Author Produced

Jämföra metastaserande clear cell njurcellscancer modell etablerad i mus njure och på kyckling chorioallantoic membranet

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Metastaserande klar cell njurcellscancer är en sjukdom utan en omfattande djurmodell för grundlig preklinisk undersökning. Detta protokoll illustrerar två nya djurmodeller för sjukdomen: den ortopediskt implanterade musmodellen och kycklingchorioallantoic membranmodellen, som båda visar lungmetastasering liknar kliniska fall.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metastaserande klar cell njurcellscancer (ccRCC) är den vanligaste subtypen av njurcancer. Lokaliserad ccRCC har ett gynnsamt kirurgiskt utfall. En tredjedel av ccRCC-patienter kommer dock att utveckla metastaser till lungan, vilket är relaterat till ett mycket dåligt resultat för patienterna. Tyvärr är ingen terapi tillgänglig för detta dödliga skede, eftersom den molekylära mekanismen för metastasering förblir okänd. Det har varit känt i 25 år att förlusten av funktion av von Hippel-Lindau (VHL) tumör suppressor genen är paognomonic av ccRCC. Ingen kliniskt relevant transgen musmodell av ccRCC har dock genererats. Syftet med detta protokoll är att införa och jämföra två nyetablerade djurmodeller för metastaserande ccRCC. Den första är njurimplantation i musmodellen. I vårt laboratorium användes CRISPR-genredigeringssystemet för att slå ut VHL-genen i flera RCC-cellinjer. Ortopediskt implantation av heterogena ccRCC populationer till njurkapseln skapade nya ccRCC modeller som utvecklar robusta lungmetastaser i immunkompetenta möss. Den andra modellen är kyckling chorioallantoic membranet (CAM) systemet. I jämförelse med musmodellen är denna modell mer tid, arbete och kostnadseffektiv. Denna modell stödde också robust tumörbildning och intravasation. På grund av den korta 10-dagarsperioden av tumörtillväxt i CAM observerades ingen överlig metastasering av immunohistochemistry (IHC) i de insamlade embryovävnaderna. Men när tumörtillväxt förlängdes med två veckor i den kläckta kycklingen observerades mikrometastaserande ccRCC-lesioner av IHC i lungorna. Dessa två nya prekliniska modeller kommer att vara användbara för att ytterligare studera den molekylära mekanismen bakom metastasering, samt att etablera nya, patienthärledda xenografts (PDXs) mot utvecklingen av nya behandlingar för metastaserande ccRCC.

Introduction

Renal cell carcinom (RCC) är den7: e vanligaste canceri USA. Årligen, 74.000 amerikaner beräknas vara nydiagnostiserade, står för mer än 14.000 dödsfall (Clear-cell histologiska subtyp, eller ccRCC, är den vanligaste subtyp, står för cirka 80% av RCC fall. Patienter med lokaliserad malignitet behandlas med nefrectomy och har en gynnsam 5-års överlevnad på 73%1. Men 25%-30% av patienterna utveckla avlägsna metastaser till vitala organ såsom lungorna, vilket resulterar i en dålig genomsnittlig överlevnad på 13 månader och 5-års överlevnad på endast 11%1,2,3. Ytterligare förståelse av metastaserande mekanismen behövs för att förbättra det dödliga resultatet för metastaserande ccRCC.

Förlusten av VHL tumör suppressor genen är ett kännetecken genetisk skada observeras i en majoritet av mänskliga ccRCC fall4,5,6,7. Den exakta oncogenic mekanismen för VHL förlust i ccRCC är dock okänd. Dessutom är VHL uttryckstatus inte förutsägande av resultatet i ccRCC8. Noterbart, trots många försök till renal-epitelial-riktade VHL knockout, forskare har misslyckats med att generera njurmedicinska onormala effekter utöver preneoplastic cystic skador observerats i möss9, även i kombination med radering av andra tumör suppressors såsom PTEN och p5310. Dessa fynd stöder tanken att Enbart VHL-förlusten är otillräcklig för tumorigenesis eller den efterföljande spontana metastasering.

Nyligen skapade vårt laboratorium en ny VHL knockout (VHL-KO) celllinje med CRISPR /Cas9 medierad borttagning av VHL genen i murine VHL + ccRCC cellinje (RENCA, eller VHL-WT)11,12. Vi visade att VHL-KO är inte bara mesenchymal, men främjar också epitel till mesenchymal övergång (EMT) av VHL-WT celler12. EMT är känt för att spela en viktig roll i metastaserande process13. Vårt arbete visade vidare att avlägsna lungmetastasering endast sker med co-implantation av VHL-KO- och VHL-WT-celler i njuren, vilket stöder en kooperativ mekanism för metastasering. Viktigt, vår ortotopiserat implanterade VHL-KO och VHL-WT modell leder till robusta lungmetastaser, rekapitulation kliniska ccRCC fall. Denna spontana metastaserande ccRCC modell kompenserar för bristen på en transgen ögonbevarande mus modell, särskilt i utvecklingen av nya anti-metastasering droger. Detta protokoll visar njurkapselimplantation av heterogena cellpopulationer av genetiskt modifierade RENCA-celler.

Kyckling CAM modeller har en lång historia inom forskning för angiogenes och tumörbiologi på grund av deras många fördelar, som sammanfattas i tabell 114,15,16,17,18. Kort är tidsfönstret för CAM tumör tillväxt kort, vilket gör att högst 11 dagar tills CAM förstörs vid kläckning av kyckling16. Trots den korta tillväxttiden, den rika näringstillförsel och immunodeficient tillstånd kyckling embryo möjliggör mycket effektiv tumör engraftment16,19,20,21. Slutligen är kostnaden för varje befruktat ägg ~ $ 1, jämfört med över $ 100 för en SCID mus. Tillsammans kan CAM-modellen fungera som en värdefull alternativ djurmodell för att etablera nya PDF-filer till en stor besparing i tid och kostnad jämfört med musen. I detta protokoll bedömde vi om modellen kunde sammanfatta biologin hos metastaserande ccRCC som observerats i musortotopmodellen.

- Jag vet inte vad du ska göra. Musen Cam Observera
Kostnad >$100 vardera ~$1 vardera Lönsamhet från 50-75%
Behov av barriärhus Ja Nej Ytterligare minskar kostnaderna och förenklar seriell övervakning av tumörer
Tumör direkt synlig Nej Ja Figur 3A
Dags att först engraftment (RENCA) 2 veckor 2-4 dagar ref 14, 15
Tillväxtpunkt (RENCA) 3-6 veckor 10 dagar ref 14, 15
Metastasering (RENCA) observerad Ja Ja hos kycklingar Bild 3D
Seriella passager Ja Ja ref 16-18
Passage till möss (RENCA) Ja Ja Hu, J., et al. under översyn (2019)
Underhåll tumör heterogenitet Ja Ja Hu, J., et al. under översyn (2019)

Tabell 1: Fördelar och begränsningar för musen och CAM-modellerna. Denna tabell jämför de två modellerna för sina fördelar och begränsningar när det gäller obligatorisk tid, kostnad, arbete, samt biologi. CAM-modellen har fördelar med effektivitet, men den har också sina egna unika begränsningar på grund av de olika morfologi mellan fåglar och däggdjur. Därför är det viktigt att bekräfta att modellen kan behålla biologi xenografts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av institutional animal care and use committee (IACUC), som utsetts till UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC) (ARC 2002-049-53 och ARC 2017-102-01A). 2002-049-53-protokollet är optimerat för implantation av ccRCC-tumörceller i njurkapseln nude eller BALB/c möss. Tumör implantation experiment i befruktade kycklingägg före kläckning kräver inte IACUC godkännande. För att förlänga tiden för etablering av lungmetastaser, embryona med CAM tumör får kläckas och växa till kycklingar. Protokollet för 2017-102-01A omfattar dessa djurförsök.

1. Ortopediska tumörstudier på möss

Tidslinjen för det här experimentet visas i figur 1A. Dessa förfaranden har anpassats från tidigare publikationer11,12.

  1. Förbereda en cell suspension för ympning
    1. Ta bort RENCA VHL-WT- och VHL-KO-cellerna från kulturrätterna med trypsin/EDTA.
    2. Räkna cellerna med en hemocytometer och resuspend i en förkyld 1:1 blandning av PBS och extracellulär matrislösning vid en koncentration av 1 x 105 celler/μL.
      OBS: Använd ett 1:4-förhållande mellan VHL-WT:VHL-KO-celler för heterogena implantat och Enbart VHL-WT för homogena implantat.
    3. Överför de resuspenderade cellerna till ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml och håll på is tills implantationen.
  2. Implantation till njurkapsel
    1. Anestesi: Värm en varm dyna till 37 °C och täck den med en bit tjock steril draperi. Bedövning musen genom antingen isofluran inandning via en induktionskammare eller intraperitoneal (IP) injektion av 1% pentobarbital natrium vid doseringen av 10 ml/kg.
    2. Raka håret från operationsstället. Det här steget kan hoppas över för nakna möss.
    3. Desinfektion och kirurgisk drapering: Desinficera baksidan av musen helt med povidone-jod 3x följt av 70% etanol 1x och torka den torr med steril bomull svabbprover. Applicera sedan tre sterila medicinska förband sekventiellt, som täcker hela ryggen för att skapa ett kirurgiskt fält samt att immobilisera musen.
    4. Snitt- och njurexteriörisering: Före operationen desinficerar operatörens fingrar med povidone-jod eller använd ett par sterila handskar. Placera musen i utsatt läge och använd fingrarna för att hitta den vänstra njuren precis under vänster flank. Använd ett par trubbiga pincett och sax för att skära huden öppen och muskelskiktet under den angivna platsen. Använd sterila bomullspinnar och pincett för att delvis exteriorisera vänster njure ut ur buken.
    5. Tumörcellimplantation: Ladda cellsuspensionen som förberetts i steg 1.1 i antingen insulinsprutor eller anpassade Hamiltonsprutor (se Materialtabell för specifikationer). Injicera 20 μl resuspenderade celler under njurkapseln.
      OBS: Framgångsrik injektion bestäms genom bildandet av en genomskinlig bula på njurens yta. Oavsiktlig injektion i njurparenkymen resulterar i blödning och en postoperativ dödlighet så hög som 90% på grund av dödlig blödning vid injektionsstället.
    6. Dra långsamt ut nålen för att tillåta extracellulär matrislösning att stelna och förhindra blödning eller tumörcellläckage. Tryck sedan tillbaka njuren i buken med hjälp av en steril bomullspinne.
    7. Sårsömmar: Använd en 5-0 belagd VICTRYL sutur för att sy muskelskiktet. Desinficera huden med povidone-jod en gång och stäng huden med sårautoclips.
    8. Återhämtning: Placera musen på den varma dynan tills den vaknar. Om musen var sövd genom inandning, dra tillbaka isofluran och håll musen på den varma dynan tills den är vaken.
  3. Bioluminescensavbildning (BLI) och vävnadssamling
    1. Sex veckor efter tumörimplantation, ta firefly-luciferase-baserade BLI bilder. Avliva sedan möss med isofluran inandning följt av massundersökning störning.
    2. Samla blod för cirkulerande tumörcell (CTC) upptäckt genom flöde cytometri.
    3. Skörda tumör och organ av intresse (njurar, lungor, lever, tarmar och mjälte) med hjälp av en steril vävnad skörd teknik22. Fixa dem i 4% paraformaldehyd över natten för paraffin-vax inbäddning.

2. CAM tumör xenograft modell

OBS: Dessa förfaranden har anpassats och ändrats från tidigare publicerade protokoll23,24. Tidslinjen för den här proceduren visas i figur 1B. I den här artikeln presenteras endast det strömlinjeformade protokollet. För detaljerade protokoll, se en annan JoVE artikel publicerad av vår grupp25.

  1. Preinkubation: Inkubera nylagda, befruktade kycklingägg i en roterande ägginkubator vid 37 °C och 55-65% luftfuktighet i 7 dagar.
  2. Släpp CAM och öppna fönster (utvecklingsdag 7):
    1. Lokalisera och markera luftsäcken och venerna.
      OBS: Vanligtvis 10-15% av äggen tas bort eftersom de är antingen obefruktade eller dör inom 7 dagar efter befruktningen.
    2. Skapa en ny luftsäck ovanpå en markerad ven.
    3. Avgränsa den nya luftsäcken, applicera förpackningstejp och lägg äggen tillbaka till inkubatorn.
      OBS: Proceduren kan pausas här. Det rekommenderas att återuppta förfarandena inom samma dag eftersom luftsäcken kan röra sig.
    4. Öppna ett fönster: Skär ett 1,5 x 1,5 cm cirkulärt fönster i skalet.
      OBS: Störningar av CAM indikeras av blodet och en bit CAM närvarande på den skurna skalbiten.
    5. Försegla hålet med transparent medicinsk dressing och placera äggen i en stationär inkubator vid 37 °C och 55–65 % luftfuktighet.
      OBS: Använd samma ägginkubator som i steg 2.1. Stäng av rotatorn för att göra den stillastående.
  3. Hälsokontroll (utvecklingsdag 9): Ta bort döda ägg och gruppera sedan slumpmässigt resten av äggen för tumörcellimplantation.
    OBS: Helst är överlevnaden vid denna punkt cirka 80% av utvecklingsdagen 0.
  4. Ympning tumörcellerna på den nyligen exponerade CAM (utvecklingsdag 10)
    1. Späd den extracellulära matrislösningen i dubbel volymen av förkyld RPMI 1640 (med L-glutamin). Ta bort RENCA-cellerna och resuspend i ovanstående lösning för att nå en koncentration på 2 x 104 celler/μL.
      OBS: Använd ett 1:1-förhållande mellan VHL-WT:VHL-KO-celler för heterogena implantat och Enbart VHL-WT för homogen implantation.
    2. För att förfasta cellsuspensionen fyller du 100 μL av varje cellblandning i 200 μL pipettspetsar och placera dem i en cellinkubator i 15 minuter.
    3. Implantat 100 μl cellsuspension för varje ägg på CAM-ytan genom fönstret.
      VISSA protokoll kräver att cam skrapas innan implantation23. Detta är inte nödvändigt för RENCA celler, eftersom de växer mycket snabbt.
  5. Odla celler på CAM i 10 dagar och fotografera varannan dag.
  6. Avliva och skörda tumören, blodet och organen.
    1. På utvecklingsdag 20 (tumör dag 10), samla blod via chorioallantoic ven med en heparinized 10 ml spruta.
    2. Avliva embryona genom att sätta dem på is i 15 min.
    3. Skörda och väga tumörer. Dissekera lungor och lever med hjälp av en steril vävnadsskördteknik liknande den som används för möss22.
      OBS: Kycklingar lever har två lober, som är de första organen ses i bukhålan. Blanda inte ihop dessa med lungorna. Kycklinglungorna ligger under hjärtat och septum26. Den framgångsrika samlingen av lungorna kan bekräftas av exponerade revben.
    4. Fixa tumörer och dissekerade organ i 4% paraformaldehyd över natten för paraffin-vax inbäddning.
  7. Kläck adhönsen.
    1. För att möjliggöra en längre period av tumörtillväxt, fortsätt inkubationstiden genom dag 21 och låt kycklingarna kläckas vid 37 °C och minst 60% luftfuktighet.
      OBS: Kycklingar kläcks naturligt efter dag 21 under en 24 h tidsperiod men ibland har problem kläckning av sig själva. I det här fallet hjälper sprickbildning äggskalen vissa. Det är viktigt för kycklingar att slutföra kläckningsprocessen inom 24 h eftersom de kommer att dö av brist på näringsämnen efter det.
    2. Odla kycklingarna i en djuranläggning (2017-102-01A) i 2 veckor.
    3. På utvecklingsdagen 34 (tumördag 24), avliva kycklingarna med isofluran inandning följt av livmoderhalscancer störning.
    4. Dissekera lungorna med hjälp av en steril vävnadsskördteknik som liknar dem som används för möss22. Sedan fixa dem i 4% paraformaldehyd över natten för paraffin-vax inbäddning.

3. Immunohistokemi

OBS: All vävnad snittning och H & E färgning gjordes av Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) vid University of California, Los Angeles.

  1. Grädda diabilder vid 65 °C i 20 min och deparaffinize 3x med xylen och rehydrera seriellt från 100% etanol till vatten.
  2. Hämta antigenerna i en citratbuffert kokt i en grönsaksångbåt i 25 min.
  3. Applicera 1% BSA för blockering. Applicera sedan de primära antikropparna (anti-VHL, anti-HA, anti-flag) som är beredda vid en utspädningskvot på 1:200 i PBS. Inkubera natten vid 4 °C.
  4. Efter tvättning 3x med TBST (7 min vardera), inkubera diabilder med den sekundära antikroppen vid 1:200 utspädning. Tvätta 3x med TBST (7 min vardera) och applicera DAB reagenser följt av hematoxylin motfärgning.

4. Flöde cytometri

  1. Bearbeta musen eller kycklingblod med röda blodkroppar (RBC) lysis buffert enligt tillverkarens protokoll.
    OBS: Tillräcklig RBC lysis är särskilt viktigt när man analyserar CAM blod eftersom kyckling RBCs är nukleinerade och kan inte lätt urskiljas i flödet cytometri med hjälp av framåt och sida scatter.
  2. Kör flödecytometri på blodet lysate och analysera data för mStrawberry och EGFP uttryck.
  3. Ställ in de primära grindarna baserat på den främre och sidospridningen exklusive skräp, döda celler och unlysed-rfc.n.
  4. Ställ in fluorescensgrindarna baserat på ofärgade prover och enkelfärgade kontroller. Använd blodlysare som är primade med VHL-WT, VHL-KO eller omärkta RENCA-celler som de enda färgade kontrollerna respektive ofärgade kontrollerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Varje experiment utfördes minst 3x om inget annat anges. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Betydelsen bestämdes av ett parat, Students T-test när det fanns två grupper eller av en enkelriktad ANOVA när det fanns tre eller flera grupper. En p-värde cutoff på 0,05 användes för att fastställa betydelse.

Orthotopically implanterade RENCA celler växte framgångsrikt på möss njurarna, vilket bekräftas av BLI och H & E färgning(figur 2A-B). Även om det inte fanns någon skillnad i den primära tillväxten, bara den heterogena, ögonbevarande tumör hade robust metastasering till lungan som anges av den mycket starka BLI signal och ögonbevarande knölar i H & E färgning. Å andra sidan, homogena, nonmetastatiska tumörer inte metastasera till avlägsna organ. CTC-tal var högre hos möss en metastaserande tumörer än de som bär nonmetastatiska tumörer (figur 2C-D).

I överensstämmelse med musmodellen behöll CAM-systemet framgångsrikt tillväxten och metastaserande beteendet hos RENCA-tumörerna. Även om det inte fanns någon tillväxtskillnad mellan metastaserande och nonmetastatiska tumörer, ctc räknas var betydligt högre i äggen med metastaserande tumörer än de med nonmetastatiskmotsvarigheter(figur 3A-C). Kläckning äggen med CAM tumörer och låta kycklingarna att växa ytterligare två veckor förlängde perioden för metastaserande cancerceller för att fastställa histologiskt detekterbara metastaser i lungan av kycklingar, som visas i H & E och HA fläck en kyckling lungvävnad sektioner(Figur 3D). En majoritet av de metastaserande knölarna bestod av HA-märkta VHL-WT-celler, medan flaggtaggade VHL-KO sällan sågs, som vi har observerat hos möss.

Figure 1
Figur 1: Översikt över de två djurmodellerna för metastaserande ccRCC xenografts. (A)Schematisk representation av musortosmodellen. 3- eller 4-veckors gamla möss implanteras ortopyeriskt med antingen nonmetastatiska eller metastaserande tumörer. Sex veckor efter implantation visualiserades tumörtillväxt och metastasering med BLI. Sedan samlades tumör, blod och organ in för nedströmsanalyser. (B)Schematisk representation av CAM-modellen som visar följande steg: Preinkubation, fönsteröppning, cellimplantation och dödshjälp före eller efter kläckning. Samma analyser som musmodellen utförs för de insamlade proverna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Tumörtillväxt och metastasering i ortopyeriimplanterade möss. (A)BLI av möss och extraherade organ (njure, lunga, lever, tarm och mjälte) 6 veckor efter ortopediskt implantation av RENCA celler. Vänster: nonmetastatisk (icke-mett), höger: metastaserande. (B)Bruttovy och ökad förstoring av H&E-färgning för njure och lunga (20x och 100x). Vänster: nonmetastatisk (icke-mett), höger: metastaserande. (C)Representativ flödesanalys för att upptäcka mStraw+ och EGFP+-celler som cirkulerar i blodet. (D) Procent populationsdiagram över cirkulerande mStraw+ och EGFP+celler. Icke-met: nonmetastatic. Panel A anpassades från Hu et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Tumörtillväxt och metastasering i CAM-modellen. (A)RENCA tumörer odlas i CAM. Det fanns 7 repetitioner för varje grupp. Icke-met: nonmetastatic. (B)Representativ flödesanalys för att upptäcka mStraw+ och EGFP+-celler som cirkulerar i blodet. (C)Procent populationsdiagram över cirkulerande mStraw+ och EGFP+celler. **p < 0,01. (D)IHC färgning av lungan från en 2-veckors gammal brud med en ögonbevarande tumör under sitt embryonala stadium. Från vänster visar avsnitten H&E, HA och flaggfärgning. #: kyckling pulmonell artär; pilhuvud: metastaserande knölar. Denna siffra anpassades från Hu J et al.27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För många patienter med epitel maligniteter, metastasering till vitala organ är den främsta orsaken till dödligheten. Därför är det viktigt att hitta den underliggande mekanismen och en ny väg för behandling för metastaserande sjukdom. Tyvärr finns det en brist på relevanta metastaserande ccRCC djurmodeller. Utmaningen till stor del beror på oförmåga att återskapa ccRCC hos möss trots generering av många transgena njurepithelial-riktade VHL knockout mus modeller9,10. Här demonstrerar vi metoderna för att etablera en implanterbar metastaserande ccRCC-tumör i två djursystem, musen och kycklingcam. Dessa resultat validerade tumörernas metastaserande beteende i två olika miljöer, och ger därmed unika möjligheter att ytterligare undersöka metastaserings molekylära mekanism. I den första modellen implanterades den heterogena RENCA-populationen till immunkompetenta möss ellerthotopically till sin njurkapsel. Efter 6 veckor visade dessa möss skenande lungmetastasering. I samkorance med musmodellen växte implantation av heterogena RENCA-celler på CAM framgångsrikt och intravasated in i blodet av chick embryon. Genom att förlänga tumörtillväxtperioden till 2 veckor efter kläckning observerades lungmetastaser som liknar dem som sågs i musen i ungarna.

För båda modellerna, noggrann uppmärksamhet på de tekniska detaljerna i varje steg och praxis för att förbättra tekniska färdigheter är avgörande för att öka djurens överlevnad och framgångsrika tumör engraftment och metastasering. För musmodellen maximerar noggrant val av utrustning och korrekt injektion av tumörcellerna till njurkapseln framgångsfrekvensen genom att minska den postoperativa dödligheten och öka risken för tumören att få en tillräcklig blodtillförsel för att växa och metastasera. CAM-modellen kräver mer optimering i installationen och tekniken. I våra studier var embryolönsamheten lägre än 30 procent i början. Det är viktigt att hålla både temperatur och luftfuktighet till önskad nivå hela tiden genom att ha bra utrustning, frekvent övervakning och snabbare slutförande av förfarandena. Även efter optimering varierar överlevnadsförmågan från 50-75% beroende på experimentören och den enskilda parti ägg. Det rekommenderas att alltid beställa extra ägg för säkerhetskopiering. Enligt vår erfarenhet kräver mastering av CAM-tekniken över 1 år. Att släppa CAM-membranet och öppna fönstret är det kritiska steget där oavsiktliga, dödliga skador på embryot oftast uppstår. Livskraften hos embryot för kycklingar kan förbättras genom att kammens skador förhindras.

Det finns flera begränsningar för CAM tumör modellen. Först är tillämpligheten av modellen till alla tumörcelltyper. Vi har haft en 100% framgång engrafting olika etablerade tumör cellinjer på CAM, inklusive njure, urinblåsa, och prostata tumör cellinjer (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) och äggstockscancer cellinjer (ID8 och SKOV3). Ytterligare två studier från vår grupp ger ytterligare information om dessa CAM tumörer25,27. Emellertid, tillväxten av vissa äggstockscancerceller på CAM förstärks av tillskott av tillväxtfaktor eller tumör-associerade celler25. Optimering av cellnummer eller väsentliga tillväxtfaktorer för varje cellinje eller typ är viktig. Vi innehåller också reporter eller markör gener, såsom luciferase, proteintaggar (t.ex. HA eller flagga), eller fluorescens taggar (t.ex. mStrawberry eller EGFP), för att underlätta övervakningen av tillväxten och metastasering av tumören hos djuren25,27. Baserat på vår erfarenhet kan en stor majoritet av de upplivande cancercellinjerna etableras på CAM. En viktig begränsning till engraftment kan vara den korta 10 dagars fönster tillåts för tumörtillväxt, vilket kan vara särskilt utmanande för en långsam växande cellinje för att fastställa tillräcklig massa på så kort tid.

En annan brist i CAM-modellen är skillnaden i fysiologi mellan fågelembryot och däggdjuren. Metastasering från CAM tumör till stora organ såsom lever eller lungor av embryot har upptäckts främst av känsliga PCR tekniker28. Den korta tillväxtperioden i CAM skulle vara otillräcklig för att fastställa stora metastaserande lesioner som kan verifieras genom histologiska analyser. Dessutom är den minskade vaskulära perfusionen av den ouppblåsta embryolungan inte gynnsam för att etablera eller stödja tillväxten av lungmetastaser. För att övervinna dessa begränsningar, ett godkännande från vår institutionella djuranvändning kommitté (IACUC) erhölls för att kläcka kycklingar från CAM tumör med embryon och hysa dem ytterligare 2 veckor efter kläckning. Förlängning av tiden för tumörtillväxt på detta sätt gjorde det möjligt för oss att upptäcka avlägsna lungmetastaser av IHC. Även om kläckts kyckling studier kräver ytterligare IACUC godkännande att CAM tumör studier inte, ger detta tillvägagångssätt en värdefull möjlighet att studera metastaserande kaskad hos kycklingar som tidigare gjorts hos möss. Kycklingimmunsystemet har rapporterats utveckla från och med dag 12 efter befruktning20. Med tanke på den höga effektiviteten av engrafting murine härledda RENCA tumörer rapporteras här och många andra mänskliga cancer cellinjer och PDXs i CAM på dag 10 efter befruktning24,25,27, vi kan dra slutsatsen att immunsystemet i embryot inte är fullt utvecklad på denna punkt. Samspelet mellan kycklingens immunförsvar och CAM-tumören motiverar tydligt ytterligare utredning.

Vårt arbete ger starka stödjande bevis för att CAM tumörmodellen kan vara en enkel första in vivo modell för att studera cancerbiologi, inklusive metastasering. På grund av de begränsningar som anges ovan bör CAM-modellen inte ersätta musmodellen, utan komplettera den. Vår pågående forskning tyder på att signal mellanbörden mellan heterogena cellpopulationer i ccRCC är avgörande för att styra metastaserande progression11,12. Användningen av både CAM och musmodeller kan vara ett värdefullt sätt att validera det metastaserande tvärkort en spela i ccRCC. Vi tror att de många fördelarna med CAM-modellen som presenteras här skulle kunna påskynda upptäckten av nya metastaserande mekanismer och effektiva behandlingar för att avhjälpa detta dödliga stadium av cancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av UCLA JCCC utsäde bidrag, UCLA 3R bidrag, UCLA CTSI, och UC TRDRP (LW). Vi tackar Crump Institutets prekliniska imaging facility, TPCL, och UCLA: s Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) för deras hjälp med experimentella metoder. Flow cytometri utfördes i UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) och Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility som stöds av National Institutes of Health Awards P30 CA016042 och 5P30 AI028697, och av JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine vid UCLA, UCLA Kansler's Office, och UCLA Kansler Vice's Office of Research. Statistik konsulttjänster och dataanalys tjänster tillhandahölls av UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, och Research Design (BERD) Program som stöds av NIH / National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning 25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18
anti-VHL antibody Abcam ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD Biosciences 14-826-79
BD Pharm Lyse BD Biosciences 555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826-5D
DAB Chromogen Kit Biocare Medical DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) eBioscience 14-6681-82
Ethanol 200 Proof Cylinders Management 43196-11 Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Fisher Scientific 10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls Fisher Scientific 22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology MilliporeSigma 1.00496.5000
Hamilton customized syringe Hamilton 80408 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11) Santa Cruz Biotechnology sc805
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein Animal Health 1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" Medex Supply MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation MilliporeSigma 2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin Fisher Scientific MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium Sigma Aldrich 57-33-0 Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use Ricca Chemical 395516
pSicoR Addgene 11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC227420500
Renca ATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Corning 10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile Fisher Scientific AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) Thomas Scientific 1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls Office Depot 220717
Suture Ethicon J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 1634
Thermo-Chicken Heated Pad K&H manufacturing 1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017
VHL-KO CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR Fisher Scientific 50-822-331
Wound autoclips kit Braintree scientific, inc. ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical Fisher Scientific X3S-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353, (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23, (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15, (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15, (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45, (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19, (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31, (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5, (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8, (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328, (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14, (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32, (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182, (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136, (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16, (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2, (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33, (2), 255-268 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics