Høy gjennomstrømming co-kultur analyser for etterforskning av mikrobielle interaksjoner

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Co-kulturen samhandling analysene presentert i denne protokollen er billig, høy gjennomstrømming, og enkel. Disse analysene kan brukes til å observere mikrobielle interaksjoner i co-kultur, identifisere interaksjon mønstre, og karakterisere den hemmende potensialet i en mikrobiell stamme av interesse mot menneskelige og miljømessige patogener.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Temkin, M. I., Carlson, C. M., Stubbendieck, A. L., Currie, C. R., Stubbendieck, R. M. High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions. J. Vis. Exp. (152), e60275, doi:10.3791/60275 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studiet av interaksjoner mellom mikroorganismer har ført til en rekke funn, fra romanen antimikrobielle stoffer til innsikt i mikrobiell økologi. Mange tilnærminger brukes til studiet av mikrobielle interaksjoner krever spesialisert utstyr og er dyre og tidkrevende. Dette papiret presenterer en protokoll for co-kultur samhandling analyser som er billig, skalerbar til store utvalg tall, og lett tilpasses til en rekke eksperimentelle design. Mikroorganismer er kultivert sammen, med hver brønn representerer en parvis kombinasjon av mikroorganismer. En test organisme er kultivert på den ene siden av hver brønn og første inkubert i monokultur. Deretter mål organismer er samtidig inokulert på motsatt side av hver brønn ved hjelp av en 3D-trykt inoculation stempel. Etter co-kultur, de fullførte analysene er scoret for visuell fenotyper, for eksempel vekst eller hemming. Disse analysene kan brukes til å bekrefte fenotyper eller identifisere mønstre blant isolat av interesse. Ved hjelp av denne enkle og effektive metoden, kan brukerne analysere kombinasjoner av mikroorganismer raskt og effektivt. Denne co-kulturen tilnærmingen er gjeldende for antibiotika funn samt kultur-basert mikrobiomet forskning og har allerede blitt brukt på begge programmene.

Introduction

I naturen, mikroorganismer sjelden eksisterer i isolasjon; Følgelig er de stadig i samspill med andre organismer. Derfor studere hvordan mikroorganismer samhandle med hverandre er avgjørende for å forstå en rekke mikrobiell atferd1. Mikrobiell interaksjon kan være mutualistic, Commensal, eller fiendtlig innstilt. Disse i teractions kan påvirke ikke bare mikroorganismer selv, men også miljøer og verter at mikroorganismer kolonisere1,2.

Mange forskere studerer mikrobiell interaksjon å identifisere nye antimikrobielle molekyler. En av de første klinisk viktige antimikrobielle molekyler ble funnet gjennom studiet av mikrobielle interaksjoner. Sir Alexander Fleming observert en forurensende Penicillium spp. isolere som hemmet veksten av en Staphylococcus stamme, noe som førte til oppdagelsen av den brukte antibiotika penicillin3. Karakterisering av mekanismene som mikroorganismer bruker til å antagonize sine konkurrenter er fortsatt en fruktbar ressurs for oppdagelsen av antimikrobielle molekyler. For eksempel ble det nylig vist at Streptomyces Sp. stamme Mg1 produserer antibiotika linearmycins, som har en lytisk og degradative aktivitet mot Bacillus subtilis4.

Videre, en ikke-ribosomally syntetisert peptid navngitt lugdunin ble nylig oppdaget etter observasjon at nasal Commensal Staphylococcus Lugdunensis hemmer Staphylococcus aureus5. Studier har også vist at mutualistic interaksjoner mellom mikroorganismer er like kraftige som fiendtlige interaksjoner for oppdagelsen av antimikrobielle molekyler. For eksempel, mange sopp-oppdrett maur i stammen Attini Harbor symbiotisk bakterier kalt Pseudonocardia på deres Exoskeleton som produserer soppdrepende molekyler å hemme en forplikte patogen av sine fungal avling6. Som studiet av mikrobiell interaksjoner har vært fordelaktig for å oppdage antimikrobielle molekyler, bruk av høy gjennomstrømming skjermer kan resultere i oppdagelsen av nye antimikrobielle molekyler.

Med hensyn til kostnader og enkel ytelse, metodene som brukes til å studere mikrobielle interaksjoner spenner fra enkle til komplekse. For eksempel, en agar plugg analysen er en billig og enkel metode som kan brukes til å undersøke motsetningen mellom flere mikroorganismer7. Men en agar plugg analysen er ikke en effektiv prosedyre og kan være arbeidskrevende for mange parvis kombinasjoner. For å vurdere virkningene av mikrobielt produserte produkter på målet isolerer av interesse i en høy gjennomstrømming måte, mange laboratorier bruke disk diffusjon analyser8. Disse analysene er enkle og rimelige og kan skaleres til høyere antall prøver7. Men denne analysen krever generering av mikrobielle ekstrakter og kan produsere villedende resultater for visse kombinasjoner av mål organismer og antibiotika, for eksempel Salmonella og cefalosporiner9.

De foregående tilnærmingene er avhengige av isolerte komponenter for å lokke fram et svar i en mål organisme, i stedet for å la mikroorganismer samhandle med hverandre. Dette er av notatet fordi interaksjoner mellom mikrober kan lokke fram produksjonen av "kryptiske" antimikrobielle molekyler som ikke produseres i monokultur. For eksempel ble det nylig vist at den antimikrobielle keyicin er bare produsert av en Micromonospora Sp. Når co-kultivert med en Rhodococcus Sp. som er isolert fra samme svamp mikrobiomet10. Mer komplekse samspill metoder omgå dette potensialet monokultur hindring. For eksempel er iChip nyttig for å isolere sjeldne og vanskelige å dyrke bakterier fra miljø prøver og gir mulighet for observasjon av mikrobielle interaksjoner gjennom vekst in situ11. Å etterforske vekselsvirkningene inne detaljen, matrise hjalp laser desorpsjon/ionisering tid-av-flyreise tenkelig masse massespektrometri (MALDI-TOF-IMS) kan brukes. Denne tilnærmingen gir detaljert informasjon om sammensetning og distribusjon av små molekyler og peptider som produseres ved å samhandle mikrobielle kolonier med høy romlig oppløsning. MALDI-TOF-IMS har også blitt brukt i flere studier av bakterielle interaksjoner å karakterisere mekanismene i konkurransen12,13,14,15. Men MALDI-TOF-IMS krever ofte møysommelig prøve forberedelser, spesialisert ekspertise for å drive utstyret, og dyre og spesialiserte masse spektrometre. Av disse grunner er det en vanskelig teknikk å bruke for høy gjennomstrømming studier. Således, en enkel, skalerbar og høy gjennomstrømming co-kultur-analysen for mikrobiell interaksjoner som overvinner mange begrensninger av de ovennevnte tilnærminger vil være fordelaktig.

Her presenteres en protokoll for høy gjennomstrømning mikrobiell co-kultur. Denne analysen er enkel og lett innlemmet i eksisterende studier av mikrobielle interaksjoner. I motsetning til mange brukte metoder for studiet av mikrobielle interaksjoner, vår metode er enkel, billig, og er mottagelig for å undersøke et stort antall interaksjoner. Disse analysene er ikke bare enkle å utføre, men materialene er allment tilgjengelige fra de fleste laboratorie leverandører eller offentlige ressurser (for eksempel biblioteker og makerspaces). Følgelig er denne analysen fordelaktig som en første linje av etterforskning for å identifisere og analysere interessante mønstre blant mange parvis kombinasjoner av mikroorganismer, som kan være spesielt nyttig for etterforskningen av mikrobiell økologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informert samtykke ble innhentet fra donor foreldre, og Human Committee ved University of Wisconsin-Madison godkjent studien (institusjonelle Review Board [IRB] godkjenning nummer H-2013-1044).

1. sample kultur

Merk: Denne prosedyren er brukt her for studiet av interaksjoner mellom bakterier isolerer fra den menneskelige nesehulen. I prinsippet er følgende metoder gjelder for enhver kultur tilstand. Brain-hjerte-infusjon buljong (BHI) brukes for generell forplantning av nasal bakterier. Alle platene er befestet ved hjelp 1,5% agar. For denne studien, er prøvene tatt fra saltoppløsning spyles inn i en donor nese (nasal tømming), overført til mikrosentrifugen rør, og frosset ved-80 ° c.

  1. Bruk standard kultur teknikker til plate 100 μL av hver av de tint tømming prøvene på BHI plater.
  2. Ruge platene aerobt ved 37 ° c i 1 uke.
  3. Etter inkubasjons velger du ≥ 2 kolonier av hver distinkte morphotype per plate og passasje isolerer aerobt på BHI plater av striper en koloni fra den første platen på en ny BHI plate og incubating platen ved 37 ° c. Gjenta til bakteriekulturer er rene.
    Merk: Bakteriell isolerer kan identifiseres gjennom koloni morfologi, gram-farging, 16S rRNA gen sekvensering, eller en annen metode. Men å vite det isolere identitet er ikke nødvendig for å fortsette protokollen.
  4. Lagre nedfryste alle bakterielle isolerer ved-80 ° c etter å ha kombinert 1 mL 50% glyserol med 1 mL bakteriell overnatting kultur (se pkt. 3) i cryotubes.

2.3D utskrift frimerker

Merk: Polykarbonat ble valgt som stempling materiale på grunn av sin høye glass overgang temperatur (147 ° c) som overstiger standard autoklav temperaturer (121 ° c), noe som minimerer potensialet for deformasjon etter gjentatt bruk.

  1. Legg 3D-skriveren med polykarbonat filament.
  2. Påfør hvit skole lim (polyvinylklorid acetate) til utskriften sengen for å hjelpe i vedheft og minimere fordreining av inoculation stempel under utskriften.
  3. Legg i. STL-modell (tilleggs data fil) for det inoculation stempelet (figur 1) i 3D-skriverprogramvaren.
  4. Skriv ut inoculation stempel ved en 290 ° c dyse temperatur, 60 ° c seng temperatur, og lag høyde på 0,38 mm.
  5. Pakk stempelet i aluminiumsfolie og sterilisere ved autoklavering for 1,5 h på en tyngdekraft syklus med 15 min tørking.
    Merk: Selv om polykarbonat er hygroskopisk, stempler bare beholde ca 0,5% vann vekt etter autoklavering.

3. utarbeidelse av overnatting kulturer

  1. Ved hjelp av en serologisk pipette, Pipetter 3 mL steril BHI buljong i 14 mL kultur rør.
  2. Ved hjelp av en steril 1 μL vaksinere sløyfe, vaksinere en bakteriell koloni i suppen. Snurr sløyfen for å sikre at klump sprer inn i suppen. Vortex kulturen rør kort før inkubasjons.
  3. Ruge kulturen rør ved 37 ° c over natten (~ 16 h) på en shaker ved 250 RPM.
  4. Vortex å bryte opp klumper av celler når bakteriekulturer nå tilstrekkelig turbiditet (OD600 ≥ 1).

4. utarbeidelse av Fotokarsinogenetisk plater

Merk: Fotokarsinogenetisk platene er fremstilt i en laminær strømnings hette for å opprettholde sterilitet.

  1. Forbered BHI Media med 1,5% agar og sterilisere ved autoklavering i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Etter autoklavering, avkjøles BHI-mediet til 55 ° c i et temperatur kontrollert vannbad.
  3. Bruk en serologisk pipette, Pipetter 3 mL smeltet BHI-medium i hver av de 12 brønnene på en 12 brønn plate. Sørg for at brønnene er så nøyaktige og til og med som mulig. En liter Media vil gi ~ 27 fotokarsinogenetisk plater.
  4. La agar å sette over natten.

5. vaksinere Fotokarsinogenetisk plater med test organisme

Merk: En test organisme refererer til organismen som produksjon av hemmende aktivitet (for eksempel antibiotika produksjon) bestemmes ved hjelp av co-kulturen interaksjon analysen. For dette eksperimentet, testen organismer er Actinobacteria isolert fra nasal lavages prøver.

  1. Vaksinere test organismen på en fotokarsinogenetisk tallerken ved å sette inn en steril 10 μL vaksinere sløyfe i natt kulturen og striper en kultur dråpe over den venstre tredje delen av en plate brønn.
    Merk: Det anbefales å bare stripe en tredjedel av brønnen, som overvekst av brønnen forbyr senere inoculation av mål organismer.
  2. Gjenta til alle 12 brønner på tallerkenen har blitt inokulert med test organismen.
  3. Ruge platene opp ned på riktig temperatur i 7 dager. Ved høyere temperaturer (≥ 37 ° c) eller i tørrere klima, Oppbevar platene i en fuktig beholder for å hindre at platene tørker ut.

6. utarbeidelse av mål organismer

Merk: Et mål organisme refererer til organismen som hemming status bestemmes ved hjelp av co-kulturen interaksjon analysen. For dette eksperimentet, målet organismer er Staphylococcus spp. isolert fra nasal lavages prøver.

  1. Etter å ha incubating fotokarsinogenetisk platene i 6 dager, kan du forberede over natten kulturer av de spesifiserte mål organismer, som gjort ovenfor (se pkt. 3).

7. target organisme inoculation

Merk: Etter over natten inkubasjons, sikre at kulturene er grumsete (OD600 ≥ 1). Noen bakterielle kulturer kan flocculate på bunnen av kulturen røret. Vortex kulturen rør for å spre klumper og vurdere kulturen turbiditet.

  1. Forbered målet plate ved å fylle hver brønn av en tom 12 brønn plate med 1,8 mL BHI og 200 μL av målet over natten kultur.
  2. Pakk ut og Plasser et sterilt inoculation stempel i mål platen. Forsiktig virvel kulturene rundt i brønnene, ta vare for å sikre at kulturer ikke krysser forurense nabo brønnene.
  3. Løft inoculation stempel og sikre at det er en dråpe av fortynnet mål kultur på hvert stempel spissen.
  4. Forbered en monokultur kontroll plate ved å plassere inoculation stempel på en uninoculated fotokarsinogenetisk plate og forsiktig rock stempelet slik at en kultur drop inoculates hver brønn. Når inoculation stempel er fjernet, bør en dråpe kultur være synlig i brønnene på fotokarsinogenetisk plate.
    1. Hvis noen brønner ikke er inokulert med inoculation stempel på grunn av ujevne nivåer av Media, spot 3 μL av fortynnet overnatting kultur på høyre side av brønnene ved hjelp av en pipette.
  5. Vaksinere fotokarsinogenetisk platene som gjort ovenfor (se trinn 7.4.1), men Juster stempelet slik at spissene justeres med høyre side av 12 brønn platen. Pass på at stempelet ikke tar kontakt med den eksisterende bakterie kolonien ved vaksinere av brønnene.
  6. Forsiktig fjerne stempel og sted tilbake i mål platen.
  7. Gjenta inoculation for hver fotokarsinogenetisk plate til alle platene er inokulert.
  8. Ruge fotokarsinogenetisk platene opp ned på riktig temperatur i 7 dager.

Åttende scoring

  1. Etter å dyrking test-og mål organismer i 1 uke, scorer du samhandlingene basert på følgende visuelle vurdering:
    1. Score brønnene med mål organisme vekst som viser vekst som er umulig å skille fra monokultur kontroll som "0" (ingen hemming) (figur 2A, B).
    2. Score brønnene med mål organisme som utstillinger redusert vekst i forhold til kontroll som "1" (svak hemming) (figur 2C).
    3. Score brønnene der målet organismen ikke vokse som "2" (sterk hemming) (figur 2D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Co-kultur samhandling analyser kan brukes til å forstå mikrobielle interaksjoner, identifisere mønstre av interesse, og avdekke mikrobielle isolerer med spennende aktiviteter. I disse analysene er en test organisme monocultured på den ene siden av en 12 brønn agar plate og inkubert i 7 dager. Deretter er en mål organisme observert ved siden av testen organisme og de to mikrober var co-kultivert for 7 dager før scoring for vekst fenotype av målet organisme. Analysene scores basert på en visuell analyse av veksten eller hemming av mål organismen.

Disse co-kultur analysene ble nylig brukt til å vurdere hemmende aktivitet av Actinobacteria (test organismer) mot Staphylococcus spp. (Target organismer) isolert fra den menneskelige nesehulen (figur 2)16. Co-kulturen analysene ble brukt til å identifisere spesifikke hemming mønstre mellom Actinobacteria (n = 21) og Staphylococcus isolerer (n = 39) og viste at Actinobacteria isolerer viste variasjon i deres evne til å hemme coagulase-negative stafylokokker (CoNS). Totalt 812 parvis kombinasjoner ble testet. Spesielt Corynebacterium propinquum sterkt hemmet cons (figur 2D), spesielt i forhold til andre Corynebacterium som svakt hemmet CoNS (figur 2C) eller hadde ingen effekt på CoNS ( Figur 2B), og sammenlignet med monokultur-kontrollen (figur 2A)16.

Ved hjelp av komparative Genomics ble det identifisert en biosyntetiske gen klynge for siderophore produksjon i C. propinquum genomer som var fraværende i genomer av andre Corynebacterium isolerer16. Siderophores er chelater produsert av mikroorganismer for å renovere jern fra miljøet17. Siderophore produksjon av C. propinquum ble bekreftet og Siderophore ble identifisert som dehydroxynocardamine16. Dette resultatet førte til hypotesen at hemming av CoNS skyldtes siderophore-mediert jern forringelse. Deretter, ved å utføre co-kultur samhandling analyser mellom C. propinquum og ulemper på både standard og jern-supplert BHI medium, ble det fastslått at hemming fenotype var jern-avhengige (figur 2E). Sammen, disse resultatene antydet at siderophore-mediert jernmangel var ansvarlig for den sterke hemming av CoNS av C. propinquum16.

Figure 1
Figur 1: fotografi av fotokarsinogenetisk inoculation stempel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: co-kultur samhandling analyser avdekke siderophore-mediert hemming av CoNS av Corynebacterium propinquum. (A) monokultur av CoNS (mål organisme) inokulert på en BHI fotokarsinogenetisk plate. (B, C, D) Co-kulturer mellom ulike stammer av Corynebacterium spp. (test organismer, venstre) og samme stamme av CoNS (Target organisme, høyre) INOKULERT på BHI fotokarsinogenetisk plater. Hvert panel er et representativt bilde som viser interaksjoner med (B) ingen hemming (score = 0), (C) svak hemming (score = 1), eller (D) sterk hemming (score = 2). (E) sammenligning av interaksjoner mellom Corynebacterium pseudodiphtheriticum (siderophore ikke-produsent) eller Corynebacterium propinquum (siderophore produsent) med samme stamme av CoNS på BHI Media (BHI) og BHI Media suppleres med 200 μM FeCl3 (BHI + jern). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggs data fil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Antibiotika og andre andre metabolitter som megle mikrobielle interaksjoner er nyttig for en rekke anvendelser, inkludert narkotika funn. Heri, en protokoll for co-kultur analyser for å vurdere et stort antall mikrobielle interaksjoner er presentert. Disse co-kultur samhandling analysene er en enkel, rimelig, skalerbar og høy gjennomstrømming betyr å undersøke mange parvis kombinasjoner av mikroorganismer i tandem. Target organismer er observert ved siden av test organismer i en brønn av en 12 brønn plate ved hjelp av en inoculation stempel, og hemming av målet organismer er scoret basert på visuell inspeksjon av målet organismen er fenotype. Flertallet av materialene som brukes i disse analysene er lett tilgjengelig gjennom de fleste laboratorie leverandører eller gjennom offentlige ressurser. Derfor kan analysene enkelt skreddersys til mange laboratoriemiljøer. I laboratoriet har disse co-kultur analysene vært vellykket i å undersøke interaksjoner av mikroorganismer forbundet med mange verter fra en rekke miljøer.

Mens det er mange fordeler med denne teknikken, er det også noen begrensninger. Den første bemerkelsesverdige begrensningen er at mønstre fra co-kulturen analysene er vanskelig å tolke uten andre metadata. I to nyere avhandlinger som sysselsatte disse co-kultur analysene16,18, hemming mønstre av interesse ble bare identifisert i forbindelse med andre metadata, for eksempel taksonomisk identiteten til test organismer. Likevel, selv uten med følgende metadata, metodene som er beskrevet i dette papiret er mottagelig for å identifisere bakterielle isolerer med hemmende aktivitet mot bestemte patogener eller målrette mikrober av interesse.

En ekstra begrensning er at disse analysene ikke er kommersielt tilgjengelige, og fotokarsinogenetisk platene må være hånd-forberedt, noe som kan begrense analysen effektivitet. Plate forberedelser er avgjørende for eksperimentet, og det bør utvises forsiktighet når platene klargjøres. Hvis brønnene er ujevne, kan det inoculation stempelet ikke være i stand til å vaksinere alle brønnene. Men tapte brønner kan bare være inokulert ved direkte pipettering målet organisme kulturen på høyre side av hver uninoculated også. Faktisk, selv om noen brønner på hver plate er savnet av stempel, er prosedyren fortsatt mer effektiv enn direkte pipettering målet organisme i hver enkelt brønn. Alternativt kan brukerne avkall på inoculation stempel og pipette målet organisme i hver brønn, men denne prosessen er mer tidkrevende, spesielt i forhold til stempling 12 brønner samtidig.

Til slutt kan testen organisme forbruke de tilgjengelige næringsstoffene i brønnen under monokultur før målet organisme er inokulert. Selv om nedbryting av næringsstoffer kan påvirke de observerte hemming mønstrene, synes det å være uvanlig blant de parvis kombinasjonene som har blitt testet hittil. Spesielt, forringelse av jern i brønnene av C. propinquum tillatt for oppdagelsen av siderophore-mediert konkurranse fra medlemmer av den menneskelige nasal bakterieflora16.

Disse co-kultur samhandling analysene er passelig ved å endre Media komposisjon, timing, eller til og med flere organismer eller mikrobiell konsortier som test organisme. Videre kan ulike scoring systemer brukes avhengig av ønsket nivå av detaljer som kreves for å beskrive samspillet fenotype. Eksempler på scoring skalaer inkluderer de fra 0-2 brukes til å beskrive konkurrerende interaksjoner mellom bakterier isolert fra den menneskelige nesehulen16 (figur 2) og fra 0-3 brukes til å vurdere antimikrobielle potensialet i Streptomyces isolert fra insekt microbiomes18. Men med mer nyansert skalaer, blir scoring stadig vanskeligere. Dermed er hemming lettest gjenkjennes ved hjelp av en binær scoring system (f. eks, 0 er definert som ingen hemming og 1 som hemming), som kan eliminere eventuelle misforståelser og standardisere scoring over flere individer. Videre, i tillegg til scoring for hemming fenotyper, kan disse analysene også bli scoret for andre fenotyper, inkludert pigment produksjon, sporulation, eller andre fenotype som kan vurderes visuelt. Ettersom disse analysene er svært skalerbar med analyse basert på visuell inspeksjon av målet organisme, opplæring sett for maskinlæring algoritmer kan genereres for å lette fenotype scoring og ytterligere øke analysen gjennomstrømming.

En stor styrke av disse co-kultur analysene er deres evne til å lette screening mange kombinasjoner av parvis interaksjoner billig og raskt for å avdekke aktiviteter eller hemming mønstre av interesse. Senere kan mer komplekse og intensive metoder (dvs. genomisk karakterisering, MALDI-TOF-IMS, eller naturlig produkt isolering og karakterisering) brukes for dypere karakterisering av mikrober og interaksjoner av interesse identifisert av co-kultur analyser. Som et eksempel, disse co-kulturen hemming analysene ble brukt til å vise at insekt-avledet Streptomyces kan hemme gram-negative bakterier og sopp bedre enn deres jord-avledet kolleger. Den hemming analysene tillatt for rask og effektiv visualisering av hemming mønstre blant 2 003 Streptomyces isolerer og førte til oppdagelsen av en ny Antifungal kalt cyphomycin, som er aktiv mot narkotika-resistente fungal patogener 18. således, disse co-kultur samhandling analyser er et kraftig verktøy for mikrobiomet forskning, antimikrobielle funn, og få dypere innsikt i mønstre av mikrobielle interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Daniel May, Marc Chevrette, og Don Hoang for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet, inkludert innsatsen til Cameron R. Currie, ble støttet av University of Wisconsin-Madison, kontoret til visekansler for forskning og graduate Education med støtte fra Wisconsin Alumni Research Foundation, finansiering også gitt av National Institutes of Health Centers for excellence for translational Research (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck ble støttet av et nasjonalt bibliotek av medisin trening stipend til beregning og informatikk i biologi og medisin Training program (NLM 5T15LM007359). Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling, og tolkning, eller beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue VWR 12000-806
10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow VWR 12000-810
12-well cell culture plate, sterile with lid Greiner bio-one 665 180
14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile Falcon 352057
2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile USA scientific 1420-9710
25 mL serological pipet Cell Treat 229225B
Agar, bacteriological VWR J637
Brain Heart Infusion Broth Dot Scientific DSB11000-5000
Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter Keene Village Plastics 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
School Glue Elmer's EPIE304
Taz 6 3D printer Lulzbot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7, (August), 1234 (2016).
  2. Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21, (9), 501-507 (2006).
  3. Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10, (3), 226 (1929).
  4. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11, (12), e1005722 (2015).
  5. Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535, (7613), 511-516 (2016).
  6. Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398, (6729), 701-704 (1999).
  7. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6, (2), 71-79 (2016).
  8. Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38, (1), 61-65 (1944).
  9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
  10. Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12, (12), 3093-3102 (2017).
  11. Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76, (8), 2445-2450 (2010).
  12. Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157, (Pt 9), 2485-2492 (2011).
  13. Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (32), 13082-13087 (2012).
  14. Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. 349-396 (2014).
  15. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5, (12), 885-887 (2009).
  16. Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85, (10), 1-17 (2019).
  17. Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30, (4), 691-696 (2002).
  18. Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10, (1), 516 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics