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Comparaison Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

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JoVE Journal
Cancer Research

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Summary

Le carcinome rénal métastatique de cellules claires est une maladie sans modèle animal complet pour l’investigation préclinique complète. Ce protocole illustre deux nouveaux modèles animaux pour la maladie : le modèle orthotopique ment implanté de souris et le modèle chorioallantoic de membrane de poulet, qui démontrent la métastasis de poumon ressemblant à des cas cliniques.

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Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).

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Abstract

Le carcinome rénal métastatique à cellules claires (ccRCC) est le sous-type le plus commun du cancer du rein. Le ccRCC localisé a des résultats chirurgicaux favorables. Cependant, un tiers des patients de ccRCC développeront des métastases au poumon, qui est liée à un résultat très pauvre pour des patients. Malheureusement, aucune thérapie n’est disponible pour ce stade mortel, parce que le mécanisme moléculaire de la métastes reste inconnu. Il a été connu pendant 25 années que la perte de fonction du gène suppresseur de tumeur de von Hippel-Lindau (VHL) est pathognomonic du ccRCC. Cependant, aucun modèle de souris transgénique médicalement pertinent de ccRCC n’a été produit. Le but de ce protocole est d’introduire et de comparer deux modèles animaux nouvellement établis pour le ccRCC métastatique. La première est l’implantation rénale dans le modèle de souris. Dans notre laboratoire, le système d’édition de gènes CRISPR a été utilisé pour assommer le gène VHL dans plusieurs lignées cellulaires du CCR. L’implantation orthotopique des populations hétérogènes de ccRCC à la capsule rénale a créé de nouveaux modèles de ccRCC qui développent des métastases pulmonaires robustes chez les souris immunocompétentes. Le deuxième modèle est le système de membrane chorioallantoïque de poulet (CAM). Par rapport au modèle de souris, ce modèle est plus de temps, de travail, et rentable. Ce modèle a également soutenu la formation et l’intravasation robustes de tumeur. En raison de la courte période de 10 jours de la croissance de tumeur dans LA MCA, aucune métaste manifeste n’a été observée par immunohistochemistry (IHC) dans les tissus embryonnaires rassemblés. Cependant, quand la croissance de tumeur a été prolongée de deux semaines dans le poulet éclos, les lésions micrométastatiques de ccRCC ont été observées par IHC dans les poumons. Ces deux nouveaux modèles précliniques seront utiles pour étudier davantage le mécanisme moléculaire derrière la métastase, ainsi que pour établir de nouveaux xénogreffes dérivés du patient (PDX) vers le développement de nouveaux traitements pour le ccRCC métastatique.

Introduction

Le carcinome rénal de cellules (RCC) est le7ème cancer le plus commun aux Etats-Unis. Chaque année, on estime que 74 000 Américains sont nouvellement diagnostiqués, ce qui représente plus de 14 000 décès (le sous-type histologique à cellules claires, ou ccRCC, est le sous-type le plus courant, représentant environ 80 % des cas de CCR. Les patients présentant la malignité localisée sont traités avec la néphrectomie et ont un taux de survie favorable de 5 ans de 73%1. Cependant, 25%-30% des patients développent des métastases lointaines aux organes vitaux tels que les poumons, ayant pour résultat une survie moyenne pauvre de 13 mois et le taux de survie de 5 ans de seulement 11%1,2,3. Une meilleure compréhension du mécanisme métastatique est nécessaire pour améliorer les résultats mortels pour le ccRCC métastatique.

La perte du gène suppresseur de tumeur de VHL est une lésion génétique caractéristique observée dans une majorité de cas humains de ccRCC4,5,6,7. Cependant, le mécanisme oncogène précis de la perte de VHL dans ccRCC est inconnu. En outre, le statut d’expression VHL n’est pas prédictif des résultats dans ccRCC8. Notamment, en dépit de nombreuses tentatives à l’élimination de VHL rénal-épithélial-ciblé, les scientifiques n’ont pas réussi à générer l’anomalie rénale au-delà des lésions cystiques preneoplastic observées chez les souris9,même lorsqu’elles sont combinées avec la suppression d’autres suppresseurs de tumeur tels que PTEN et p5310. Ces résultats soutiennent l’idée que la perte de VHL seule est insuffisante pour la tumorigenesis ou la métastasie spontanée suivante.

Récemment, notre laboratoire a créé une nouvelle ligne cellulaire VHL knock-out (VHL-KO) en utilisant CRISPR/Cas9 médiation suppression du gène VHL dans la lignée cellulaire de la murine VHLMD ccRCC (RENCA, ou VHL-WT)11,12. Nous avons montré que VHL-KO est non seulement mesenchymal, mais favorise également la transition épithéliale à la transition mésenchymale (EMT) des cellules DEVH-WT12. EMT est connu pour jouer un rôle important dans le processus métastatique13. Nos travaux ont en outre montré que la métaste pulmonaire éloignée se produit seulement avec la co-implantation des cellules VHL-KO et VHL-WT dans le rein, soutenant un mécanisme coopératif de métastes. Fait important, notre modèle VHL-KO et VHL-WT orthotopiquement implanté mène aux métastases robustes de poumon, récapitulant les cas cliniques de ccRCC. Ce modèle spontané de ccRCC métastatique compense l’absence d’un modèle métastatique transgénique de souris, particulièrement dans le développement de nouveaux médicaments anti-métastases. Ce protocole démontre l’implantation rénale de capsule des populations hétérogènes de cellules des cellules renCA génétiquement modifiées.

Les modèles de CAM de poulet ont une longue histoire dans la recherche pour l’angiogenèse et la biologie de tumeur due à leurs nombreux avantages, comme résumé dans le tableau 114,15,16,17,18. En bref, la fenêtre de temps pour la croissance de tumeur de CAM est courte, permettant un maximum de 11 jours jusqu’à ce que le CAM soit détruit à l’éclosion du poulet16. Malgré le court temps de croissance, l’approvisionnement nutritionnel riche et l’état immunodéficient de l’embryon de poulet permettent l’engraftment de tumeur très efficace16,19,20,21. Enfin, le coût de chaque œuf fécondé est de 1 $, comparativement à plus de 100 $ pour une souris SCID. Ensemble, le modèle CAM peut servir de modèle animal alternatif précieux dans l’établissement de nouveaux PDX à une grande économie de temps et de coût par rapport à la souris. Dans ce protocole, nous avons évalué si le modèle était capable de récapituler la biologie du ccRCC métastatique observé dans le modèle orthotopic de souris.

(SCID) Souris Cam Note
Coût 100 $ chacun 1 $ chacun Viabilité allant de 50 à 75 %
Besoin de logements barrière Oui non Réduit davantage les coûts et simplifie la surveillance en série des tumeurs
Tumeur directement visible non Oui Figure 3A
Temps de premier engraftment (RENCA) 2 semaines 2-4 jours réf 14, 15
Point final de la croissance (RENCA) 3-6 semaines 10 jours réf 14, 15
Métastasie (RENCA) observée Oui Oui chez les poussins Figure 3D
Passages en série Oui Oui réf 16-18
Passage aux souris (RENCA) Oui Oui Hu, J., et coll. under review (2019)
Maintenir l’hétérogénéité tumorale Oui Oui Hu, J., et coll. under review (2019)

Tableau 1 : Avantages et limitations des modèles souris et CAM. Ce tableau compare les deux modèles pour leurs avantages et leurs limites en termes de temps requis, de coût, de main-d’œuvre, ainsi que de biologie. Le modèle CAM présente des avantages d’efficacité, mais il a aussi ses propres limites en raison de la morphologie différente entre les oiseaux et les mammifères. Par conséquent, il est important de confirmer que le modèle peut conserver la biologie des xénogreffes.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC), désigné comme comité de recherche animale du chancelier de l’UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 et ARC 2017-102-01A). Le protocole 2002-049-53 est optimisé pour l’implantation de cellules tumorales ccRCC dans la capsule rénale des souris nues ou BALB/c. Les expériences d’implantation tumorale dans les œufs de poulet fécondés avant l’éclosion ne nécessitent pas l’approbation de l’IACUC. Pour prolonger le temps d’établissement des métastes pulmonaires, les embryons atteints de tumeur CAM sont autorisés à éclore et à se développer en poulets. Le protocole 2017-102-01A couvre ces expériences animales.

1. Études orthotopiques de tumeur chez les souris

REMARQUE : La chronologie de cette expérience est indiquée dans la figure 1A. Ces procédures ont été adaptées des publications précédentes11,12.

  1. Préparation de la suspension à cellule unique pour la greffe
    1. Détachez les cellules RENCA VHL-WT et VHL-KO des plats de culture à l’aide de trypsine/EDTA.
    2. Comptez les cellules avec un hémocytomètre et resuspend dans un mélange pré-refroidi 1:1 de PBS et de solution de matrice extracellulaire à une concentration de 1 x 105 cellules/L.
      REMARQUE : Utilisez un rapport de 1:4 de cellules VHL-WT:VHL-KO pour les implants hétérogènes et VHL-WT seul pour les implants homogènes.
    3. Transférer les cellules en suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et conserver sur la glace jusqu’à l’implantation.
  2. Implantation à la capsule rénale
    1. Anesthésie : Préchauffer un tampon chaud à 37 oC et le recouvrir d’un morceau de drapé stérile épais. Anesthésiez la souris par inhalation d’isoflurane par l’intermédiaire d’une chambre d’induction ou par injection intrapéritonéale (IP) de 1 % de sodium pentobarbital à la dose de 10 ml/kg.
    2. Raser les cheveux du site chirurgical. Cette étape peut être ignorée pour les souris nues.
    3. Désinfection et drapage chirurgical : Désinfectez entièrement le dos de la souris à l’aide de povidone-iode 3x suivi de 70 % d’éthanol 1x et essuyez-le à l’aide d’écouvillons de coton stériles. Ensuite, appliquez trois pansements médicaux stériles séquentiellement, couvrant tout le dos afin de créer un champ chirurgical ainsi que d’immobiliser la souris.
    4. Incision et extériorisation des reins : Avant l’opération, désinfectez les doigts de l’opérateur avec de l’iode povidone ou utilisez une paire de gants stériles. Placez la souris en position couchée et utilisez les doigts pour localiser le rein gauche juste sous le flanc gauche. Utilisez une paire de forceps émoussés et de ciseaux pour couper la peau ouverte et la couche musculaire sous l’emplacement spécifié. Utilisez des cotons-tiges stériles et des forceps pour extérioriser partiellement le rein gauche de l’abdomen.
    5. Implantation de cellules tumorales : Chargez la suspension cellulaire préparée à l’étape 1.1 dans des seringues à insuline ou des seringues Hamilton personnalisées (voir tableau des matériaux pour les spécifications). Injecter 20 l de cellules resuspensionsous la capsule rénale.
      REMARQUE : L’injection réussie est déterminée par la formation d’un renflement translucide à la surface du rein. L’injection accidentelle dans le parenchyme rénal a comme conséquence le saignement et un taux de mortalité postopératoire aussi haut que 90% dû à l’hémorragie mortelle au site d’injection.
    6. Retirez lentement l’aiguille afin de permettre à la solution de matrice extracellulaire de se solidifier et d’éviter une hémorragie ou une fuite de cellules tumorales. Puis, à l’aide d’un coton-tige stérile, repoussez le rein dans l’abdomen.
    7. Couture de blessure : Utilisez une suture VICTRYL enduite de 5-0 pour coudre la couche musculaire. Désinfecter la peau avec de la povidone-iode une fois et fermer la peau avec des autoclips plaie.
    8. Récupération : Placez la souris sur le coussinet chaud jusqu’à ce qu’elle se réveille. Si la souris a été anesthésiée par inhalation, retirez l’isoflurane et gardez la souris sur le coussinet chaud jusqu’à ce qu’elle soit éveillée.
  3. Imagerie par bioluminescence (BLI) et collecte de tissus
    1. Six semaines après l’implantation de tumeur, prenez des images de BLI de firefly-luciferase-basées. Ensuite, euthanasiez les souris avec l’inhalation d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale.
    2. Recueillir le sang pour la détection de cellules tumorales circulantes (CTC) par cytométrie de flux.
    3. Récolte zondez la tumeur et les organes d’intérêt (reins, poumons, foie, intestins et rate) en utilisant une technique stérile de récolte des tissus22. Fixez-les dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’incorporation de cire de paraffine.

2. Modèle de xénogreffe de tumeur de CAM

REMARQUE : Ces procédures ont été adaptées et modifiées à partir des protocoles précédemment publiés23,24. Le calendrier de cette procédure est indiqué dans la figure 1B. Cet article ne présente que le protocole simplifié. Pour des protocoles détaillés, veuillez consulter un autre article de JoVE publié par notre groupe25.

  1. Préincubation : Incuber les œufs de poulet fraîchement pondus et fécondés dans un incubateur d’œufs rotatif à 37 oC et 55 à 65 % d’humidité pendant 7 jours.
  2. Laissez tomber le CAM et ouvrez la fenêtre (jour de développement 7) :
    1. Localiser et marquer le sac d’air et les veines.
      REMARQUE : Habituellement, 10 à 15 % des œufs sont enlevés parce qu’ils ne sont pas fécondés ou meurent dans les 7 jours suivant la fécondation.
    2. Créez un nouveau sac d’air sur une veine marquée.
    3. Délimiter le nouveau sac d’air, appliquer du ruban adhésif et remettre les œufs à l’incubateur.
      REMARQUE: La procédure peut être interrompue ici. Il est recommandé de reprendre les procédures dans la même journée parce que le sac d’air peut se déplacer.
    4. Ouvrez une fenêtre : À l’aide d’une paire de ciseaux microdissés incurvés et d’une paire de pinces à aiguilles, coupez une fenêtre circulaire de 1,5 x 1,5 cm dans la coquille.
      REMARQUE : La perturbation de la CAM est indiquée par le sang et un morceau de CAM présent sur la pièce de coquille coupée.
    5. Scellez le trou avec un pansement médical transparent et placez les œufs dans un incubateur stationnaire à 37 oC et 55 % à 65 % d’humidité.
      REMARQUE : Utilisez le même incubateur d’œufs que dans l’étape 2.1. Éteignez le rotateur pour le rendre immobile.
  3. Bilan de santé (jour de développement 9) : Enlevez les œufs morts et regroupez ensuite au hasard le reste des œufs pour l’implantation des cellules tumorales.
    REMARQUE : Idéalement, le taux de survie à ce stade est d’environ 80 % du jour de développement 0.
  4. Greffe des cellules tumorales sur le CAM nouvellement exposé (jour de développement 10)
    1. Diluer la solution de matrice extracellulaire dans le double du volume de RPMI 1640 pré-refroidi (avec L-glutamine). Détachez les cellules RENCA et suspendez-les dans la solution ci-dessus pour atteindre une concentration de 2 x 104 cellules/L.
      REMARQUE : Utilisez un rapport de 1:1 des cellules VHL-WT:VHL-KO pour les implants hétérogènes et VHL-WT seul pour l’implantation homogène.
    2. Pour présolidifier la suspension cellulaire, remplissez 100 L de chaque mélange cellulaire en pointes de pipette de 200 l et placez-les dans un incubateur cellulaire pendant 15 min.
    3. Implanter 100 l de suspension cellulaire pour chaque œuf sur la surface du CAM par la fenêtre.
      REMARQUE : Certains protocoles exigent de gratter le CAM avant l’implantation23. Ce n’est pas nécessaire pour les cellules RENCA, car elles se développent très rapidement.
  5. Cultivez des cellules sur le CAM pendant 10 jours et photographiez tous les 2 jours.
  6. Euthanasier et récolter la tumeur, le sang et les organes.
    1. Le jour du développement 20 (jour de tumeur 10), recueillir le sang par l’intermédiaire de la veine chorioallantoic avec une seringue héparinisée de 10 ml.
    2. Euthanasier les embryons en les mettant sur la glace pendant 15 min.
    3. Récolte et pesons les tumeurs. Disséquer les poumons et les foies à l’aide d’une technique de récolte de tissus stériles similaire à celle utilisée pour les souris22.
      REMARQUE: Les foies de poulets ont deux lobes, qui sont les premiers organes vus dans la cavité abdominale. Ne les confondez pas avec les poumons. Les poumons de poulet sont situés sous le cœur et septum26. La collecte réussie des poumons peut être confirmée par les côtes exposées.
    4. Fixer les tumeurs et les organes disséqués dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’encastrement de cire de paraffine.
  7. Éclosez les poulets.
    1. Pour permettre une longue période de croissance tumorale, continuer l’incubation jusqu’au jour 21 et laisser les poulets éclore à 37 oC et au moins 60 % d’humidité.
      REMARQUE : Les poulets éclosent naturellement après le jour 21 sur une période de 24 heures, mais ont parfois de la difficulté à éclore par eux-mêmes. Dans ce cas, la fissuration des coquilles d’œufs certains aide. Il est important que les poulets terminent le processus d’éclosion dans les 24 heures parce qu’ils mourront par manque de nutriments après cette date.
    2. Cultivez les poulets dans un établissement animalier (2017-102-01A) pendant 2 semaines.
    3. Le jour de développement 34 (jour de tumeur 24), euthanasiez les poussins avec l’inhalation d’isoflurane suivie de la dislocation cervicale.
    4. Disséquer les poumons à l’aide d’une technique de récolte de tissus stériles similaire à celles utilisées pour les souris22. Ensuite, fixez-les dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’encastrement de cire de paraffine.

3. Immunohistochimie

REMARQUE : Toutes les sections de tissus et les taches de H et E ont été faites par le laboratoire de base de pathologie translationnelle (TPCL) à l’université de la Californie, Los Angeles.

  1. Cuire les lames à 65 oC pendant 20 min et déparaffiiniser 3x à l’aide de xylène et réhydrater en série de 100 % d’éthanol à l’eau.
  2. Récupérer les antigènes dans un tampon de citrate bouilli dans un vapeur de légumes pendant 25 min.
  3. Appliquer 1% BSA pour le blocage. Appliquez ensuite les anticorps primaires (anti-VHL, anti-HA, anti-drapeau) préparés à un rapport de dilution de 1:200 dans pbS. Incuber toute la nuit à 4 oC.
  4. Après avoir lavé 3x avec TBST (7 min chacun), couver des glissières avec l’anticorps secondaire à 1:200 dilution. Laver 3x avec tBST (7 min chacun) et appliquer des réactifs DAB suivis d’une contre-staining à l’hématoxylin.

4. Cytométrie de flux

  1. Traiter le sang de souris ou de poulet avec un tampon de lyse (RBC) selon le protocole du fabricant.
    REMARQUE : Une lyse RBC suffisante est particulièrement importante lors de l’analyse du sang DE CAM parce que les RBC de poulet sont nucléements et ne peuvent pas être facilement distingués dans la cytométrie de flux utilisant la diffusion vers l’avant et latérale.
  2. Cytométrie de flux de course sur le lysate sanguin et d’analyser les données pour mStrawberry et egFP expression.
  3. Définir les portes primaires en fonction de la diffusion vers l’avant et latérale à l’exclusion des débris, des cellules mortes et des RBC non lysed.
  4. Définir les barrières de fluorescence en fonction des échantillons non tachés et des commandes tachées simples. Utilisez le lysate sanguin amorcé avec VHL-WT, VHL-KO, ou des cellules RENCA non étiquetées comme les contrôles tachés simples et les contrôles non tachés, respectivement.

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Representative Results

Chaque expérience a été effectuée au moins 3x sauf indication contraire. Les données sont présentées comme une déviation moyenne et standard (DD). L’importance a été déterminée par un test T apparié de l’étudiant lorsqu’il y avait deux groupes ou par un ANOVA à sens unique lorsqu’il y avait trois groupes ou plus. Une limite de valeur p de 0,05 a été utilisée pour établir l’importance.

Les cellules RENCA orthotopiques implantées se sont développées avec succès sur les reins des souris, comme l’ont confirmé la coloration DE BLI et de H-E(figure 2A-B). Bien qu’il n’y ait aucune différence dans la croissance primaire, seulement la tumeur hétérogène et métastatique a eu la métastase robuste au poumon comme indiqué par le signal bli très fort et les nodules métastatiques dans la coloration de H et E. D’autre part, les tumeurs homogènes et non métastatiques n’ont pas métastasé aux organes éloignés. Les numérations de CTC étaient plus élevées chez les souris portant des tumeurs métastatiques que celles portant des tumeurs non métastatiques(figure 2C-D).

En concordance avec le modèle de souris, le système de CAM a réussi à conserver la croissance et le comportement métastatique des tumeurs de RENCA. Bien qu’il n’y ait eu aucune différence de croissance entre les tumeurs métastatiques et non métastatiques, les comptes de CTC étaient sensiblement plus élevés dans les oeufs avec des tumeurs métastatiques que ceux avec des contre-parties non métastatiques (figure 3A-C). L’éclosion des œufs avec des tumeurs CAM et permettant aux poussins de croître de deux semaines supplémentaires a prolongé la période pour les cellules cancéreuses métastatiques pour établir des métastases histologiquement détectables dans le poumon des poussins, comme le montre la tache de H et E et HA des sections de tissu de poumon de poulet(figure 3D). La majorité des nodules métastatiques se composaient de cellules VHL-WT étiquetées HA, tandis que le VHL-KO marqué par le drapeau était rarement vu, comme nous l’avons observé chez la souris.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu des deux modèles animaux pour les xénogreffes ccRCC métastatiques. (A) Représentation schématique du modèle orthotopic de souris. Des souris de 3 ou 4 semaines sont orthotopiquement implantées avec des tumeurs non métastatiques ou métastatiques. Six semaines après l’implantation, la croissance de tumeur et la métastasis ont été visualisées avec BLI. Ensuite, la tumeur, le sang, et les organes ont été rassemblés pour des analyses en aval. (B) Représentation schématique du modèle CAM montrant les étapes suivantes : Préincubation, ouverture de fenêtre, implantation cellulaire et euthanasie avant ou après l’éclosion. Les mêmes analyses que le modèle de souris sont effectuées pour les échantillons prélevés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Croissance tumorale et métastes chez les souris orthotopiques implantées. (A) BLI des souris et des organes extraits (rein, poumon, foie, intestin, et rate) 6 semaines après l’implantation orthotopic des cellules de RENCA. Gauche : non métastatique (non-met), droite : métastatique. (B) Vue brute et grossissement croissant de la coloration de H et E pour le rein et le poumon (20x et 100x). Gauche : non métastatique (non-met), droite : métastatique. (C) Analyse représentative du débit pour la détection des cellules mStrawMD et EGFPMD circulant dans le sang. (D) Graphique de population en pourcentage des cellules mStrawMD et EGFPMD en circulation. Non-met: non métastatique. Le panneau A a été adapté de Hu et coll.27. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Croissance tumorale et métastes dans le modèle CAM. (A) tumeurs RENCA cultivées en CAM. Il y a eu 7 répétitions pour chaque groupe. Non-met: non métastatique. (B) Analyse représentative du débit pour la détection des cellules mStrawMD et EGFPMD circulant dans le sang. (C) Graphique de population en pourcentage des cellules mStrawMD et EGFPMD en circulation. lt; 0,01. (D) coloration iHC du poumon d’un poussin de 2 semaines portant une tumeur métastatique pendant son stade embryonnaire. De gauche à autre, les sections montrent la coloration de h et E, de HA et du drapeau. - l’artère pulmonaire du poulet; pointe de flèche : nodules métastatiques. Ce chiffre a été adapté de Hu J et coll.27. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Pour beaucoup de patients présentant des malignités épithéliales, la métastasie aux organes vitaux est la cause primaire de la mortalité. Par conséquent, il est essentiel de trouver le mécanisme sous-jacent et une nouvelle avenue de thérapie pour la maladie métastatique. Malheureusement, il y a un manque de modèles animaux ccRCC métastatiques pertinents. Le défi est en grande partie dû à l’incapacité de recréer ccRCC chez la souris en dépit de la génération de nombreux rein transgénique épithélial-ciblé sourdeUR modèles de souris9,10. Ici, nous démontrons les méthodes pour établir une tumeur métastatique implantable de ccRCC dans deux systèmes animaux, la souris et le POULET CAM. Ces résultats ont validé le comportement métastatique des tumeurs dans deux environnements disparates, et fournissent ainsi des occasions uniques d’étudier davantage le mécanisme moléculaire de la métastase. Dans le premier modèle, la population hétérogène de RENCA a été implantée aux souris immunocompétentes orthotopiquement à leur capsule rénale. Après 6 semaines, ces souris ont montré la métaste rampante de poumon. En concordance avec le modèle de souris, l’implantation des cellules hétérogènes de RENCA sur le CAM a avec succès grandi et intravasated dans le sang des embryons de poussin. En prolongeant la période de croissance de tumeur à 2 semaines après l’éclosion, des métastases de poumon ressemblant à ceux vus dans la souris ont été observées dans les poussins.

Pour les deux modèles, une attention particulière aux détails techniques de chaque étape et la pratique pour améliorer les compétences techniques sont essentiels pour augmenter la survie des animaux et l’engraftment tumoral réussie et la métasse. Pour le modèle de souris, le choix soigneux de l’équipement et l’injection précise des cellules tumorales à la capsule rénale maximise le taux de réussite en diminuant la mortalité postopératoire et en augmentant les chances pour la tumeur d’obtenir un approvisionnement suffisant en sang pour se développer et métastases. Le modèle CAM nécessite plus d’optimisation dans la configuration et la technique. Dans nos études, la viabilité de l’embryon était inférieure à 30 % au début. Il est important de maintenir à la fois la température et l’humidité au niveau désiré en tout temps en ayant un bon équipement, une surveillance fréquente et un achèvement plus rapide des procédures. Même après l’optimisation, la survie varie de 50-75% selon l’expérimentateur et le lot individuel d’oeufs. Il est recommandé de toujours commander des œufs supplémentaires pour la sauvegarde. D’après notre expérience, la maîtrise des techniques CAM nécessite plus d’un an. L’abandon de la membrane CAM et l’ouverture de la fenêtre est l’étape critique où des dommages accidentels et mortels à l’embryon se produisent le plus souvent. La viabilité de l’embryon de poussin peut être améliorée en prévenant les dommages à la MCA.

Il y a plusieurs limitations au modèle de tumeur de CAM. La première est l’applicabilité du modèle à tous les types de cellules tumorales. Nous avons eu un taux de succès de 100% engrafting différentes lignes établies de cellules de tumeur sur DES lignes de cellules de tumeur de REin, de réservoir souple, et de prostate (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) et les lignes de cellules cancéreuses ovariennes (ID8 et SKOV3). Deux études supplémentaires de notre groupe fournissent plus d’informations sur ces tumeurs CAM25,27. Cependant, la croissance de quelques cellules cancéreuses ovariennes sur CAM est augmentée par la supplémentation du facteur de croissance ou des cellules tumeur-associées25. L’optimisation du nombre de cellules ou du facteur de croissance essentiel pour chaque lignée ou type de cellule est importante. Nous incorporons également des gènes de reporter ou de marqueur, tels que la luciferase, les étiquettes protéiques (par exemple, HA ou drapeau), ou les étiquettes de fluorescence (par exemple, mStrawberry ou EGFP), pour faciliter le suivi de la croissance et de la métastes de la tumeur chez les animaux25,27. D’après notre expérience, une grande majorité des lignées cellulaires cancéreuses proliférantes peuvent être établies sur LA MCA. Une limitation clé à l’engraftment pourrait être la fenêtre courte de 10 jours a permis pour la croissance de tumeur, qui pourrait être particulièrement provocante pour une ligne cellulaire de croissance lente pour établir la masse suffisante dans un laps de temps si court.

Une autre lacune du modèle CAM est la différence de physiologie entre l’embryon aviaire et les mammifères. La métastase de la tumeur de CAM aux organes principaux tels que le foie ou les poumons de l’embryon a été détectée principalement par les techniques sensibles de PCR28. La courte période de temps de croissance dans LE CAM serait insuffisante pour établir de grandes lésions métastatiques qui peuvent être vérifiées par des analyses histologiques. En outre, la perfusion vasculaire réduite du poumon d’embryon non gonflé n’est pas favorable pour établir ou soutenir la croissance des métastases de poumon. Pour surmonter ces limitations, une approbation de notre comité institutionnel d’utilisation des animaux (IACUC) a été obtenue pour éclore des poulets de la tumeur CAM portant des embryons et les loger 2 semaines supplémentaires après l’éclosion. L’extension du temps de la croissance de tumeur de cette manière nous a permis de détecter les métastases lointaines de poumon par IHC. Bien que les études sur le poulet éclos exigent l’approbation supplémentaire de l’IACUC que les études sur les tumeurs de CAM n’ont pas, cette approche fournit une occasion précieuse d’étudier la cascade métastatique chez les poulets comme précédemment fait chez les souris. Le système immunitaire du poulet a été signalé à se développer à partir du jour 12 après la fécondation20. Compte tenu de la haute efficacité de l’engrafting murine dérivés tumeurs RENCA signalés ici et de nombreuses autres lignées cellulaires cancéreuses humaines et PDXs dans le CAM le jour 10 après la fécondation24,25,27, nous pourrions déduire que le système immunitaire dans l’embryon n’est pas entièrement développé à ce stade. L’interaction du système immunitaire du poulet et de la tumeur de CAM justifie clairement une enquête plus approfondie.

Nos travaux fournissent la preuve de support forte que le modèle de tumeur de CAM pourrait être un modèle initial simple in vivo pour étudier la biologie de cancer, y compris la métastasie. En raison des limitations mentionnées ci-dessus, le modèle CAM ne doit pas remplacer le modèle de souris, mais le compléter. Nos recherches en cours suggèrent que le lien entre les populations cellulaires hétérogènes dans le ccRCC est essentiel pour régir la progression métastatique11,12. L’utilisation des modèles CAM et souris peut être un moyen précieux de valider le crosstalk métastatique en jeu dans le ccRCC. Nous croyons que les nombreux avantages du modèle DEMC présentés ici pourraient accélérer le rythme de découverte de nouveaux mécanismes métastatiques et de traitements efficaces pour remédier à ce stade mortel du cancer.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par la subvention de démarrage de l’UCLA JCCC, la subvention UCLA 3R, le CTSI de l’UCLA et l’UC TRDRP (LW). Nous remercions l’installation d’imagerie préclinique de l’Institut Crump, le TPCL et le Département de médecine animale de laboratoire (DLAM) de l’UCLA pour leur aide dans le traitement des méthodes expérimentales. La cytométrie de flux a été exécutée dans l’UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) et le Center for AIDS Research Cytometry Core Facility, qui est soutenu par les prix P30 CA016042 et 5P30 AI028697 de l’UCLA, et par le JCCC, l’UCLA AIDS Institute, la David Geffen School of Medicine de l’UCLA, le Bureau du chancelier de l’UCLA et le Bureau de recherche du vice-chancelier de l’UCLA. Les services de consultation en statistique et d’analyse des données ont été fournis par le ucla CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD) Program qui est soutenu par NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning 25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18
anti-VHL antibody Abcam ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD Biosciences 14-826-79
BD Pharm Lyse BD Biosciences 555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826-5D
DAB Chromogen Kit Biocare Medical DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) eBioscience 14-6681-82
Ethanol 200 Proof Cylinders Management 43196-11 Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Fisher Scientific 10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls Fisher Scientific 22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology MilliporeSigma 1.00496.5000
Hamilton customized syringe Hamilton 80408 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11) Santa Cruz Biotechnology sc805
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein Animal Health 1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" Medex Supply MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation MilliporeSigma 2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin Fisher Scientific MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium Sigma Aldrich 57-33-0 Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use Ricca Chemical 395516
pSicoR Addgene 11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC227420500
Renca ATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Corning 10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile Fisher Scientific AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) Thomas Scientific 1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls Office Depot 220717
Suture Ethicon J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 1634
Thermo-Chicken Heated Pad K&H manufacturing 1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017
VHL-KO CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR Fisher Scientific 50-822-331
Wound autoclips kit Braintree scientific, inc. ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical Fisher Scientific X3S-4

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References

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353, (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23, (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15, (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15, (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45, (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19, (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31, (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5, (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8, (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328, (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14, (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32, (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182, (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136, (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16, (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2, (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33, (2), 255-268 (2014).

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