaf de deprotonatie van twee imidazoliums, carboxylgroep en twee extra sites aan die de coördinatie cu (II) waren.

Moleculaire modellering van de [amb1ox− 3H + cu (II)] Ion met behulp van B3LYP/LanL2DZ bepaald het laagste energie complex was cu (II) gecoördineerd via de imidazol δn van zijn1 en de gedeprotoneerde nitrogenen van de backbone amide groepen van CYS2 en Gly3. Echter, onder een pH van 6, het toevoegen van Cu (II) aan amb1 vormde een m/z-isotoop patroon dat alleen kan worden verwerkt door cu (i) binding, de vorming van de [amb1ox+ cu (i)]+ Ion (Figuur 2B). Daarentegen veroorzaakte een pH hoger dan 6 het m/z -isotoop patroon om 1 m/z te verlagen, goed voor de positieve geladen [amb1ox− H + cu (II)]+ ion. Het toevoegen van Zn (II) was niet oxideren amb1, en Zn (II) binding werd waargenomen bij een pH van > 6, voornamelijk de vorming van de [amb1− 3H + Zn (II)] Ion (Figuur 2C). Dit gaf de deprotonatie van de imidazoliums, thiol en carboxylgroepen aan. Moleculaire modellering van de [amb1− 3H + Zn (II)] Ion bepaald de laagste energie-conformers om ofwel tetrahedrale Zn (II) coördinatie via 2His-2Cys of zijn-2cys en het carboxylaat van het C-Terminus.

Meervoudige cu (I) binding van amb2
De redoxreacties tussen cu (II) en amb2 (Figuur 1B) resulteerden in Cu (I) binding. Dit werd bestudeerd in meer detail met behulp van IM-MS, UV-VIS spectrofotometrie, en B3LYP moleculaire modellering37. De belangrijkste producten van de Cu (II) titratie van amb2 bij een pH van 5 waren amb2 oxidatie (door middel van bisulfide brug vorming) en de niet-geoxideerde amb2 soorten die drie cu (I)-ionen coördineren.

Een zoekopdracht met behulp van de methode B3LYP/LanL2DZ ligt op twee laagenergetische complexen die strijden voor de 3cu (I) gecoördineerde soorten. De eerste was het complex getoond in Figuur 3A, waar de 3cu (I) ionen werden gecoördineerd via de overbruggings thiolaat groepen38 van CYS2 en CYS6 (van zijn1), evenals δn1 en δn5 (van zijn5 ). Het tweede complex (3c) heeft een zoutbrug tussen de geprotoneerde zijn1 zijgroep en C-terminale carboxylaat groep. Deze resultaten suggereren dat bij een pH van 3,0 – 6,0, het belangrijkste amb2+ 3cu (I) complex de zoutoverbrugde structuur is, die met succes kan worden overgebracht van oplossing naar gasfase met slechts minimale structurele herschikking.

De theoretische LJ CCS van 209 ± 6 Å2, berekend met behulp van het Sigma-programma36 voor complexe 3c, overeengekomen met de im-MS gemeten CCS, wat aangeeft dat 3c staat voor [amb2− 2H + 3cu (I)]+ conformatie bij pH 3.0-6.0. Echter, bij een pH van > 6, dit complex werd niet waargenomen door IM-MS, waarschijnlijk omdat verdere deprotonatie van zijn1 (pKa= 6,0) resulteert in een algemeen neutraal complex. Zodra de imidazoleum groep van zijn1 gedeprotoneerd is, kan 3cu (I) coördinatie worden omgezet in de overbruggings thiosaat groepen van CYS2 en CYS6 , alsmede δn1 en δn5 van zijn1 en zijn5, respectievelijk (3a).

De pH-afhankelijkheid van amb4 cu (I/II)-binding en redox-activiteit
De im-MS-en B3LYP-technieken zijn gebruikt om de Cu (II) en pH-titraties van amb4 (Figuur 1C) te onderzoeken en geïdentificeerde monomeer-, dimer-, Trimer-en tetrameer complexen van amb4 met maximaal drie cu (I)-ionen of twee cu (II ) ionen voor elke monomeer subeenheid39. De complexen bevatten ook verschillende aantallen bisulfide bruggen, en deze producten werden geproduceerd of de Cu (II) Reacties met amb4 werden uitgevoerd in anaerobe of aërobe waterige oplossingen.

Met behulp van de IM-MS-techniek werd aangetoond dat deze individuele soorten konden worden gescheiden en gekwantificeerd, zelfs als ze overlappende isotopen patronen hadden vanwege verschillen in hun aankomsttijd (Figuur 4). De identificatie en kwantificering van deze nauw verwante soorten is een taak die geen enkele andere instrumentale of analytische techniek kan bereiken. Deze im-MS-onderzoeken bieden een aanzienlijk inzicht in de pH-afhankelijke redox-reacties en identificeren exact de aantallen inter-of intra-moleculaire bisulfide-bruggen, het aantal cu (I) of cu (II)-ionen en het aantal deprotonatie-locaties in elk van de complexen ( Figuur 5).

Bovendien kon het meten van de complexen CCS ook de bepaling van elk van de individuele soorten conformationale grootte, die werd gebruikt met een uitgebreide B3LYP/LanL2DZ zoeken om conformers te lokaliseren met structuren die waren overeengekomen met zowel de juiste moleculaire Stoichiometrie en CCS gemeten door IM-MS. Via deze methode werden de Cu (I/II) coördinatie van de verschillende complexen geïdentificeerd. De reacties tussen cu (II) en amb4 omvatte de vorming van dimers, trimers en tetramers die ofwel cu (I) of cu (II) coördineren, afhankelijk van de pH van de oplossing.

In oplossingen die bijvoorbeeld mild zuur waren (pH = 3,0 – 6,0), waren ze primair gebonden aan cu (I)-ionen en werden ze niet geoxideerd, terwijl ze in oplossingen die enigszins basisch waren (pH = 8,0 – 11.0) voornamelijk cu (II)-ionen bonden en werden geoxideerd door alle CYS die bisulfide vormden obligaties (Figuur 6). De B3LYP/LanL2DZ bepaalden dat de Cu (I)-ionen lineair waren en overbrugd werden door de thiolaat-en imidazol-groepen, terwijl de Cu (II)-ionen werden gecheleerd via vervormde T-vormige of vierkante planaire geometrieën door een imidazol, evenals de gedeprotoneerde backbone-nitrogenen van amide groepen.

IM-MS analyse van MB-OB3b
De im-MS studies19,40 van MB-OB3b (Figuur 1D) toonde aan dat in de gasfase, Cu (I)-vrije MB-OB3b bestaat als drie negatief geladen soorten: [MB-OB3b – H], [MB-OB3b – 2H]2 –, en [MB-OB3b – 3H] 3 –consistent met het verwachte oplossingsfase gedrag. Er werden individuele metalen iontitraties uitgevoerd19 om de selectiviteit van de metaalionen van MB-OB3b te bepalen. Figuur 7 toont de resultaten van de geselecteerde metaaliontitraties en toont aan dat de schijnbare bindende selectiviteit van MB-OB3b kan worden gecategoriseerd als drie grote groepen: 1) Cu (i) en AG (i); 2) ni (II), Zn (II) en Co (II); en 3) PB (II), Fe (II) en mn (II). Deze volgorde van bindende selectiviteit bleek in algemene overeenstemming te zijn met die gevonden door fluorescentie afschrikken experimenten19 en isothermische titratie calorimetrie18.

Vergelijking van MB-OB3b en amb 7 metaalbinding selectiviteit
De schijnbare bindende selectiviteit van MB-OB3b werd vergeleken met de bindende selectiviteit van amb7 bij een pH van 7. De amb7 is ontworpen met dezelfde aminozuursequentie als MB-OB3b, maar met de twee enethiol oxazolone groepen vervangen door twee zijn-CYS groepen. De amb7 (Figuur 1E) heeft een enkele bisulfide binding tussen CYS6 en CYS12. De resultaten van de vorming van negatief geladen complexen (Figuur 8) toonden aan dat amb7 Preferred binding selectiviteit voor ni (II) en Zn (II) (60%), gevolgd door Co (II) en PB (II) (40%). Bovendien was er ongeveer 20% cu (II) binding. Er was ofwel trace of geen amb7 binding van AG (I), MN (II), of Fe (II). Dit vergeleken met MB-OB3b's Preferred binding selectiviteit van meer dan 90% voor cu (I) en AG (I) binding.

Figure 1
Figuur 1: primaire structuren van de alternatieve methanobactin (amb) en methanobactin (MB-OB3b) peptiden. (A) acetyl-zijn1-CYS2-Gly3-Pro4-zijn5-CYS6 (amb1); (B) acetyl-zijn1-CYS2-Tyr3-Pro4-zijn5-CYS6 (amb2); C) acetyl-zijn1-CYS2-Gly3-ser4-Tyr5-Pro6-zijn7-CYS8-ser9 (amb4); (D) 1-(N-[mercapto-(5-Oxo-2-(3-methylbutanoyl) oxazol-(Z),-ylidene) methyl]-Gly1– ser2– CYS3– Tyr 4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-Oxo-oxazol-(Z)4Een-ylidene] methyl) – ser5 – CYS6– met7 (MB-OB3b); en (E) acetyl-Leu1-zijn2-CYS3-Gly4-ser5-CYS6-Tyr7-Pro8-zijn9-CYS10-ser11-CYS12-met 13 (amb7). Arcering toont de: 2His-2Cys of enethiol-oxazolone binding sites (Icon); Proline of Pyrrolidine scharnieren (Icon); acetyl-of methylbutanol groep N-TerminusIcon(); en tyrosine, die kan stabiliseren van de metaalionen coördinatie via een tweede Solvatatie shell π-cationIconinteractie (). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: gemiddelde relatieve intensiteiten van de alternatieve methanobactin (amb1) acetyl-zijn1-CYS2-Gly3-Pro 4-zijn5-CYS6 en Metal-gebonden complex (amb1+X) (waar X = cu of Zn). Waarnemingen werden gedaan tijdens negatieve en positieve ionen massaspectrometrie analyses van 1:1 molaire ratio-oplossing van amb:Xcl2 over het pH-bereik van 3,0 – 11.0. Foutbalken tonen standaarddeviaties van de gemiddelden van zowel de relatieve intensiteit als de pH van drie replicaatstitratie-experimenten. De 1:1 molaire oplossing van amb: cucl2 resulteerde in de oxidatie van amb (ambOx) met CYS2 en CYS6, de vorming van een bisulfide brug. A) negatieve ionen analyse van amb: cucl2 die [ambOx− H] en [ambOx− 3H + cu (II)]weergeeft. B) positieve ionen analyse van amb: cucl2 met [ambOx]+ en [ambOx+ cu (I/II)]+; de oxidatietoestand van cu in het complex was pH-afhankelijk, zijnde [ambOx+ cu (I)]+;  onder een pH van 8 en [ambOx− H + cu (II)]+; boven een pH van 8. C) negatieve ionen analyse van amb: zncl2 die [amb]n − en [amb + Zn (II)]n −weergeeft. D) positieve ionen analyse van amb: zncl2 die [amb]n + en [amb + Zn (II)]n +weergeeft. Dit cijfer is aangepast uit een eerdere publicatie20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: voorgestelde structuren van [amb2+ 3cu (I)]+ met behulp van de laagste energie-en geometrie-geoptimaliseerde structuren die zich in het B3LYP/LanL2DZ niveau van de theorie bevinden. A) 3 Cu (I) coördinatie via δn1δn5 van zijn1 en zijn5 en thiolaat bruggen thiosaat groepen van CYS2 en CYS6 met een theoretische dwarsdoorsnede van 217 ± 6 Å2. B) illustratie van de coördinatie δn1δn5 en thiolaat bruggen. C) met zout overbrugde structuur met de 3 Cu (I)-coördinatie via de carboxylaatterminal (CYS6), δn5en thiolaat-bridging met een theoretische dwarsdoorsnede van 209 ± 6 Å2. D) de afbeelding van de carboxylaatterminal, δn5, en thiolaatbrug coördinatie. Verlijmings afstanden A, B, C, D, E en F worden weergegeven in de eenheid van Å. Dit cijfer is aangepast uit een eerdere publicatie37. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: IM-MS analyse van producten van het 1:1 mengsel van amb4: cu (II) bij pH = 4,4.  A) onttrokken isotoop patronen voor de [amb4− 2H + 3cu (i)]+, [Diamb4− 4h + 6cu (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9cu (I)]3 + en [tetraamb4− 8h + 12cu (i)]4 + soorten. B) integratie van de geëxtraheerde aankomsttijden van [amb4− 2H + 3cu (i)]+, [Diamb4− 4h + 6cu (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9cu (i)]3 + en [tetraamb4− 8h + 12cu (i)]4 + werden gebruikt om hun relatieve intensiteiten te berekenen. Om de relatieve intensiteiten van het percentage te berekenen, werd de som van het geïntegreerde gebied voor alle geëxtraheerde soorten voor elk titratie punt gebruikt om de percentage schaal te normaliseren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: wijzigen van het isotoop patroon voor afzonderlijk cu (I/II) gebonden amb4 waargenomen tijdens de pH-titratie van molaire equivalenten van Cu (II): amb4 bij ph = 4,04, 6,02 en 9,98. Bij pH = 4,04 komt het experimentele resultaat voornamelijk overeen met het isotoop model voor [amb4+ cu (I)]+. Bij pH = 6,02 is er een verschuiving van-2 m/z, wat de vorming van de bisulfide brug aangeeft (weergegeven als oxidatie van amb4ox) en een overeenkomst met het isotoop patroon voor [amb4ox+ cu (I)]+. Bij pH = 9,98 is er een verdere verschuiving van-1 m/z, betekent cu (II) binding en het verwijderen van een proton om de + 1 laadtoestand te behouden, die vervolgens overeenkomt met het isotoop patroon voor [amb4ox− H + cu (II)]+. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: veranderende relatieve intensiteit van de identiteit van de Cu (I/II) complexen van het monomeer, dimeer en trimeer van amb4 over een pH-bereik van 3,0 – 11.0.  A) monomeer met één cu (i/II) ion, (B) dimeer met 2 Cu (i/II)-ionen, en (C) trimeer met 3 Cu (i/II)-ionen. De bijschriften noteren hoeveel bisulfide obligaties aanwezig waren in het complex. Dit cijfer is aangepast uit een eerdere publicatie39. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: percentage van de vorming van de complexen cu (i), AG (i), Zn (II), ni (II), Co (II), MN (II), PB (II), of Fe (II) van methanobactin. Waargenomen tijdens de individuele metaaliontitraties van methanobactin. Opgemerkt moet worden dat cu (I) binding het gevolg is van de toevoeging van Cu (II) en Fe (II) binding aan de toevoeging van Fe (III). Dit cijfer is aangepast uit een eerdere publicatie19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: vergelijking van het percentage cu (i/II), AG (i), Zn (II), ni (II), Co (II), MN (II), PB (II), of Fe (II) chelatie door MB-OB3b en amb7 bij pH = 7. De vergelijking is voor de vorming van negatief geladen ionen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary File
Aanvullend bestand. GaussView gebruik. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritieke stappen: behouden oplossingsfase gedrag voor onderzoek via ESI-im-MS
Native ESI instrumentale instellingen moeten worden gebruikt die behoud van de peptiden stoichiometrie, Charge State, en conformationele structuur. Voor inheemse omstandigheden moeten de omstandigheden in de ESI-bron, zoals de kegel spanningen, temperaturen en gasstromen, worden geoptimaliseerd. Ook moeten de druk en spanningen in de bron, val, Ion mobiliteit en overdracht reizen golven (vooral de DC-trap bias die de injectie spanning in de IM-cel regelt) worden gecontroleerd op hun invloeden op de charge-State en Ion Mobility distributies.

Hier volgen de typische bedrijfsomstandigheden die in dit werk zijn gebruikt. De waterige peptide monsters werden geïnjecteerd met behulp van een stompe neus 1,0 mL spuit met behulp van een 10 μL min− 1 debiet, 2,0 kV capillaire spanning voor positieve ionen (+) of − 1,8 KV voor negatieve ionen (-), 130 °c bron temperatuur, 250 °c desolvation, 20 V monstername kegel, en 4,0 V extractie kegel. De IM-sectie werd bediend met 6,0 V ingangsspanning aan de overvulcel met een argon druk van 2,25 x 10− 2 mbar met behulp van een 1,5 ml/min stroomsnelheid. De spanning voor het injecteren van ionen (trap DC bias) in de IM cel werd ingesteld op 12 V om dissociatie van ionen te voorkomen, omdat ze aanvankelijk in botsing met de stikstof buffer gas. De IM-cel gescheiden ionen op basis van hun lading en botsing doorsnede en gebruikt een 0,52 mbar stikstof druk en 20,0 mL min− 1 debiet. De im werd bediend met opvoerden 12.0 – 20.0 v (+) of 8.0 – 30.0 v (−) reizende Golf hoogtes en ongebreide 800 – 1500 m s− 1 (+) of 250 – 1000 m s− 1 (−) snelheden voor elke sweep door de cel van de im reizende Golf. De transfercel werd bediend met dezelfde argon druk als de overvulcel en leidde de IM opgeloste ionen naar de orthogonale tijd-van-vlieg massa-to-charge Analyzer. De ionen mobiliteit-massa Spectra werden verworven door het synchroniseren van de gated afgifte van ionen in de IM-cel met de tijd-van-Flight massa-to-charge Analyzer.

Met behulp van native ESI-condities worden oplossingsfase-eigenschappen, zoals de laadtoestand en conformationele State, tijdens de im-MS-analyses behouden. Bijvoorbeeld, de charge toestanden van MB-OB3b en ambs waargenomen tijdens im-MS-analyses20,37 waren nauw verwant aan de charge toestanden verwacht in de oplossingsfase40. De MB-OB3b peptide is tetraprotic en vormt alleen negatief geladen ionen tijdens IM-MS analyse40, hetzij cu (i)-gebonden of cu (i)-vrij, omdat het de C-Terminus bevat (pka < 1,7), twee enethiol oxazolone groepen (pka = 5,0 en 9,7), en Tyr groep (pKa = 11,0)42. De ambs in hun volledig geprotoneerde vorm zal een totale lading van + 2 hebben vanwege de C-Terminus (pka ≈ 2), twee zijn (pka = 6,0), twee CYS (pka = 8,3), en Tyr (pka = 11,0) sites19,41. Zo vormen ze in het algemeen positief geladen ionen bij een pH van < 6 en negatief geladen ionen met een pH van > 6.

De ambs toonde ook duidelijke pH-afhankelijke cu (I/II) binding gedrag en redox activiteit waarbij cu (I)-binding bij een lage pH-overgang naar cu (II) binding bij een hogere pH. De Cu (i/II) Reacties omvatte het vormen van de geoxideerde amb-soort (ambOx) die bisulfide bindingen bevatte en verschillende multimers en meervoudige cu (i/II) binding (Figuur 5 en Figuur 6). Deze redoxreacties zijn afhankelijk van de tijd en er werd aangetoond dat hoe langer het tijdsinterval (tot 210 min) tussen monstervoorbereiding en IM-MS analyseert de meer geoxideerde producten werden waargenomen37. Daarom is ook een zorgvuldige afweging van de reactietijd afhankelijkheid van de observatie van producten vereist.

Beperkingen: IM-MS en theoretische botsing dwarsdoorsneden identificeren welk type van coördinatie elk metaal ion verkiest
Om de IM-MS m/z-en CCS-gegevens te helpen interpreteren, werd een uitgebreide zoekopdracht uitgevoerd met behulp van het B3LYP/LanL2DZ-niveau van de theorie. Geometrie-geoptimaliseerde conformatoren met verschillende coördinatie-locaties werden vergeleken tussen hun voorspelde vrije energie en overeenstemming met de CCS gemeten door IM-MS. moleculaire modellering van deze peptiden en hun complexen wordt beperkt door het type elektronische structuur berekeningen die kunnen worden toegepast op deze relatief grote systemen. Andere methoden die zijn bestudeerd of aanbevolen omvatten werk van Truhlar et al.43, die vond dat M05-2x was de beste DFT FUNCTIONEEL en PM7 en MNDO/d waren goede nddo Semi-empirische methoden voor Zn (II)-bevattende verbindingen44. Deze peptiden hebben een grote conformationele ruimte en grondig onderzoek naar de laagste energie conformers moet omvatten het vergelijken van de verschillende metalen chelatie sites, verschillende CIS-en trans-peptide obligaties, zout bruggen, waterstof binding, en π-cation interactie tussen de aromatische Tyr-kant groep en de metalen catie.

Significantie met betrekking tot bestaande methoden: cu (I/II) en andere geselecteerde metaalionen binding in vergelijking tussen MB-OB3b en ambs
Röntgen kristallografie en NMR-spectroscopie zijn de meest gebruikte technieken voor het bepalen van de atoom resolutie van de tertiaire structuur van peptiden. Echter, Röntgen kristallografie studies van metallopeptides zijn schaars als gevolg van problemen met de kristallisatie van deze complexen45. NMR is ook niet geschikt voor de interpretatie van een monster waarbij nauw verwante individuele oligopeptide soorten aanwezig zijn46. Daarom zijn im-MS en DFT moleculaire modellering alternatieve technieken voor het bestuderen van peptide reacties, vooral die welke voortvloeien uit complexe redox en cu (I/II)-bindende reacties20,37,40, 47. de sterkte van im-MS is dat het elk van de producten kan oplossen en hun moleculaire samenstelling identificeren door tegelijkertijd hun m/z-en aankomsttijden te meten die betrekking hebben op de stoichiometrie, protonatie toestand en conformationele structuur.

De MB-OB3b zal bijvoorbeeld een verscheidenheid aan metaalionen cheleren, en de selectiviteit ervan naar elk Ion werd weergegeven door de IM-MS Metal-iontitraties (Figuur 7). De resultaten toonden de voorkeur MB-OB3b voor binding cu (I) en AG (I), terwijl het vergelijken van de resultaten bij een pH van 7 met amb7. Afbeelding 8 toont amb7 preferentieel cheleert Zn (II) en ni (II). In het algemeen toonden de amb-onderzoeken aan dat het vervangen van de twee enethiol-oxazolones met 2His-2Cys cu (I/II)-binding niet uitsluit, maar het resulteerde in meervoudige cu (I)-binding via lineaire overbruggings coördinatie (Figuur 3) in tegenstelling tot de mononucleaire cu (i) binding van MB-OB3b's tetraëdrische coördinatie48. Cu (II) reductie werd ook gemedieerd door thioloxidatie en bisulfide brug vorming in tegenstelling tot de bestaande bisulfide brug in APO-MB-OB3b en het hoge reductiepotentieel voor door koper geladen MB-OB3b, die de sterke voorkeur voor cu (I)49 ondersteunt .

Toekomstige toepassingen
Verder IM-MS studies van amb peptiden zijn aan de gang, waarin hun primaire sequentie wordt gewijzigd door het vervangen van de zijn of CYS met Gly of ASP, terwijl de Tyr residu wordt vervangen door Gly of PHE. Deze onderzoeken worden ook uitgevoerd in 10,0 mM ammoniumacetaat, waarbij de pH wordt aangepast met ammoniumhydroxide (voor pH = 7, 8 en 9) om de totale ionensterkte constante voor elk monster te behouden. Deze resultaten zullen binnenkort worden gepubliceerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit materiaal is gebaseerd op het werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder 1764436, NSF-instrument ondersteuning (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014) en computerbronnen van het ministerie van energie (TX-W-20090427-0004-50) en L3 Communications . We danken de Bowers groep van de Universiteit van Californië-Santa Barbara voor het delen van het Sigma-programma en Ayobami Ilesanmi voor het demonstreren van de techniek in de video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114, (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256, (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107, (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30, (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256, (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305, (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80, (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7, (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25, (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19, (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51, (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261, (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14, (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141, (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84, (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26, (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50, (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98, (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88, (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18, (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4, (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5, (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43, (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96, (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17, (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50, (4), 1378-1391 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics