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比较在小鼠肾脏和鸡胆膜上建立的转移性透明细胞肾细胞癌模型

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

转移性透明细胞肾细胞癌是一种没有全面动物模型进行彻底临床前调查的疾病。该协议说明了该病的两种新型动物模型:正位植入小鼠模型和鸡胆膜模型,这两种模型都显示了类似临床病例的肺转移。

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Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).

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Abstract

转移性透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是肾癌最常见的亚型。本地化的ccRCC有良好的手术效果。然而,三分之一的ccRCC患者会发展为肺部转移,这与患者的不良结果有关。不幸的是,这个致命的阶段没有可用的治疗,因为转移的分子机制仍然未知。25年来,人们一直知道,冯·希佩尔-林杜(VHL)肿瘤抑制基因的功能丧失是ccRCC的病理性腺体。然而,尚未生成与临床相关的ccRCC转基因小鼠模型。该协议的目的是介绍和比较两个新建立的动物模型转移ccRCC。第一种是小鼠模型中的肾脏植入。在我们的实验室中,CRISPR基因编辑系统用于敲除多个RCC细胞系中的VHL基因。异质ccRCC种群的正交体植入肾脏胶囊创造了新的ccRCC模型,在免疫能力小鼠中形成强健的肺转移。第二个模型是鸡胆膜(CAM)系统。与鼠标模型相比,该模型更具有时间、更劳动、更经济性。该模型还支持强健的肿瘤形成和内脉化。由于CAM的肿瘤生长期短10天,免疫组织化学(IHC)在采集的胚胎组织中未观察到任何未出现转移。然而,当孵化鸡的肿瘤生长延长两周时,IHC在肺部观察到微转移性ccRCC病变。这两种新颖的临床前模型将有助于进一步研究转移背后的分子机制,以及建立新的患者衍生异种移植物(PDXs),以开发转移性ccRCC的新疗法。

Introduction

肾细胞癌(RCC)是美国第7大常见癌症。据估计,每年有74,000名美国人被新诊断,占14,000多人死亡(透明细胞组织学亚型,或ccRCC,是最常见的亚型,约占RCC病例的80%。局部恶性肿瘤患者接受肾切除术治疗,5年生存率为73%1。然而,25%-30%的患者发展到肺部等重要器官的远转移,导致13个月的平均存活率低,5年生存率仅为11%,1,2,3。需要进一步了解转移机制,以改善转移性ccRCC的致命结果。

VHL肿瘤抑制基因的丧失是大多数人类ccRCC病例4、5、6、7中观察到的一种特征遗传病变。然而,ccRCC中VHL损失的精确致癌机制尚不得而知。此外,VHL 表达式状态不能预测 ccRCC8中的结果。值得注意的是,尽管多次尝试肾上皮靶向VHL敲除,科学家未能产生肾脏异常,超越在小鼠9观察到的前皮性囊肿病变,即使结合删除其他肿瘤抑制剂,如PTEN和p5310。这些发现支持了这样一种观点,即仅VHL损失不足以进行肿瘤发生或随后的自发转移。

最近,我们的实验室使用CRISPR/Cas9介导的VHL基因在鼠VHL®ccRCC细胞系(RENCA,或VHL-WT)11、12中,创建了一个新的VHL挖空(VHL-KO)细胞系。研究表明,VHL-KO不仅是位位,而且促进VHL-WT细胞12的上皮到中位过渡(EMT)。众所周知,EMT在转移过程中起着重要的作用13。我们的工作进一步表明,距离性肺转移只有在肾脏中共同植入VHL-KO和VHL-WT细胞时才会发生,支持转移的合作机制。重要的是,我们的正位植入VHL-KO和VHL-WT模型导致强大的肺转移,重述临床ccRCC病例。这种自发转移ccRCC模型弥补了转基因转移小鼠模型的不足,特别是在新型抗转移药物的开发中。该协议演示了遗传工程RENCA细胞异质细胞群的肾胶囊植入。

鸡CAM模型在血管生成和肿瘤生物学的研究有很长的历史,由于其众多的优势,总结在表114,15,16,17,18。简单地说,CAM肿瘤生长的时间窗口很短,允许最多11天,直到CAM在孵化鸡16时被破坏。尽管生长时间短,鸡胚胎丰富的营养供应和免疫缺陷状态使非常有效的肿瘤移植16,19,20,21。最后,每个受精卵的成本为 1 美元,而 SCID 小鼠的成本超过 100 美元。与鼠标相比,CAM 模型可以一起作为建立新 PDX 的宝贵替代动物模型,在时间和成本上节省大量成本。在此协议中,我们评估了该模型是否能够重述在小鼠正交模型中观察到的转移性ccRCC生物学。

(SCID)鼠标 凸轮 注意
成本 >$100 每个 每人 1 美元 生存能力从50-75% 不等
需要屏障住房 是的 进一步降低成本和简化肿瘤的序列监测
肿瘤直接可见 是的 图 3A
第一次移植的时间(RENCA) 2 周 2-4天 参考 14, 15
增长终点(RENCA) 3-6 周 10 天 参考 14, 15
观察到的转移(RENCA) 是的 是,在小鸡 图 3D
串行通道 是的 是的 参考 16-18
传给老鼠(RENCA) 是的 是的 胡先生等人正在审查(2019年)
维持肿瘤异质性 是的 是的 胡先生等人正在审查(2019年)

表1:鼠标和CAM型号的优点和局限性。此表比较了两种模型在所需时间、成本、人工和生物学方面的优势和局限性。CAM模型在效率上有优势,但由于鸟类和哺乳动物之间的形态不同,它也有其独特的局限性。因此,确认该模型可以保留异种移植物的生物学性非常重要。

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Protocol

此处描述的所有方法均获得被指定为加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会 (ARC) (ARC 2002-049-53 和 ARC 2017-102-01A) 的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。2002-049-53 协议针对将 ccRCC 肿瘤细胞植入裸体或 BALB/c 小鼠的肾胶囊进行了优化。孵化前在受精鸡蛋中进行肿瘤植入实验不需要IACUC批准。为了延长肺转移的建立时间,允许带有CAM肿瘤的胚胎孵化和成长为鸡。2017-102-01A 协议涵盖这些动物实验。

1. 小鼠正交肿瘤研究

注:此实验的时间线如图 1 A所示。这些程序是从以前的出版物11,12改编。

  1. 准备用于移植的单细胞悬浮液
    1. 使用胰蛋白酶/EDTA将RENCA VHL-WT和VHL-KO细胞从培养皿中分离。
    2. 用血细胞计对细胞计数,并在PBS和细胞外基质溶液的预冷却1:1混合物中重新悬浮,浓度为1 x 105细胞/μL。
      注:对异质植入物使用1:4比的VHL-WT:VHL-KO细胞,对同质植入物单独使用VHL-WT。
    3. 将悬浮细胞转移到1.5 mL微离心管中,并保持在冰上,直到植入。
  2. 植入到肾胶囊
    1. 麻醉:将暖垫预热至37°C,用一块厚厚的无菌窗帘覆盖。通过诱导室吸入的肌鲁兰吸入或注射1%的五巴比妥钠(IP),剂量为10 mL/kg,对小鼠进行麻醉。
    2. 从手术部位洗头发。对于裸鼠,可以跳过此步骤。
    3. 消毒和手术拖曳:用波维多-碘3x彻底消毒小鼠的背部,然后用70%乙醇1x,并用无菌棉签擦干。然后依次应用三种无菌医疗敷料,覆盖整个背部,以创建一个手术场,以及固定小鼠。
    4. 切口和肾脏外在:手术前,用化碘消毒操作者的手指或使用一副无菌手套。将鼠标放在易发位置,用手指在左侧侧翼下定位左肾右。使用一对钝钳和剪刀将皮肤切开,肌肉层在指定位置下。使用无菌棉签和钳子将左肾部分外向腹部外。
    5. 肿瘤细胞植入:将步骤1.1中制备的细胞悬浮液装入胰岛素注射器或定制的汉密尔顿注射器中(有关规格,请参阅材料表)。在肾胶囊下注射20μL的再悬浮细胞。
      注:成功的注射取决于肾脏表面形成半透明凸起。意外注射到肾气肿导致出血和术后死亡率高达90%由于注射部位的致命出血。
    6. 慢慢拔出针头,使细胞外基质溶液凝固,防止出血或肿瘤细胞渗漏。然后,使用无菌棉签,将肾脏推回腹部。
    7. 伤口缝合:使用5-0涂层VICTRYL缝合肌肉层。用小碘消毒一次皮肤,用伤口自动夹住皮肤。
    8. 恢复:将鼠标放在暖垫上,直到唤醒。如果小鼠通过吸入麻醉,取出胶质,并将鼠标放在温暖的垫子上,直到它清醒。
  3. 生物发光成像 (BLI) 和组织收集
    1. 肿瘤植入六周后,拍摄萤火虫-荧光素酶基BLI图像。然后用异苯可勒子的安乐死小鼠,然后进行宫颈脱位。
    2. 通过流动细胞测定收集血液进行循环肿瘤细胞(CTC)检测。
    3. 使用无菌组织采集技术22收获肿瘤和感兴趣的器官(肾脏、肺、肝脏、肠道和脾脏)。将它们固定在4%的甲醛过夜石蜡嵌入。

2. CAM肿瘤异种移植模型

注:这些程序是从先前公布的第23、24条中修改和修改的。此过程的时间线如图1B所示。本文仅介绍简化的协议。有关详细的协议,请参阅我们组25发表的另一篇 JoVE 文章。

  1. 预孵育:在37°C和55-65%湿度的旋转蛋孵化器中孵育新鲜产下的受精卵7天。
  2. 放下 CAM 并打开窗口(开发日 7):
    1. 找到并标记气囊和静脉。
      注:通常10-15%的卵子被取出,因为它们要么未受精,要么在受精后7天内死亡。
    2. 在标记的静脉之上创建一个新的气囊。
    3. 划定新的气囊,涂上包装胶带,将卵子放回孵化器。
      注: 可以在此处暂停该过程。建议在同一天内恢复程序,因为气囊可能会移动。
    4. 打开一个窗口:使用一把弯曲的微解剖剪刀和一对针鼻钳,在外壳中切割一个1.5 x 1.5厘米的圆形窗口。
      注: CAM 的中断由血液和切割壳片上的一块 CAM 表示。
    5. 用透明的医用敷料密封孔,并将鸡蛋置于37°C和55%-65%湿度的固定培养箱中。
      注:使用步骤 2.1 中相同的卵孵化器。关闭旋转器使其静止。
  3. 健康检查(发育日9):取出死卵,然后随机分组肿瘤细胞植入的卵子的其余部分。
    注:理想情况下,此时的存活率约为发育日 0 的 80%。
  4. 将肿瘤细胞移植到新暴露的CAM上(发育日10)
    1. 将细胞外基质溶液稀释至预冷却RPMI 1640体积的两倍(使用L-谷氨酰胺)。分离RENCA细胞并重新悬浮在上述溶液中,达到2 x 104细胞/μL的浓度。
      注:对异质植入物使用1:1的比例VHL-WT:VHL-KO细胞,单独使用VHL-WT进行均匀植入。
    2. 要预固化细胞悬浮液,请用200μL移液器吸头填充每个细胞混合物的100μL,并将其放入细胞培养箱中15分钟。
    3. 通过窗口在 CAM 表面上为每个卵子植入 100 μL 的细胞悬浮液。
      注:某些协议要求在植入23之前刮伤CAM。对于RENCA细胞来说,这是没有必要的,因为它们生长得非常快。
  5. 在 CAM 上生长 10 天,每 2 天拍摄一次。
  6. 安乐死和收获肿瘤,血液和器官。
    1. 在发育日20日(肿瘤第10天),通过胆囊静脉用肝素化10 mL注射器采集血液。
    2. 将胚胎放在冰上15分钟,使胚胎安乐死。
    3. 收获和称量肿瘤。使用无菌组织采集技术切除肺部和肝脏,类似于小鼠22。
      注:鸡肝有两个叶,这是在腹腔中看到的第一个器官。不要混淆这些与肺部。鸡肺位于心脏和隔膜26下。肺的成功收集可以通过暴露的肋骨来证实。
    4. 修复肿瘤和解剖器官在4%甲醛过夜石蜡嵌入。
  7. 孵化鸡。
    1. 为了延长肿瘤的生长期,在第21天继续孵育,让鸡在37°C和至少60%的湿度孵化。
      注意:鸡自然孵化后21天在24小时的时间,但偶尔有自己孵化困难。在这种情况下,破解蛋壳有些帮助。鸡在24小时内完成孵化过程很重要,因为之后它们会因缺乏营养而死亡。
    2. 在动物设施(2017-102-01A)中饲养鸡2周。
    3. 在发育第34天(肿瘤第24天),用异胶吸入对小鸡实施安乐死,然后进行宫颈脱位。
    4. 使用无菌组织采集技术切除肺部,类似于小鼠22使用的无菌组织采集技术。然后,将它们固定在4%的甲醛过夜石蜡嵌入。

3. 免疫性化学

注:所有组织切片和H&E染色均由加州大学洛杉矶分校的转化病理学核心实验室(TPCL)完成。

  1. 在65°C下烘烤20分钟,使用二甲苯将3倍脱氧乙烷,然后从100%乙醇连续再水化为水。
  2. 在蔬菜蒸蒸机中煮25分钟的酸盐缓冲液中取回抗原。
  3. 应用 1% BSA 进行阻塞。然后应用在PBS中以1:200稀释比制备的初级抗体(抗VHL、抗HA、抗旗)。在4°C下孵育过夜。
  4. 使用TBST洗涤3次后(每次7分钟),在1:200稀释时用二级抗体孵育幻灯片。用TBST洗涤3次(每次7分钟),然后涂抹DAB试剂,然后进行血氧素反染色。

4. 流动细胞测定

  1. 根据制造商的协议,用红血球(RBC)利沙缓冲液处理小鼠或鸡血。
    注: 足够的RBC裂核在分析CAM血液时尤其重要,因为鸡红细胞是成核的,不能使用正向和侧面散射在流式细胞测量中轻易区分。
  2. 在血液流源上运行流细胞测定法,并分析m草莓和EGFP表达的数据。
  3. 根据前向和侧面散射设置主门,不包括碎屑、死细胞和未解的 RBC。
  4. 根据未染色的样品和单染色控制装置设置荧光门。分别使用VHL-WT、VHL-KO或未标记的RENCA细胞作为单染色对照组和无染色对照组的血液解结物。

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Representative Results

除非另有说明,否则每个实验至少进行3次。数据以均值 = 标准差 (SD) 的形式显示。当有两个组时,由配对的学生 T 测试或三个或更多组时的单向 ANOVA 确定显著性。使用 0.05 的 p 值截止来确定显著性。

正位植入的RENCA细胞在小鼠肾脏上成功生长,经BLI和H&E染色(2A-B)证实。虽然原生生长没有差异,但只有异质转移性肿瘤对肺部有强健的转移,如H&E染色中非常强烈的BLI信号和转移结节所示。另一方面,同质、非转移性肿瘤没有转移至遥远的器官。患有转移性肿瘤的小鼠的CTC计数高于那些患有非转移性肿瘤的小鼠(2C-D)。

与小鼠模型一致,CAM系统成功地保留了RENCA肿瘤的生长和转移行为。虽然转移性肿瘤和非转移性肿瘤之间没有生长差异,但转移性肿瘤的卵子中的CTC计数明显高于非转移性肿瘤的卵子(图3A-C)。用CAM肿瘤孵化卵子,让小鸡再长两周,延长转移性癌细胞在鸡肺中建立组织可检测转移的周期,如鸡肺组织部分的H&E和HA染色所示(3D)。大多数转移性结节由HA标记的VHL-WT细胞组成,而标记标记的VHL-KO很少出现,正如我们在小鼠身上观察到的。

Figure 1
图1:转移性ccRCC异种移植的两种动物模型概述。A) 小鼠正交模型的原理表示。3周或4周大的小鼠被正射植入非转移性或转移性肿瘤。植入六周后,肿瘤生长和转移被形象化与BLI。然后,采集肿瘤、血液和器官进行下游分析。(B) CAM 模型的架构表示,显示以下步骤:孵育前、窗口打开、细胞植入和孵化前后的安乐死。对收集的样本进行与小鼠模型相同的分析。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:正交植入小鼠的肿瘤生长和转移。A) 小鼠和提取器官(肾、肺、肝、肠、脾)在RENCA细胞正交后6周起的BLI。左:非转移性(非满足),右侧:转移。(B) 肾脏和肺(20x和100x)H&E染色的毛视图和放大倍率增加。左:非转移性(非满足),右侧:转移。(C) 代表流量分析,用于检测在血液中循环的 mStraw® 和 EGFP® 细胞。(D) 循环 mStraw® 和 EGFP® 细胞的百分比总体图。非相遇:非转移性。A小组改编自胡等人27日。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:CAM模型中的肿瘤生长和转移。A) 在 CAM 中生长的 RENCA 肿瘤.每组重复 7 次。非相遇:非转移性。(B) 代表流量分析,用于检测在血液中循环的 mStraw® 和 EGFP® 细胞。(C) 循环 mStraw® 和 EGFP® 细胞的百分比总体图。\p < 0.01.(D) 在胚胎阶段,一只患有转移性肿瘤的2周大小鸡的肺部IHC染色。从左至,这些部分显示 H&E、HA 和标志染色。*:鸡肺动脉;箭头:转移结节。这个数字是胡J等人27日改编的。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

对于许多上皮恶性肿瘤患者来说,转移到重要器官是导致死亡的主要原因。因此,必须找到转移性疾病的基本机制和新的治疗途径。不幸的是,缺乏相关的转移ccRCC动物模型。挑战在很大程度上是由于无法在小鼠中重现ccRCC,尽管生成了无数转基因肾上皮靶向VHL淘汰小鼠模型9,10。在这里,我们演示了在小鼠和鸡CAM两个动物系统中建立可植入转移性ccRCC肿瘤的方法。这些发现验证了肿瘤在两种不同环境中的转移行为,从而为进一步研究转移的分子机制提供了独特的机会。在第一个模型中,异质RENCA群体被植入免疫能力小鼠正射到他们的肾胶囊。6周后,这些小鼠表现出猖獗的肺转移。与小鼠模型一致,在CAM上植入异质RENCA细胞成功生长,并植入小鸡胚胎的血液中。通过将肿瘤生长期延长到孵化后的2周,在小鸡体内观察到类似小鼠的肺转移。

对于这两种模型,仔细注意每个步骤的技术细节和实践,以提高技术技能是提高动物生存和成功的肿瘤移植和转移的关键。对于小鼠模型,仔细选择设备和准确地将肿瘤细胞注射到肾脏胶囊,通过降低术后死亡率和增加肿瘤获得足够的血液供应的机会来最大化成功率,转移。CAM 模型需要在设置和技术方面进行更多优化。在我们的研究中,胚胎的存活率在开始时低于30%。拥有良好的设备、频繁的监控和更快的程序完成,使温度和湿度始终保持在所需的水平非常重要。即使在优化后,生存率范围为50-75%,取决于实验者和单个批次的卵子。建议始终订购额外的鸡蛋作为备份。根据我们的经验,掌握 CAM 技术需要 1 年以上。放下CAM膜并打开窗户是胚胎最常发生意外致命损伤的关键步骤。通过防止对CAM的损害,可以改善小鸡胚胎的生存能力。

CAM 肿瘤模型有几个限制。首先,该模型适用于所有肿瘤细胞类型。我们在CAM上移植了不同的既定肿瘤细胞系,包括肾脏、膀胱和前列腺肿瘤细胞系(RENCA、ACHN、T24、HT1376、CWR22Rv1、C4-2、Myc-CaP)和卵巢癌细胞系(ID8和SKOV3),成功率为100%。我们小组的两项额外研究提供了关于这些CAM肿瘤25,27的进一步信息。然而,CAM上一些卵巢癌细胞的生长是通过补充生长因子或肿瘤相关细胞25而增强的。优化每个细胞系或类型的细胞数或基本生长因子非常重要。我们还纳入了报告者或标记基因,如荧光素酶、蛋白质标签(如HA或标志)或荧光标记(例如,mStrawberry或EGFP),以方便监测动物肿瘤的生长和转移25、27。根据我们的经验,大部分增殖癌细胞系都可以在CAM上建立。移植的一个关键限制可能是肿瘤生长允许的短10天窗口,这对生长缓慢的细胞系在如此短的时间内建立足够的质量可能特别具有挑战性。

CAM模型的另一个缺点是鸟类胚胎和哺乳动物在生理上的差异。从CAM肿瘤转移到主要器官,如胚胎的肝脏或肺已被检测主要通过敏感的PCR技术28。CAM生长时间短,不足以建立可组织学分析验证的大型转移性病变。此外,未膨胀胚胎肺血管灌注的减少不利于肺转移的生长或支持。为了克服这些限制,我们机构动物使用委员会(IACUC)获得批准,从CAM肿瘤中孵化出鸡,在孵化后再孵化2周。以这种方式延长肿瘤生长时间使我们能够通过IHC检测远肺转移。虽然孵化鸡的研究需要额外的IACUC批准,CAM肿瘤研究没有,这种方法提供了一个宝贵的机会来研究在鸡的转移级联,如以前在小鼠。据报道,鸡的免疫系统从受精的第12天开始发展。鉴于在受精后24、25、27的第10天,在CAM中,移植鼠源RENCA肿瘤和许多其他人类癌细胞系和PDX的高效率,我们可以推断出胚胎中的免疫系统此时尚未完全发育。鸡的免疫系统和CAM肿瘤的相互作用显然值得进一步研究。

我们的工作提供了强有力的支持证据,表明CAM肿瘤模型可能是研究癌症生物学(包括转移)的简单初始在体内模型。由于上述限制,CAM 模型不应取代鼠标模型,而应补充它。我们正在进行的研究表明,在ccRCC的异质细胞群之间的信号串扰有助于控制转移性进展11,12。使用 CAM 和鼠标模型是验证在 ccRCC 中播放的转移性串扰的宝贵方法。我们相信,这里介绍的CAM模型的众多优点可以加快发现新的转移机制和有效治疗,以治疗癌症的致命阶段的步伐。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由加州大学洛杉矶分校JCCC种子赠款、加州大学洛杉矶分校3R赠款、加州大学洛杉矶分校CTSI和UC TRDRP(LW)资助。我们感谢克鲁普研究所的临床前成像设施、TPCL和加州大学洛杉矶分校实验室动物医学部(DLAM)在实验方法方面提供的帮助。流式细胞测量在加州大学洛杉矶分校约翰逊综合癌症中心 (JCCC) 和艾滋病研究流细胞学核心设施中进行,由美国国家卫生研究院颁发 P30 CA016042 和 5P30 AI028697 奖,并由 JCCC、加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所、加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院、加州大学洛杉矶分校校长办公室和加州大学洛杉矶分校副校长研究办公室支持。统计咨询和数据分析服务由加州大学洛杉矶分校CTSI生物统计学、流行病学和研究设计(BERD)计划提供,该计划由NIH/国家促进转化科学中心支持,加州大学洛杉矶分校CTSI授权号UL1TR001881。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning 25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18
anti-VHL antibody Abcam ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD Biosciences 14-826-79
BD Pharm Lyse BD Biosciences 555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826-5D
DAB Chromogen Kit Biocare Medical DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) eBioscience 14-6681-82
Ethanol 200 Proof Cylinders Management 43196-11 Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Fisher Scientific 10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls Fisher Scientific 22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology MilliporeSigma 1.00496.5000
Hamilton customized syringe Hamilton 80408 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11) Santa Cruz Biotechnology sc805
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein Animal Health 1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" Medex Supply MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation MilliporeSigma 2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin Fisher Scientific MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium Sigma Aldrich 57-33-0 Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use Ricca Chemical 395516
pSicoR Addgene 11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC227420500
Renca ATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Corning 10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile Fisher Scientific AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) Thomas Scientific 1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls Office Depot 220717
Suture Ethicon J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 1634
Thermo-Chicken Heated Pad K&H manufacturing 1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017
VHL-KO CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR Fisher Scientific 50-822-331
Wound autoclips kit Braintree scientific, inc. ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical Fisher Scientific X3S-4

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References

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