Un modello di ratto preclinico per lo studio delle lesioni ischemia-reperfusione in microchirurgia ricostruttiva

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Summary

Qui, descriviamo un modello animale pre-clinico per studiare la fisiofisiologia della lesione ischemia-reperfusione nella microchirurgia ricostruttiva. Questo modello di lembo della pelle gratuito basato sui vasi epigastrici caudali superficiali nel ratto può anche consentire la valutazione di diverse terapie e composti per contrastare i danni da lesione da complicamento dell'ischemia.

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Ballestín, A., Casado, J. G., Abellán, E., Vela, F. J., Campos, J. L., Martínez-Chacón, G., Bote, J., Blázquez, R., Sánchez-Margallo, F. M. A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery. J. Vis. Exp. (153), e60292, doi:10.3791/60292 (2019).

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Abstract

La lesione da ischemia-reperfusione è la causa principale del cedimento del lembo nella microchirurgia ricostruttiva. Il ratto è il modello animale preclinico preferito in molte aree della ricerca biomedica a causa della sua efficacia in termini di costi e della sua traduzione agli esseri umani. Questo protocollo descrive un metodo per creare un modello preclinico di lembo della pelle libero nei ratti con lesione da reperfusione di ischemia. Il modello descritto 3 cm x 6 cm di ariete senza topi è facilmente ottenuto dopo il posizionamento di diverse legature vascolari e la sezione del pedicolo vascolare. Poi, 8 h dopo l'insulto ischemico e il completamento dell'anastomosi microchirurgica, il lembo della pelle libera sviluppa il danno ai tessuti. Questi danni correlati alle lesioni da ischemia possono essere studiati in questo modello, rendendolo un modello adatto per valutare gli agenti terapeutici per affrontare questo processo patofisiologico. Inoltre, nel protocollo per la valutazione di questo modello animale sono descritte due principali tecniche di monitoraggio: la tecnologia a ultrasuoni in tempo di transito e l'analisi del contrasto delle macchie laser.

Introduction

La microchirurgia è diventata una tecnica chirurgica comune per la ricostruzione che consente interventi (ad esempio, trasferimenti di tessuto libero) per ripristinare difetti di tessuto complessi, recompressione degli arti amputati e persino allotrapianto di tessuti compositi.

Le ricostruzioni microchirurgiche sono ideali per un'ampia varietà di difetti causati da lesioni traumatiche, ustioni o resezioni oncologiche. Tuttavia, vi è una bassa percentuale di guasto del lembo libero, tra i quali la lesione ischemia-reperfusione (I/R) è uno dei principali fattori responsabili. Tutti i tessuti microchirurgicamente trasferiti sopportano un periodo obbligatorio di ischemia seguito dalla reperfusione. Questo periodo di ischemia primaria è di solito ben tollerato; così, il tasso di successo delle procedure microchirurgiche supera il 90%1,2. Tuttavia, solo il 63,7% dei lembi che richiedono una revisione chirurgica può essere completamente salvato3. Inoltre, nei casi di reimpianto di lesioni da avulsione delle dita, il tasso di successo è del 66%4; e nei casi di allotrapianto di tessuto composito con lesioni I/R, le percentuali di rigetto sono aumentate poiché la lesione I/R attiva l'immunità innata5,6.

Pertanto, lo studio di questo fenomeno patofisiologico è interessante. I modelli animali sono essenziali per studiare i meccanismi fisiologici e valutare nuove terapie prima che possano essere applicate agli esseri umani7. L'anatomia delle navi e le somiglianze fisiologiche tra ratti ed esseri umani rendono i ratti un modello ideale per lo studio dei processi biologici come la lesione i/r.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la creazione di un modello di lembo della pelle privo di ratti con lesioni I/R, così come diverse possibilità per le valutazioni intra e postoperatorie. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere un modello preclinico utile per studiare le lesioni I/R e possibili trattamenti per ridurre i danni correlati.

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Protocol

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con il comitato etico del Centro di Chirurgia Minimamente Invasiva di Jesès Usàn e le linee guida di benessere del governo regionale che si basano sulla legislazione europea.

1. Preparazione prechirurgica e chirurgica

  1. I ratti Wistar di casa del peso di 290-350 g in gabbie a 22-25 gradi centigradi con libero accesso al cibo e all'acqua. Acclimatare per 1 settimana prima dell'intervento chirurgico per prevenire problemi indotti dallo stress.
  2. Mettere un ratto in una camera di induzione anestetica, fornire 5 min di ossigeno (0,5-1 L/min), e utilizzare un vaporizzatore per fornire il 5% di sevoflurane per indurre l'anestesia.
  3. Togliere il topo dalla camera una volta indotta l'anestesia. Posizionare la maschera facciale per inalazione sul ratto e fornire una portata del 2% di sevoflurane per mantenere l'anestesia. Verificare la mancanza di risposta a un pizzico di punta.
  4. Utilizzare un unguento di protezione degli occhi per prevenire l'essiccazione corneale e danni.
  5. Monitorare l'animale in anestesia generale come segue: Posizionare un termometro rettale (35,9–37,5 gradi C), controllare il colore della membrana mucosa e posizionare un ossimetro a impulsi del roditore per verificare la saturazione Di2 (>95%) frequenza cardiaca (250-450 bpm).
  6. Utilizzare un supporto termico (pastiglie di riscaldamento elettrico o coperte d'acqua circolanti) per evitare l'ipotermia e migliorare il recupero dell'anestesia post-procedurale.
  7. Iniettare 5 mL di soluzione salina fisiologica sottocutanea calda per mantenere una corretta idratazione.
  8. Fornire antibiotici analgesici e antinfiammatori (meloxicam 1 mg/kg/giorno) e antibiotici profilattici (enrofloxacin 7,5 mg/kg/giorno) sottocutanea prima della procedura e per 5 giorni postoperatori.
  9. Rasare le aree addominali e inguinali dell'animale.
  10. Applicare il povidone-iodio topico, seguito dal 70% di etanolo. Coprire l'animale con un drappo sterile.

2. Chirurgia modello flap pelle gratuita

  1. Utilizzando un marcatore chirurgico, disegnare un lembo di 3 cm x 6 cm che corrisponda a uno dei lati di 6 cm con la linea mediana dell'addome. Successivamente, fare un'incisione della pelle di 6 cm alla linea mediana dell'addome e due incisioni perpendicolari di 3 cm nella parte superiore e inferiore dell'incisione mediana di 6 cm.
  2. Per iniziare a sezionare il lembo della pelle di 3 cm x 6 cm, utilizzare le forbici e le pinze Adson per sollevare il lembo (piuttosto che un bisturi) a causa della mobilità della pelle.
  3. Tirare delicatamente il lembo dall'area cranica verso l'area caudale per aiutare con la dissezione e identificare il pedicolo epigastrico circondato dall'abbondante tessuto connettivo sciolto.
  4. Dissezionare il piedicle del lembo senza toccarlo o afferrando l'avventizione il meno possibile per evitare di danneggiare la parete del vaso.
  5. Utilizzare suture di nylon 8/0 per occlude per legature i vasi femorali caudali prossimali, vasi femorali circonflli laterali e vasi saphenous. Di seguito, la perfusione del lembo è fornita dall'arteria femorale e continua direttamente attraverso l'arteria epigastrica caudale superficiale, mentre il drenaggio venoso viene eseguito dalla vena epigastrica caudale superficiale verso la vena femorale.
  6. Bloccare il pedicolo vascolare e poi tagliarlo per iniziare il periodo di ischemia 8 h. Durante la procedura utilizzare coperte elettriche per mantenere la temperatura. Due iniezioni da 5 ml di soluzione salina calda (25oC) 0,9% sono somministrate sottocutaneamente. La prima somministrazione viene eseguita 2 h dopo l'inizio della procedura; e il secondo alla fine della procedura per ottenere un adeguato recupero dell'animale.
  7. Utilizzare la soluzione salina eparinizzata (100 U/mL) per perfondere il lembo e rimuovere il sangue stagnante dalla microcircolazione.
  8. Utilizzare suture di nylon 10/0 per eseguire le anastomosi microchirurgiche.
  9. Dopo 8 h di ischemia, reperfusione il lembo rimuovendo i morsetti microvascolari e controllare la patenza vascolare come descritto di seguito.

3. Valutazione intraoperatoria

  1. Eseguire un test di papotenza manuale (vuoto e test di ricarica) per la vena e l'arteria. Per fare questo, utilizzare due pinze microchirurgiche, posizionarle a distale all'anastomosi ed eseguire la mungitura. Rilasciare prima le pinze più vicine al sito di anastomosi. Se il flusso sanguigno continua dopo lo svuotare una sezione vascolare, allora l'anastomosi è brevetto.
  2. Valutare il flusso sanguigno utilizzando un flowmetro ad ultrasuoni a tempo di transito e sonde microchirurgiche.
    1. Misurare il diametro dei vasi di pedicle al fine di scegliere la dimensione corretta per le sonde di flusso.
      NOT: Una sonda di flusso da 0,7 mm può misurare vasi che vanno da 0,4 mm a 0,7 mm; una sonda di flusso da 1,0 mm può misurare vasi che vanno da 0,7 mm a 1,0 mm; una sonda di flusso da 1,5 mm può misurare recipienti che vanno da 1,0 mm a 1,5 mm.
    2. Posizionare il recipiente bersaglio nella finestra di rilevamento ad ultrasuoni (tra il riflettore e il trasduttore) della sonda di flusso per quantificare il volume di flusso.
      NOT: Tenere la sonda neutra al piano della nave, per evitare qualsiasi tensione o trazione.
    3. Controllare la qualità dell'accoppiamento acustico osservando che tutte le barre sono verdi sul display.
      NOT: Se è difficile ottenere un buon accoppiamento acustico, utilizzare il gel ad ultrasuoni o la soluzione salina fisiologica topicamente.
    4. Quando si raggiunge un buon accoppiamento e la nave viene posizionata nella finestra acustica senza alcuna tensione, fare clic sul pulsante Registra sul display per memorizzare i dati.
      NOT: Per ottenere una misurazione affidabile e corretta, assicurarsi che il modello di forma d'onda sia costantemente ripetibile.
  3. Una volta fatto, utilizzare l'acido poliglicolico (PGA) 4-0 aspirazioni intrecciate assorbibili (16mm 3/8 ago triangolare) per chiudere la pelle. Utilizzare un semplice modello interrotto per mantenere la forza e la posizione del tessuto se parte della sutura viene morsa dal ratto postoperatorio.
  4. Valutare la microcircolazione del lembo utilizzando l'analisi del contrasto di macchie laser (LASCA).
    1. Effettuare una nuova registrazione per ogni animale e per ogni follow-up dello studio. A tale scopo, fare clic su File/Nuova registrazione. Si apre una nuova finestra e viene visualizzato il pannello di configurazione. Modificare quindi le informazioni relative al nome del progetto, all'oggetto, all'operatore e al nome della registrazione.
    2. Per la massima riproducibilità, standardizzare i seguenti parametri: distanza di lavoro, area di misurazione, densità in punti, frequenza fotogrammi e condizioni di luce ambientale.
      1. Regolare la distanza di lavoro spostando il laser in relazione al tessuto. Ingrandire o ridurre la testa del laser verso il tessuto di interesse. Per verificare il valore misurato, fare clic su Impostazione immagine. Qui, impostato a 12,0 cm.
      2. Standardizzare l'area di misurazione immettendo la larghezza e l'altezza desiderate in Impostazioni immagine. Il lembo progettato misura 3 cm x 6 cm. Per questa misura, selezionare una larghezza di 4,0 cm e un'altezza di 7,0 cm per avere un po 'di spazio in più.
      3. Impostare la densità del punto su alta in Imposta immagine. Alto, medio e basso sono le tre opzioni.
    3. Al momento dell'impostazione acquisizione immagine, selezionare la Frequenza fotogrammi (10 immagini/i) per la registrazione e la durata (1 min) della registrazione.
      NOT: Avere la stessa condizione di luce ambientale nella sala operatoria durante l'esecuzione o l'esecuzione delle valutazioni.
    4. Fare clic sul pulsante Registra per avviare la registrazione. Il pannello di configurazione viene sostituito dal pannello di registrazione. I dati vengono salvati automaticamente. Creare istantanee durante la procedura per consentire un ulteriore confronto.
      NOT: La scala di perfusione può essere modificata per migliorare la visualizzazione (fare clic su Strumenti Filtri e scale di colori Scala di perfusione Manuale 0 - 150), ma i valori di perfusione misurati non saranno influenzati. Prima e dopo la registrazione, è possibile creare diverse regioni di interesse (ROI) per misurare la perfusione al loro interno. Qui, abbiamo valutato solo l'area del lembo praticato (3 cm x 6 cm).
  5. Utilizzare il software ImageJ per misurare la sopravvivenza e le aree di necrosi.
    1. Individuare un righello sul lato del lembo e quindi scattare foto di controllo per le misurazioni macroscopiche dell'area di sopravvivenza del lembo.
    2. Per valutare le immagini, aprire l'interfaccia utente ImageJ. Fare clic su File e aprire l'immagine da misurare.
    3. Selezionare Linea retta nella casella degli strumenti e disegnare una linea retta su 1 cm del righello. Fare clic su Analizza Impostare Scala e introdurre nella casella di testo per la distanza nota il valore di 1 cm.
    4. Fare clic sullo strumento Selezione poligono e disegnare le linee del poligono sul lembo per calcolare l'area vitale. In definitiva, fare clic su Analizza Misurare per ottenere il valore dell'area.
  6. Posizionare una medicazione postoperatoria sull'animale prima dell'alloggiamento per prevenire l'automutilazione dell'area chirurgica. Al termine delle procedure, gli animali vengono alloggiati in gabbie singolarmente, in una stanza con controllo della temperatura (da 22 a 25 gradi).

4. Valutazione postoperatoria e campionamento dei tessuti

  1. Anestesizzare il ratto a 7 giorni postoperatori per la valutazione del lembo e il campionamento dei tessuti seguendo gli stessi passaggi descritti in precedenza in questo protocollo (passaggi 1.2 e 1.3). Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di risposta al pizzico della punta.
  2. Fotografare l'area chirurgica per consentire misurazioni macroscopiche delle aree di sopravvivenza e necrosi del lembo. Effettuare le misurazioni macroscopiche postoperatorie seguendo gli stessi passaggi della valutazione intraoperatoria che sono stati spiegati in precedenza nel protocollo (passaggio 3.5).
    NOT: Prestare attenzione durante l'utilizzo dello strumento Selezione poligono disegnando le linee sul lembo delimitando l'area vitale (misurata in cm2). La percentuale dell'area vitale può essere calcolata come (cm2 dell'area vitale/cm2 dell'area totale del lembo) - 100.
  3. Valutare la microcircolazione del lembo utilizzando la tecnica LASCA (passaggio 3.4) per visualizzare e quantificare le differenze di perfusione
  4. Dopo l'analisi macroscopica, rimuovere le suture 4/0 e salire il lembo per rivalutare il flusso sanguigno del pedicolo vascolare utilizzando l'ecografia del tempo di transito.
  5. Eseguire il campionamento dei tessuti longitudinalmente dividendo il lembo in due parti di 1,5 cm x 6 cm.
    1. Immergere una parte in un contenitore di biopsia con 4% di paraformaldeide a temperatura ambiente per ulteriori analisi istologiche.
    2. Introdurre l'altra parte del tessuto in un tubo di crioconservazione, immergerlo in azoto liquido e poi crioconservare il tubo conservandolo a -80 gradi centigradi per future analisi molecolari.
  6. Eutanasia del ratto in anestesia di inalazione generale utilizzando una rapida iniezione intracardiaca di 2 M KCl/kg secondo le raccomandazioni del comitato etico.

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Representative Results

Subito dopo la creazione delle anastomosi microchirurgiche, abbiamo ottenuto volumi di flusso sanguigno più elevati rispetto ai flussi minimi raccomandati nella letteratura8; pertanto, tutte le anastomosi microchirurgiche sono state brevettate 1 settimana dopo l'intervento chirurgico (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Valutazione del flusso sanguigno ad ultrasuoni in tempo di transito. (A) Posizione della sonda a flusso microchirurgico per valutare il flusso sanguigno. (B) Modello di flusso sanguigno e quantificazione ottenuti dei vasi anastomominati del pedicle del lembo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'osservazione della privazione microcircolatoria del flusso sanguigno durante l'insulto ischemico era possibile con la tecnica LASCA, compresa l'iperperfusione immediata durante la riperfusione del lembo, e, perioperatoriamente, le diverse aree con meno perfusione e un rischio più elevato di necrosi lembale postoperatoria che sono state effettivamente necrotizzate 7 giorni dopo la fine dello studio (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Tecnologia di analisi del contrasto delle macchie laser. (A) Visualizzazione della perfusione di sangue del tessuto microcircolatorio nella condizione fisiologica. (B) Visualizzazione della perfusione di sangue del tessuto microcircolatorio durante l'ischemia. (C) Visualizzazione della perfusione di sangue del tessuto microcircolatorio immediatamente dopo la riperfusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'area di sopravvivenza del lembo dopo 8 ore di ischemia e la sua successiva riperfusione era di circa il 40%. I risultati pubblicati in precedenza9 hanno mostrato differenze statisticamente significative quando questo modello è stato confrontato con lembi in cui non è stato inflitto alcun insulto ischemico.

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Discussion

I trasferimenti di tessuto libero microchirurgico sono diventati il metodo di scelta per ricostruire grandi difetti. Un periodo di ischemia si verifica durante tali trasferimenti di tessuto liberi. Quando questo periodo supera la tolleranza del tessuto, le lesioni I/R possono causare il fallimento del lembo libero praticato9. La descrizione della metodologia per sviluppare un modello preclinico economico e traslazionale per studiare le lesioni I/R nella microchirurgia ricostruttiva può aiutare a condurre lo studio di diversi composti per contrastare questo processo patofisiologico.

Nel modello animale descritto, dopo che le legature vascolari sono state posizionate e il lembo libero è stato sollevato, non sono stati rilevati compromessi sul flusso sanguigno dell'arto posteriore, né dolore o zoppicare. Come descritto da Kochi et al.10, il nostro modello ha anche lasciato tre percorsi collaterali attraverso reti intramuscolari.

Il monitoraggio dei lembi liberi è di grande importanza11, in quanto il recupero è inversamente correlato alla durata tra l'insorgenza dell'ischemia e il suo riconoscimento clinico. A tale scopo, i lembi gratuiti devono essere studiati inmodo e postoperatorio.

Intraoperatoriamente, il test vuoto e di ricarica ampiamente utilizzato o il Doppler acustico consentono l'identificazione ma non la quantificazione della presenza o dell'assenza del flusso attraverso un anastomosi12. Per questo motivo, abbiamo usato la tecnologia ecografica del tempo di transito, un nuovo metodo che permette ai chirurghi di quantificare il flusso sanguigno delle anastomosi microchirurgiche13. Nel nostro studio, tutte le anastomosi microchirurgiche sono state brevettate dopo 8 h di insulto ischemico così come alla fine dello studio. Subito dopo la creazione delle anastomosi microchirurgiche, abbiamo notato volumi di flusso sanguigno più elevati rispetto ai minimi raccomandati nella letteratura8. Questo predisse una buona perfusione del pedicle alla fine dello studio, dimostrando che i risultati non sono stati influenzati dalla tecnica microchirurgica, ma piuttosto dalla cascata di lesioni I/R degli eventi. Tuttavia, questa tecnica non è priva di limitazioni. Per ottenere risultati affidabili, le sonde microchirurgiche devono essere tenute neutre al piano della nave, non tirandolo o creando alcuna tensione. Un buon accoppiamento acustico è necessario per ottenere un segnale adeguato, che può essere ottenuto utilizzando gel ad ultrasuoni o salina. Un segnale di accoppiamento di alta qualità, fornito dall'apparecchiatura, è un parametro importante da considerare durante le misurazioni.

Abbiamo usato LASCA, noto anche come imaging a contrasto di macchie laser o imaging a macchie laser, postoperatorio14. Questa tecnologia rappresenta una tecnica preziosa per la mappatura semi-quantitativa in tempo reale del flusso all'interno dei lembi liberi come verificato qui. Una delle limitazioni è che i risultati vengono forniti in unità arbitrarie e non direttamente correlati ai valori di flusso effettivi. In questo senso, sono necessarie ulteriori ricerche per convalidare questa correlazione. La flowmetria di Doppler laser è più comunemente utilizzata ma limitata dal fatto che misura la perfusione solo in un singolo punto del lembo, mentre LASCA consente di rilevare i cambiamenti regionali nella perfusione cutanea all'interno del lembo15. Inoltre, un recente studio16 ha indicato che LASCA può prevedere perioperatoriamente le regioni ad alto rischio di necrosi del lembo postoperatorio. I nostri risultati suggeriscono che LASCA è una tecnica promettente per il monitoraggio peri- e postoperatorio di lembi liberi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il progetto di ricerca è stato eseguito presso il Centro di Chirurgia Minimamente Invasiva (CCMIJU), parte dell'ICTS Nanbiosis. Lo studio è stato condotto con l'assistenza delle seguenti unità Nanbiosis: U21, sala operatoria sperimentale; U22, alloggiperi per animali; e U14, terapia cellulare. Questo lavoro è stato supportato dal progetto ISCIII PI16/02164. Il funder non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamenti speciali si estende a Maria Pérez per aver preparato le figure e a Fernanda Carrizosa per aver incoraggiato costantemente e sostenuto la bibliografia scientifica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AureFlo Unit Transonic (Ithaca, USA) N/A Transit-time ultrasound flowmeter equipment
Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) S&T AG (Neuhausen, Switzerland) RHR-SET. Art.No.00795 Set of microsurgical instruments
FLOW-i Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) N/A Anesthesia Delivery System
Micro clamps ABB-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00408V Double microvascular clamp with frame
Micro clamps ABB-11 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00414V Double microvascular clamp without frame
Micro clamps B-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00396V Sigle microvascular clamp
Nylon suture 10/0 Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) 19921 Microsurgical suture
OPMI Pentero 800 Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) N/A Surgical microscope
PeriCam PSI System Perimed AB (Järfälla, Sweden) N/A Laser speckle contrast analysis equipment
Philips Intellivue MX450 Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) N/A Monitoring system
Protector posoperatorio para roedores Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) P201400272 Postoperative protector for rodents

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