再建微小外科における虚血再灌流損傷の研究のための前臨床ラットモデル

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Summary

ここでは、再建微小外科における虚血再灌流損傷の病態生理学を研究するための前臨床動物モデルについて説明する。ラットの表面的なカウダル上腹部に基づくこの遊離な皮膚フラップモデルは、虚血再灌流傷害関連損傷に対抗する異なる治療法および化合物の評価を可能にすることもできる。

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Ballestín, A., Casado, J. G., Abellán, E., Vela, F. J., Campos, J. L., Martínez-Chacón, G., Bote, J., Blázquez, R., Sánchez-Margallo, F. M. A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery. J. Vis. Exp. (153), e60292, doi:10.3791/60292 (2019).

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Abstract

虚血再灌流損傷は、再建マイクロサージャリーにおけるフラップ障害の主な原因である。ラットは、その費用対効果とヒトへの翻訳による生物医学研究の多くの分野で好ましい前臨床動物モデルである。このプロトコルは、虚血再灌流損傷を有するラットにおいて前臨床遊離皮膚フラップモデルを作成する方法を記載する。説明した3cm x 6cmラットの遊離皮膚フラップモデルは、いくつかの血管合字および血管ペディクルのセクションの配置後に容易に得られる。そして、虚血性侮辱および微小外科的アナストモシスの完了後8時間、遊離皮膚フラップは組織損傷を発症する。これらの虚血再灌流傷害関連損傷をこのモデルで研究することができ、この病態生理学的プロセスに対処する治療薬を評価するのに適したモデルとなる。さらに、この動物モデルの評価のためのプロトコルには、トランジットタイム超音波技術とレーザースペックルコントラスト分析の2つの主要なモニタリング技術が記載されています。

Introduction

マイクロサージャリーは、複雑な組織欠損を回復させるための介入(例えば、遊離組織移動)、切断された四肢の転置、さらには複合組織同種移植を可能にする再建のための一般的な外科的技術となっています。

微小外科的再建は、外傷、火傷、または直行的切り傷によって引き起こされる多種多様な欠陥に最適です。しかし、自由フラップ障害の割合が低く、その中でも虚血再灌流(I/R)損傷が主な原因の一つである。すべての微小外科的に転移した組織は、虚血の必須期間に耐え、その後再灌流を続けた。原発性虚血のこの期間は、通常、十分に許容される;したがって、微小外科的処置の成功率は90%1、2を超える。しかし、外科的改訂を必要とするフラップのわずか63.7%は完全に保存することができます3.また、指の外傷の再移植の場合、成功率は66%4です。I/R損傷に苦しむ複合組織同種移植の場合、I/R損傷が自然免疫を活性化するので拒絶率が増加する。

従って、この病態生理学的現象の研究が関心を持っている。動物モデルは、生理学的メカニズムを調査し、ヒト7に適用する前に新しい治療法を評価するために不可欠です。血管解剖学とラットとヒトの生理学的類似性は、ラットをI/R傷害などの生物学的プロセスの調査のための理想的なモデルにします。

ここでは、I/R損傷を伴うラットフリースキンフラップモデルの作成に関する詳細なプロトコルと、術中および術後の評価のためのさまざまな可能性を示します。この方法の全体的な目標は、I/R傷害および関連する損傷を減らすために可能な治療法を研究するのに有用な前臨床モデルを記述することです。

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Protocol

すべての手続きは、ヘスス・ウソン低侵襲手術センターの倫理委員会とヨーロッパの法律に基づく地方政府の福祉ガイドラインに従って行われました。

1. 手術前および外科的準備

  1. ハウスウィスターラットは、食べ物と水への無料アクセスで22〜25°Cのケージに290〜350グラムの重量を量ります。ストレス誘発の問題を防ぐために手術の前に1週間の順応。
  2. ラットを麻酔誘導室に入れ、5分の酸素(0.5-1 L/min)を送り、気化器を使用して5%のセボフルランを送達して麻酔を誘発する。
  3. 麻酔が誘発されたら、ラットを部屋から取り出します。ラットに吸入フェイスマスクを置き、麻酔を維持するために2%セボフルランの流量を提供する。つま先のピンチに対する応答の欠如を確認します。
  4. 角膜の乾燥や損傷を防ぐために目の保護軟膏を使用してください。
  5. 全身麻酔下で動物を次のように監視する:直腸温度計(35.9~37.5°C)を設置し、粘膜の色を確認し、げっ歯類パルスオキシメータを配置してO2飽和度(>95%)を確認します。心拍数(250~450 bpm)。
  6. 低体温を避け、術後麻酔の回復を改善するために、熱サポート(電気加熱パッドまたは循環水毛布)を使用してください。
  7. 適切な水分補給を維持するために、温かい皮下生理食塩水の5 mLを注入する。
  8. 鎮痛薬と抗炎症薬(メロキシカム1mg/kg/日)と予防抗生物質(エンロフロキサシン7.5mg/kg/日)を処置前および術後5日間皮下に提供する。
  9. 動物の腹部と鼠径部を剃ります。
  10. 局所ポビドロン-ヨウ素を適用し、70%のエタノールを続けます。無菌のドレープで動物を覆う。

2. 無料のスキンフラップモデル手術

  1. 外科マーカーを使用して、腹部の中間線と6 cmの側面の1つに一致する3 cm x 6 cmのフラップを描きます。次に、腹部の中間線で6cmの皮膚切開を行い、6cm中線切開の上下部分に2つの垂直な3cm切開を行う。
  2. 設計された3 cm x 6 cmのスキンフラップの解剖を開始するには、はさみとAdson鉗子を使用して、皮膚の可動性のために(メスではなく)フラップを上げます。
  3. 頭蓋領域から大脳領域に向かってフラップをゆっくりと引き出し、解剖を助け、豊富な緩い結合組織に囲まれた上腹部のペディクルを特定します。
  4. フラップペディクルに触れることなく、または容器の壁を損傷しないように、アドベンティティアをできるだけ少なく把握して解剖します。
  5. 8/0ナイロン縫合糸を使用して、近位の大腿骨血管、横円周大腿骨血管、およびサフェノス血管の合字によって閉塞します。それによって、フラップの灌流は大腿動脈によって提供され、表在性の大腸上腹部動脈を通って直接続き、静脈排液は表在性大腿骨上腹部静脈に向かって行われる。
  6. 血管ペディクルをクランプし、8時間虚血期間を開始するためにそれをカットします。手順の間に温度を維持するために電気毛布を使用する。温かい(25°C)0.9%生理沈水溶液の2つの5ml注射は皮下投与される。最初の管理は、手順の開始後 2 時間実行されます。および第2は、動物の適切な回復を得るための手順の終わりに。
  7. ヘパリン化生理行き溶液(100 U/mL)を使用してフラップをパーフューズし、微小循環から停滞した血液を除去します。
  8. 10/0ナイロン縫合糸を使用して、マイクロサージカルなアナストモーゼを行います。
  9. 虚血の8時間後、微小血管クランプを取り外してフラップを再浸透させ、以下に説明するように血管のパテンシーを確認する。

3. 術中評価

  1. 静脈と動脈の手動口蓋検査(空および補充試験)を行う。これを行うには、2つの微小外科的鉗子を使用し、解剖学的に遠位に配置し、搾乳を行う。最初に解剖部位に最も近い鉗子を解放する。血管切除が空になった後も血流が続く場合、解剖は特許である。
  2. 通過時間超音波流量計とマイクロサージカルプローブを使用して血流を評価します。
    1. 流れプローブの適切なサイズを選択するために、ペディクル容器の直径を測定します。
      注:0.7 mmの流れの調査は0.4 mmから0.7 mmまで及ぶ容器を測定できる;1.0 mmの流れの調査は0.7 mmから1.0 mmまで及ぶ容器を測定できる;1.5 mmの流れの調査は1.0 mmから1.5 mmまで及ぶ容器を測定できる。
    2. 流れプローブの超音波検出ウィンドウ(リフレクターとトランスデューサの間)にターゲット容器を配置し、流量を定量化します。
      注:プローブを容器の平面に中立に保持し、張力や引っ張りを避けます。
    3. すべてのバーがディスプレイ上で緑色であることを観察することにより、音響カップリングの品質を確認します。
      注:良好な音響カップリングを得ることが困難な場合は、超音波ゲルまたは生理食塩水溶液を局所的に使用してください。
    4. 良好なカップリングが達成され、容器が張力なしで音響窓に置かれたら、データを格納するためにディスプレイの録音ボタンをクリックします。
      注:信頼性の高い正しい測定値を得るためには、波形パターンが常に繰り返し可能であることを確認します。
  3. 完了したら、ポリグリコール酸(PGA)4-0吸収性編組縫合糸(16mm 3/8三角形針)を使用して皮膚を閉じます。縫合糸の一部が術後にラットによって噛まれた場合、強度と組織位置を維持するために、単純な中断パターンを使用します。
  4. レーザースペックルコントラスト解析(LASCA)を使用してフラップの微小循環を評価します。
    1. 各動物と研究の各フォローアップのための新しい記録を作成します。この場合は、[ファイル]/[新しいレコーディング]をクリックします。新しいウィンドウが開き、セットアップ パネルが表示されます。次に、プロジェクト名、件名、オペレータ、およびレコーディング名の情報を編集します。
    2. 再現性を最大限に高めるには、作業距離、測定領域、ポイント密度、フレームレート、周囲光条件のパラメータを標準化します。
      1. 組織に対してレーザーを動かして、作業距離を調整します。目的の組織に向かってレーザーヘッドを拡大または縮小します。測定値を確認するには、[イメージの設定]をクリックします。ここでは、12.0 cmに設定します。
      2. [イメージの設定]で目的の高さを入力して、測定領域を標準化します。設計されたフラップは3 cm x 6 cmを測定する。この測定では、幅 4.0 cm、高さ 7.0 cm を選択して余分なスペースを設定します。
      3. [イメージ設定]で[ポイント密度]を高く設定します。高、中、低の 3 つのオプションがあります。
    3. イメージキャプチャ設定で、録画のフレームレート(10 イメージ/s)と録画の継続時間(1分)を選択します。
      注:手術室で同じ周囲光状態を有し、評価を操作または実行している間。
    4. [録音]ボタンをクリックして記録を開始します。セットアップパネルは録音パネルに置き換えられます。データは自動的に保存されます。さらに比較を有効にするには、手順中にスナップショットを作成します。
      注:灌流縮尺は、視覚化を改善するために変更することができます([ ツール |フィルタとカラースケール |灌流スケール |手動 0 ~ 150)が、測定された灌流値は影響を受けません。記録の前後に、異なる対象領域(ROI)を作成して、それらの中の灌流を測定することができます。ここでは、練習フラップの面積(3cm×6cm)のみを評価した。
  5. 生存領域と壊死領域を測定するには、ImageJ ソフトウェアを使用します。
    1. フラップの側面に定規を見つけ、フラップ生存領域のマクロ的な測定のためのコントロール写真を撮ります。
    2. 画像を評価するには、ImageJ ユーザー インターフェイスを開きます。[ファイル]をクリックし、測定するイメージを開きます。
    3. ツールボックスで[直線]を選択し、ルーラーの 1 cm 上に直線を描画します。[分析] |[スケール] を設定し、テキスト ボックスに 1 cm の値を既知の距離で表示します。
    4. ポリゴン選択ツールをクリックし、フラップの上にポリゴン ラインを描画して、実行可能な領域を計算します。最終的には、[分析|面積の値を取得する測定。
  6. 手術領域の自己変異を防ぐために、ハウジングの前に動物に術後ドレッシングを置きます。手順の後、動物は、温度制御(22°C〜25°C)の部屋で、個別にケージに収容されます。

4. 術後評価と組織サンプリング

  1. このプロトコルで前述したのと同じ手順(ステップ1.2および1.3)に従って、フラップ評価および組織サンプリングのために術後7日でラットを麻酔する。つま先のピンチに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
  2. フラップ生存領域と壊死領域のマクロ的測定を可能にするために手術領域を撮影します。プロトコルで前に説明した術中評価と同じ手順に従って、術後のマクロスコピック測定を行います (ステップ 3.5)。
    注:ポリゴン選択ツールを使用する際には、実行可能領域を区切るフラップ上に線を描画します(cm2で測定)。生存面積のパーセンテージは、(総フラップ面積の生存面積/cm2のcm2)×100として算出することができる。
  3. LASCA技術(ステップ3.4)を使用してフラップの微小循環を評価し、灌流差を可視化および定量化する
  4. マクロ分析の後、4/0縫合糸を取り除き、フラップを上昇させ、通過時間超音波を使用して血管ペディクル血流を再評価します。
  5. フラップを1.5cm x 6cmの2つの部分に縦方向に分割して組織サンプリングを行います。
    1. 室温で4%パラホルムアルデヒドを有する生検容器に一部を浸漬し、さらなる組織学的分析を行います。
    2. 凍結保存チューブに組織の他の部分を導入し、液体窒素に浸し、その後、将来の分子分析のために-80°Cで保存することにより、チューブを凍結保存します。
  6. 倫理委員会の勧告に従って2 M KCl/kgの急速な心内注射を使用して、一般的な吸入麻酔下でラットを安楽死させる。

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Representative Results

微小外科的アナストモーゼの作成直後に、文献8で推奨される最小流量よりも高い血流量を得た。したがって、すべての微小外科的解調は手術後1週間特許であった(図1)。

Figure 1
図1:通過時間超音波血流評価(A)血流を評価する微小外科的フロープローブの位置。(B)フラップペディクルの解剖血管の血流パターン及び定量を得た。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

虚血性侮辱中の血流の微小循環的な剥奪の観察は、フラップ再灌流中の即時ハイパー灌流を含むLASCA技術で可能であり、そして、周術期的には、試験終了7日後に実際に壊死した術後フラップ壊死のリスクが少なく、術後フラップ壊死のリスクが高い(図2)。

Figure 2
図2:レーザースペックルコントラスト解析技術(A)生理学的状態における微小循環組織血液灌流の可視化(B)虚血時の微小循環組織血液灌流の可視化. (C) 再灌流直後の微小循環組織血液灌流の可視化この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

虚血とその後の再灌流の8時間後のフラップ生存領域は約40%であった。以前に発表された結果9は、このモデルが虚血性侮辱を受けられなかったフラップと比較した場合に統計的に有意な差を示した。

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Discussion

微小外科的遊離組織移動は、大きな欠陥を再構築するための選択の方法となっている。虚血の期間は、このような遊離組織移動の間に発生します。この期間が組織の許容度を超えると、I/R損傷は練習されたフリーフラップ9の故障を引き起こす可能性がある。再建マイクロサージャリーにおけるI/R損傷を研究するための費用対効果の高い翻訳前臨床モデルを開発する方法論の記述は、この病態生理学的プロセスを打ち消すために異なる化合物の研究を導くのに役立つ可能性がある。

記載された動物モデルでは、血管合字を配置し、自由フラップを上げた後、後肢血流の侵害は認められず、痛みやぐったりも認められなかった。Kochi et al.10が述べたように、我々のモデルはまた、筋肉内ネットワークを介して3つの担保経路を残した。

遊離フラップのモニタリングは、サルベージが虚血発症とその臨床認識との間の持続時間に反比例するので、11の重要性が最も重要である。この目的のために、フリーフラップは術中および術後に研究されるべきである。

術中に、広く使用されている空および補充試験または音響ドップラーは、同定を可能にするが、アナストモシス12を介した流れの有無を定量化することはできない。このため、我々は、外科医が微小外科的解薬13の血流を定量することを可能にする新しい方法である通過時間超音波技術を使用した。我々の研究では、すべての微小外科的アナストモーゼは、虚血性侮辱の8時間後と研究の終わりに特許であった。微小外科的アナストモーゼの作成直後に、文献8で推奨される最小値よりも高い血流量を指摘した。これは、研究の終わりに良好なペディクル灌流を予測し、結果が微小外科的技術の影響を受けるのではなく、事象のI/R損傷カスケードによって影響を受けたことを実証した。ただし、この手法には制限はありません。信頼できる結果を得るためには、マイクロサージカルプローブを容器の平面に中立に保持する必要があり、それを引っ張ったり、緊張を生み出したりしないでください。超音波ゲルまたは生理水を使用して達成することができる適切な信号を得るために良好な音響カップリングが必要です。装置によって提供される高品質のカップリング信号は、測定中に考慮すべき重要なパラメータです。

我々は、レーザースペックル造影画像またはレーザースペックルイメージングとしても知られるLASCA、術後14を使用している。この技術は、ここで検証されたフリーフラップ内の流れの半定量的リアルタイムマッピングのための貴重な技術を表します。制限の 1 つは、結果が任意の単位で提供され、実際のフロー値に直接関連しないことです。この意味で、この相関関係を検証するには、さらなる研究が必要です。レーザードップラー流量測定は、より一般的に使用されるが、それはフラップ内の単一点で灌流を測定するだけであるという事実によって制限されるが、LASCAはフラップ15内の皮膚灌流の局所的な変化の検出を可能にする。さらに、最近の研究16は、LASCAが術後フラップ壊死の危険性が高い領域を周術的に予測するかもしれないことを示した。我々の結果は、LASCAが自由フラップのペリおよび術後モニタリングのための有望な技術であることを示唆している。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

研究プロジェクトは、ICTSナンビオシスの一部であるヘスス・ウソン低侵襲手術センター(CCMIJU)で行われました。研究は、次のナンビオシスユニットからの支援を受けて行われました: U21, 実験手術室;U22, 動物用住宅;そしてU14、細胞療法。この作業は ISCIII プロジェクト PI16/02164 によってサポートされました。この受け手は、研究設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備には何の役割も持っていませんでした。特別な感謝は、数字を準備するためのマリア・ペレスと、絶え間ない励ましを提供し、科学的な文献目録をサポートするためのフェルナンダ・カリゾーザに拡張されています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AureFlo Unit Transonic (Ithaca, USA) N/A Transit-time ultrasound flowmeter equipment
Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) S&T AG (Neuhausen, Switzerland) RHR-SET. Art.No.00795 Set of microsurgical instruments
FLOW-i Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) N/A Anesthesia Delivery System
Micro clamps ABB-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00408V Double microvascular clamp with frame
Micro clamps ABB-11 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00414V Double microvascular clamp without frame
Micro clamps B-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00396V Sigle microvascular clamp
Nylon suture 10/0 Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) 19921 Microsurgical suture
OPMI Pentero 800 Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) N/A Surgical microscope
PeriCam PSI System Perimed AB (Järfälla, Sweden) N/A Laser speckle contrast analysis equipment
Philips Intellivue MX450 Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) N/A Monitoring system
Protector posoperatorio para roedores Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) P201400272 Postoperative protector for rodents

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