विनाइल क्लोराइड और पर्यावरण और मोटापा बातचीत के एक मॉडल के रूप में उच्च वसा आहार

Medicine
 

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य निम्न स्तर के विषाक्त जोखिम का एक मूत्र मॉडल विकसित करना था जो अप्रकाशयय चोट का कारण नहीं बनता है बल्कि पहले से मौजूद यकृत क्षति को बढ़ा देता है। यह प्रतिमान मानव एक्सपोजर और सुरक्षित माने जाने वाले विषाक्त सांद्रता के संपर्क में आने वाले सूक्ष्म परिवर्तनों को बेहतर ढंग से बदल ता है।

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Lang, A. L., Goldsmith, W. T., Schnegelberger, R. D., Arteel, G. E., Beier, J. I. Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction. J. Vis. Exp. (155), e60351, doi:10.3791/60351 (2020).

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Abstract

विनाइल क्लोराइड (वीसी), एक प्रचुर मात्रा में पर्यावरण संदूषक, उच्च स्तर पर स्टीटोहेपेटाइटिस का कारण बनता है, लेकिन निचले स्तर पर सुरक्षित माना जाता है। हालांकि कई अध्ययनों ने वीसी की भूमिका की प्रत्यक्ष हेपेटोटॉक्सेंट के रूप में जांच की है, लेकिन यह अवधारणा कि कुलपति उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) के कारण होने वाले गैर-अल्कोहलिक फैटी लिवर डिजीज (NAFLD) जैसे अन्य कारकों के लिए जिगर की संवेदनशीलता को संशोधित करता है, उपन्यास है। यह प्रोटोकॉल वीसी के लिए पुरानी, निम्न स्तर के जोखिम के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक एक्सपोजर प्रतिमान का वर्णन करता है। चूहों को साँस लेने के जोखिम की शुरुआत से एक सप्ताह पहले कम वसा या उच्च वसा वाले आहार के लिए आदत है और प्रयोग के दौरान इन आहार पर रहते हैं । चूहों को वीसी (उप-OSHA स्तर: <1 पीपीएम) या कमरे की हवा को 6 घंटे/दिन, 5 दिन/सप्ताह के लिए सांस लेने वाले कक्षों में 12 सप्ताह तक उजागर किया जाता है । शरीर के वजन और भोजन की खपत के लिए पशुओं पर साप्ताहिक निगरानी की जाती है। कुलपति एक्सपोजर के इस मॉडल के कारण अकेले वीसी साँस लेना के साथ कोई अप्रकाशित जिगर की चोट नहीं है । हालांकि, वीसी और एचएफडी का संयोजन लिवर की बीमारी को काफी बढ़ाता है। इस सह-एक्सपोजर मॉडल का एक तकनीकी लाभ पूरे शरीर का एक्सपोजर है, संयम के बिना। इसके अलावा, स्थितियां अधिक बारीकी से अंतर्निहित गैर-मादक फैटी जिगर की बीमारी के साथ कुलपति के लिए एक संयुक्त जोखिम की एक बहुत ही आम मानव स्थिति के समान है और इसलिए उपन्यास परिकल्पना का समर्थन करती है कि वीसी मोटापे की जटिलता के रूप में जिगर की क्षति के विकास के लिए एक पर्यावरणीय जोखिम कारक है (यानी, NAFLD)। यह काम प्रतिमान को चुनौती देता है कि कुलपति (व्यावसायिक और पर्यावरण) की वर्तमान एक्सपोजर सीमाएं सुरक्षित हैं। इस मॉडल का उपयोग कुलपति जोखिम के जोखिम पर नई रोशनी और चिंता बहाया जा सकता है । विषाक्त-प्रेरित यकृत चोट के इस मॉडल का उपयोग अन्य अस्थिर कार्बनिक यौगिकों के लिए और अन्य बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो यकृत और अन्य अंग प्रणालियों को प्रभावित कर सकते हैं।

Introduction

कई विषाक्त पदार्थ हवा में मौजूद होते हैं जो हम बहुत कम स्तर पर सांस लेते हैं। विनाइल क्लोराइड (वीसी) पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) प्लास्टिकउत्पादों को बनानेके लिए उद्योग द्वारा उपयोग की जाने वाली मोनोमेरिक गैस है 1। यह एक प्रचलित पर्यावरण हेपेटोटॉक्सिकेंट, ज्ञात कार्सिनोजन है, और ATSDR खतरनाक पदार्थ प्राथमिकता सूची2पर #4 स्थान पर है । मानव स्वास्थ्य और मौजूदा सह-रुग्णताओं के साथ बातचीत पर विषाक्त प्रभावों को बेहतर ढंग से समझने के लिए, मानव एक्सपोजर की नकल करने वाले एक्सपोजर के मॉडल स्थापित करना महत्वपूर्ण है। इस समूह की प्राथमिक रुचि कम सांद्रता पर पुरानी कुलपति जोखिम के हेपेटिक प्रभावों का अध्ययन करना है। कुलपति जिगर पर अपने मुख्य प्रभाव डालती है, जहां यह दिखाया गया है (उच्च सांद्रता पर) के लिए steatosis का कारण है, और विषाक्त से जुड़े स्टीटोहेपेटाइटिस (TASH) परिगलन, फाइब्रोसिस, सिरोसिस3,4,साथ ही हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) और अंयथा अत्यंत दुर्लभ हेपेटिक हेमांजियोसारकोमा5के साथ । ताश की संभावना दशकों से आबादी में मौजूद है , लेकिनजांचकर्ताओंद्वारा 4,6की सराहना की गई और इसकी सराहना की गई . कुलपति जोखिम के लिए प्रत्यक्ष विषाक्तता चिंताओं का प्रदर्शन अनुसंधान का एक परिणाम के रूप में, व्यावसायिक सुरक्षा और स्वास्थ्य प्रशासन (OSHA) एक 8 घंटे काम दिन7पर 1 पीपीएम के लिए स्वीकार्य जोखिम दहलीज कम । हालांकि जोखिम सीमा कम कर दिया गया है, मानव स्वास्थ्य पर कुलपति की इस एकाग्रता का प्रभाव अस्पष्ट7है । इसके अतिरिक्त, जिगर की बीमारी जैसे मौजूदा comorbidities पर कुलपति जोखिम का प्रभाव, काफी हद तक अज्ञात8है । यह ज्ञान अंतर आज विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि नॉनअल्कोहलिक फैटी लिवर डिजीज (नालएफडी)4,6,7,9,10,11,12की बढ़ती वैश्विक व्यापकता है । महत्वपूर्ण बात, वीसी को हाल ही में अन्य कारणों से जिगर की बीमारी के लिए एक स्वतंत्र जोखिम कारक दिखाया गया है13। इसप्रोटोकॉल का लक्ष्य इसलिए अस्थिर पर्यावरण विषाक्त, अंतर्निहित जिगर की चोट के संदर्भ में कुलपति के संपर्क के लिए एक प्रासंगिक साँस लेना मॉडल विकसित करने के लिए, मानव जोखिम की नकल और क्षमता की पहचान करने के लिए, कुलपति के उपन्यास तंत्र-प्रेरित या कुलपति बढ़ाया जिगर की चोट थी ।

कई पर्यावरणविषाक्त पदार्थों और प्रदूषकों के लिए जोखिम का मुख्य मार्ग साँस लेना के माध्यम से है । एक बार साँस लेने के बाद, यौगिक फेफड़ों के माध्यम से प्रणालीगत परिसंचरण में प्रवेश कर सकता है, यकृत की यात्रा कर सकता है, और14,15,16को उत्सर्जित करने से पहले हेपेटिक एंजाइमों द्वारा मेटाबोलिक रूप से सक्रिय हो सकता है। यह अक्सर ये सक्रिय मेटाबोलाइट्स होते हैं जो शरीर के भीतर विषाक्तता और क्षति का कारण बनते हैं। इस समूह और अन्य लोगों द्वारा पिछले अध्ययनों में वीसी गैस17,18के संपर्क में आने के लिए वीसी मेटाबोलाइट्स को किराए के रूप में इस्तेमाल किया गया है । अन्य समूहों ने वीसी के साँस लेने मॉडल का उपयोग किया है; हालांकि, तीव्र विषाक्तता, गंभीर हेपेटिक चोट, और ट्यूमर विकास19प्रेरित करने के लिए बेहद उच्च एक्सपोजर स्तर (>50 पीपीएम) लागू किया गया । यद्यपि इन अध्ययनों ने वीसी-प्रेरित कैंसरजनकता की महत्वपूर्ण जानकारी और तंत्र प्रदान किए हैं, लेकिन वे अन्य योगदान कारकों के साथ सूक्ष्म प्रभावों और जटिल बातचीत को फिर से तैयार नहीं करते हैं और इसलिए मानव एक्सपोजर के लिए कम प्रासंगिक हैं।

कुलपति-साँस लेना प्लस उच्च वसा आहार (एचएफडी) मॉडल यहां वर्णित (टाइमलाइन के लिए चित्रा 1 देखें), पुरानी, कम खुराक कुलपति एक्सपोजर (यानी, उप-OSHA एकाग्रता) का पहला मॉडल है, जिसमें चूहों को उन परिस्थितियों के तहत विषाक्त रूप से उजागर किया जाता है जो मानव जोखिम की नकल करते हैं बहुत अधिक बारीकी से। दरअसल, इस मॉडल के डेटा ने वीसी के संपर्क में आने वाले मनुष्यों में देखे गए परिणामों को संक्षिप्त किया, जैसे मेटाबोलिक रास्तों पर प्रभाव20,ऑक्सीडेटिव तनाव और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन4। साँस लेना के अन्य माउस मॉडल, जैसे सिर-केवल और नाक-केवल मॉडल21,की आवश्यकता है कि जानवर को नियंत्रित किया जाए, जिससे जानवर को तनाव हो। यहां, इस पूरे शरीर जोखिम विधि जानवरों के लिए इंजेक्शन या अनावश्यक तनाव की आवश्यकता नहीं है । जानवरों के भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग किया है और प्रति दिन और प्रति सप्ताह दिनों की एक निर्धारित संख्या के लिए बड़ा साँस लेना कक्ष के भीतर रखा जाता है । इसके अलावा, अवधारणा है कि कुलपति एक और हेपेटोटॉक्सेंट के प्रति संवेदनशीलता को संशोधित करता है एक उपन्यास खोज है, पहले इस समूह12 द्वारा प्रदर्शन किया और सांद्रता पर कुलपति जोखिम के लिए निहितार्थ है अच्छी तरह से प्रत्यक्ष hepatotoxicity के लिए आवश्यक उन लोगों के नीचे ।

साँस लेना जोखिम की इस विधि का उपयोग हमारे वातावरण में मौजूद अन्य अस्थिर कार्बनिक यौगिकों सहित विभिन्न गैसीय विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने की नकल करने के लिए किया जा सकता है। दरअसल, अस्थिर कार्बनिक यौगिक पर्यावरण विषाक्त पदार्थों का एक बड़ा समूह हैं और औद्योगिक क्षेत्रों में अधिक प्रचलित हैं, जिसके परिणामस्वरूप कुछ आबादी पुराने जोखिम22के लिए अधिक जोखिम में है। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रयोगात्मक प्रश्नों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। प्रशासित यौगिक की समय और एकाग्रता की लंबाई भिन्न हो सकती है। हालांकि शुरू में जिगर की चोट के निर्धारण के लिए विकसित, अन्य अंग प्रणालियों कर सकते है और इस मॉडल23के साथ अध्ययन किया गया है । जांचकर्ताओं जो जानवरों के साथ पुराने जोखिम का अध्ययन करने का लक्ष्य है, लेकिन पशु तनाव को कम करना चाहते हैं, इस मॉडल का उपयोग करने पर विचार करना चाहिए ।

Protocol

पर्यावरण स्वास्थ्य विभाग द्वारा सभी पशु/कुलपति प्रयोगों को अनुमोदित किया गया था, प्रयोगशाला पशु देखभाल और प्रक्रियाओं के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए सुरक्षा संघ को स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. शुद्ध, प्रायोगिक आहार के लिए प्रायोगिक सेट-अप और अनुकूलन

  1. C56Bl/6J चूहों (प्रति समूह न्यूनतम 6−8 चूहों) की कुल संख्या निर्धारित करें।
    नोट: प्रत्येक आहार समूह के पशुओं को एक्सपोजर समूहों में आगे उप-विभाजित किया जाएगा। अध्ययन की योजना बनाते समय आवश्यक जानवरों की कुल संख्या के लिए खाते में सुनिश्चित करें।
  2. जानवरों की पहचान करें और उनका वजन करें। इन आंकड़ों को रिकॉर्ड करें।
  3. नए आहार के लिए चूहों को acclimate करने के लिए साँस लेना प्रयोगों की शुरुआत करने से एक सप्ताह पहले नियमित चाउ से शुद्ध कम वसा (LFD) या उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) के लिए नियमित चाउ से आहार स्विच करें (टाइमलाइन के लिए चित्रा 1 देखें)।
  4. भोजन और पानी विज्ञापन लिपटम प्रदान करें। वजन और भोजन रिकॉर्डिंग के लिए प्रति पिंजरे दिया जा द्वारा भोजन की खपत की निगरानी, और वजन और प्रत्येक खिला दिन पर भोजन के शेष रिकॉर्डिंग । यदि प्रति पिंजरे 4 चूहों आवास, प्रति सप्ताह दो बार भोजन के ~ 50 ग्राम प्रदान करते हैं। यदि आवास 5 चूहों प्रति पिंजरे, प्रति सप्ताह दो बार भोजन के ~ 60 ग्राम प्रदान करते हैं।
    नोट: शुद्ध आहार के भोजन के दौरान, चूहों के पर्याप्त छर्रों को सुनिश्चित करने के लिए हर दिन भोजन की मात्रा की जांच की जानी चाहिए। यदि अपर्याप्त छर्रों हैं तो चूहे भोजन को 'ढेर' करते हैं और सेवन बढ़ाते हैं। इसके अलावा, विशेष रूप से एचएफडी एलएफडी की तुलना में बहुत अधिक टूटने की प्रवृत्ति है, जिससे समान प्रभाव पड़ता है।
  5. पशु स्वास्थ्य सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के दौरान जानवरों की निगरानी करें।
    नोट: साप्ताहिक वजन बढ़ाने और खाद्य खपत, मेटाबोलिक निगरानी के साथ समग्र पशु स्वास्थ्य का एक सूचकांक प्रदान करने के लिए किया जा सकता है ।

2. विनाइल क्लोराइड साँस लेना एक्सपोजर सिस्टम

नोट: व्यावसायिक रूप से कई साँस लेने वाले एक्सपोजर सिस्टम उपलब्ध हैं, जिसमें 'नाक-केवल' से लेकर 'पूरे शरीर' एक्सपोजर और स्वचालित सिस्टम तक मैनुअल शामिल हैं। इस समूह द्वारा पहले प्रकाशित आंकड़े पूरे शरीर की नियमावली प्रणाली12,23,24से प्राप्त किए गए थे . स्वचालित साँस लेने के जोखिम प्रणाली का वर्णन एक आरेख चित्र 2में दिखाया गया है ।

  1. सुनिश्चित करें कि दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण कक्षों में मंद हवा उच्च दक्षता कण हवा (HEPA) और सक्रिय कार्बन फ़िल्टर, सूखे और दबाव अपने संबंधित प्रवाह माप उपकरणों में प्रवेश करने से पहले विनियमित है (जन प्रवाह नियंत्रक [एमएफसी ]- प्रायोगिक कक्ष, रोटामीटर-नियंत्रण कक्ष) ।
    नोट: नियंत्रण कक्ष में, रोटामीटर चूहों को एयरफ्लो को नियंत्रित करता है। हवा कक्ष के शीर्ष में प्रवेश करती है, चूहों से गुजरती है, फिर चूहों के नीचे समाप्त हो जाती है और रासायनिक हुड में प्रवेश करने से पहले हेपा फिल्टर से गुजरती है। कक्ष के भीतर तापमान और सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) मापा जाता है। प्रायोगिक कक्ष में डिल्यूट हवा को वीसी टैंक से हवा के साथ मिलाया जाता है। दोनों प्रवाहों को एमएफसी के साथ विनियमित किया जाता है। दोनों मिश्रणों का अनुपात प्रायोगिक कक्ष में वीसी की एकाग्रता निर्धारित करता है। कुलपति सात जेट विमानों के साथ एक फैलाव के माध्यम से एक्सपोजर चैंबर के शीर्ष में प्रवेश करती है कि अलग दिशाओं में बिंदु । कुलपति चूहों से गुजरता है और फिर 12 अलग बंदरगाहों कि पिंजरे रैक के नीचे तैनात है के माध्यम से समाप्त हो गया है । इस कक्ष डिजाइन को पहले25से समरूप विषाक्त सांद्रता प्रदान करने के लिए दिखाया गया है ।
  2. सुनिश्चित करें कि प्रायोगिक और नियंत्रण कक्षों के भीतर से दबाव, तापमान और आरएच की निगरानी की जाए।
  3. पुष्टि करें कि कक्ष निकास एक HEPA फिल्टर, एक सीओ2 जांच के माध्यम से पारित किया जाता है, और रासायनिक हुड के निकास क्षेत्र में प्रवेश करने से पहले एक सक्रिय कार्बन फिल्टर और यह सुनिश्चित करने के लिए सीओ2 स्तर पर नजर रखी जाती है कि चूहों को स्वीकार्य वेंटिलेशन प्राप्त हो रहा है।
  4. साँस लेना जोखिम के दौरान पर्यावरण चर को बदलने, निगरानी करने और रिकॉर्ड करने के लिए कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: यदि मैन्युअल प्रणाली का उपयोग किया जाता है, तो एक्सपोजर अवधि के दौरान नियमित रूप से आवश्यक होने पर चरण 2.1−2.4 में वर्णित चरों की निगरानी और अंशांकित किया जाना चाहिए।

3. प्री-एक्सपोजर सेट-अप

  1. तकनीशियन सुरक्षा के लिए प्रायोगिक और नियंत्रण कक्षों में सभी एयरफ्लो बंद कर दें।
  2. प्रत्येक कक्ष के लिए, कक्ष का दरवाजा खोलें और मल-मूत्र पैन के शीर्ष पर शोषक बिस्तर सामग्री (शोषक पक्ष) रखें। एक्सपोजर अवधि में एक आरामदायक आर्द्रता स्तर (40−60% आरएच) प्रदान करने के लिए शोषक सामग्री गीला करें।
  3. चैंबर में वीसी का वांछित एक्सपोजर लेवल सेट करें। उप OSHA सीमा सांद्रता के लिए कुलपति के 0.85 पीपीएम का उपयोग करें। या तो सॉफ्टवेयर-प्रबंधित, डिटेक्टर-आधारित प्रतिक्रिया नियंत्रण का उपयोग कक्ष में कुलपति वितरण या सिस्टम में मैनुअल समायोजन का उपयोग करें।
    नोट: बाद के दृष्टिकोण चैंबर की मात्रा, चैंबर ताज़ा दर, एयरफ्लो और स्टॉक की आपूर्ति से कुलपति गैस की वितरण दर के ज्ञान की आवश्यकता है; इन गणनाओं को बाद में स्थिर राज्य12,24स्थित चैंबर में कुलपति सांद्रता के माप द्वारा मान्य और अंशांकित किया जाना चाहिए . कक्ष में वीसी को मापने के लिए सबसे आम तकनीक नमूना हवा12,24के गैस क्रोमेटोग्राफिक विश्लेषण के माध्यम से है । कुलपति वितरण की सटीकता और परिशुद्धता के बारे में सॉफ्टवेयर-संचालित दृष्टिकोण के फायदे स्पष्ट हैं। हालांकि, यह दिखाया गया है कि मैनुअल दृष्टिकोण भी सटीक और सुसंगत12,24है ।
    सावधानी: कुलपति उच्च स्तर पर एक ज्ञात विषाक्त और कैंसरकारक है। कक्षों को चालू और बंद करते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और गैस की हैंडलिंग का प्रयोग करें।

4. एक्सपोजर पिंजरे और पशु तैयारकरने

  1. चूहों को उनके आवास कक्षों से निकालें और उन्हें साँस लेने वाले कक्ष पिंजरे रैक (नियंत्रण चूहों के लिए एक पिंजरे रैक, उजागर चूहों के लिए एक) के व्यक्तिगत पिंजरों में रखें। पिंजरे रैक के भीतर प्रत्येक माउस के प्लेसमेंट को दैनिक रूप से यादृच्छिक करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक माउस एक्सपोजर चैंबर के भीतर समरूप रूप से उजागर हो। प्रयोगशाला नोटबुक में प्रत्येक जानवर की संख्या और पिंजरे प्लेसमेंट की स्थिति को चिह्नित करें।
  2. प्रत्येक पिंजरे रैक को अपने संबंधित कक्ष में रखें और कक्ष के दरवाजे बंद करें।

5. एक्सपोजर का आयोजन

  1. यह सुनिश्चित करें कि वीसी गैस टैंक के लिए वाल्व खुली स्थिति में है। सुनिश्चित करें कि प्रायोगिक कक्ष के लिए दिलका प्रवाह 25 एल/मिन के लिए निर्धारित है ।
  2. प्रायोगिक कक्ष में डिल्यूट फ्लो शुरू करें। सुनिश्चित करें कि नियंत्रण कक्ष पर रोटामीटर 25 एल/मिन के लिए सेट है ।
  3. सुनिश्चित करें कि सभी सेंसर (प्रवाह, तापमान, आर्द्रता, कक्ष दबाव, सीओ2 स्तर) सही ढंग से काम कर रहे हैं और दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण कक्षों में अपेक्षित परिणाम प्रदर्शित कर रहे हैं।
    नोट: कुलपति प्रवाह की गणना की जाती है और दिली प्रवाह और वांछित कुलपति एकाग्रता के आधार पर सेट किया जाता है।
  4. सुनिश्चित करें कि पूरे एक्सपोजर में, प्रायोगिक कक्ष में, एक्सपोजर समय, दिलदार प्रवाह, कुलपति प्रवाह, तापमान, आर्द्रता, कक्ष दबाव, सीओ2 स्तर, और सैद्धांतिक कुलपति एकाग्रता प्रदर्शित, रेखांकन और दर्ज की जाती है। पुष्टि करें कि नियंत्रण कक्ष के लिए तापमान और आर्द्रता भी प्रदर्शित, रेखांकन और दर्ज की जाती है।
    नोट: यदि किसी मैन्युअल प्रणाली का उपयोग किया जाता है, तो कुलपति प्रवाह को एक्सपोजर अवधि के दौरान आवश्यक होने पर जांच और समायोजित किया जाना चाहिए।
  5. यदि एक्सपोजर के दौरान कोई समस्या होती है, तो कुलपति प्रवाह को शून्य पर सेट करें और कक्ष को जल्दी से शुद्ध करने के लिए अपने अधिकतम मूल्य में डिमुएंट प्रवाह को बढ़ाएं।
  6. एक बार एक्सपोजर अवधि (यानी, 6 एच/डे) पहुंच जाने के बाद सॉफ्टवेयर अपने आप वीसी फ्लो बंद कर देता है । 15 मिनट सुरक्षा टाइमर तो प्रायोगिक कक्ष के लिए अवधि के बाद समय के लिए शुरू होता है कुलपति को साफ करने के लिए । एक बार जानवरों को हटाना सुरक्षित होने के बाद डायलॉग बॉक्स में ओके बटन पर क्लिक करें। सिस्टम फ़ाइल को माप दर्ज करना बंद कर देगा और एक्सपोजर खत्म हो जाएगा।
    नोट: यदि मैन्युअल प्रणाली का उपयोग किया जाता है, तो उपयोगकर्ता को एक्सपोजर अवधि के अंत में वीसी प्रवाह को मैन्युअल रूप से बंद करना होगा और एक्सपोजर के अंत में कुलपति निकासी के लिए समय की गणना की जानी चाहिए।

6. पोस्ट-एक्सपोजर

  1. बंद स्थिति के लिए कुलपति गैस टैंक के लिए वाल्व पर स्टॉपकॉक बारी और जोखिम कक्ष में सभी एयरफ्लो बंद कर दें । रोटामीटर को तब तक चालू करें जब तक कि नियंत्रण कक्ष के माध्यम से कोई एयरफ्लो न हो जाए।
  2. चूहों को वेंटिलेशन प्रदान करने के लिए प्रत्येक कक्ष से दरवाजे निकालें। कोठियों से पिंजरे रैक निकालें। एक हुड के नीचे, चूहों को उनके एक्सपोजर पिंजरों से हटा दें और उन्हें वापस उनके आवास पिंजरों में रखें। नियमित पिंजरों में रात भर आवास के लिए सभी चूहों को वापस उनके आवास कक्ष में परिवहन करें।
  3. मल पैन से किसी भी कचरे को पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा विभाग (डीईएचएस) में निपटाना- अनुमोदित बायोहैजार्ड कंटेनर, क्योंकि इन्हें संस्थागत पर्यावरणीय स्वास्थ्य सेवाओं द्वारा रासायनिक खतरा माना जा सकता है। प्रयोगात्मक और नियंत्रण प्रणालियों के लिए चैंबर दरवाजे, मल पैन, एक्सपोजर पिंजरे रैक और एक्सपोजर चैंबर को साफ करें।

7. एक्सपोजर के दौरान कक्षों के भीतर कुलपति एकाग्रता का सत्यापन

  1. प्रत्येक एक्सपोजर (3 एच) के माध्यम से आधे रास्ते में प्रायोगिक कक्ष के भीतर कुलपति एकाग्रता का मापन करें।
  2. एक कुलपति डिटेक्टर ट्यूब और एक पूर्व निर्धारित ट्यूब पर कांच के सुझावों को तोड़ें। वीसी डिटेक्टर ट्यूब के फ्लो आउट एंड को डिटेक्टर ट्यूब पंप से अटैच करें। वीसी डिटेक्टर ट्यूब के प्रवाह-इन अंत को ट्यूबिंग के एक छोटे से टुकड़े के साथ प्रीट्रीट ट्यूब के प्रवाह-आउट अंत में संलग्न करें। प्रीट्रीट ट्यूब के प्रवाह-अंत में ट्यूबिंग का एक छोटा टुकड़ा संलग्न करें।
  3. चूहों के श्वास क्षेत्र के पास है कि नमूना बंदरगाहों में से एक से एक प्लग निकालें। प्रीट्रीट ट्यूब के प्रवाह-अंत से ट्यूबिंग को नमूना बंदरगाह पर संलग्न करें।
  4. पूर्ण स्थिति से, डिटेक्टर ट्यूब पंप के पिस्टन पर हैंडल को पूर्ण स्थिति तक बढ़ाएं। यह चैंबर से नमूना गैस के १०० मीटर खींच ने ९० एस की अवधि में कुलपति डिटेक्टर ट्यूब में होगा । 90 एस इंतजार करने के बाद, हैंडल को वापस धक्का दें।
  5. चरण 7.4 तीन बार और दोहराएं ताकि कुल 400 मीटर कुलपति डिटेक्टर ट्यूब में खींच लिया जाए।
  6. कक्ष के नमूना बंदरगाह से ट्यूब निकालें और बंदरगाह में प्लग फिर से डालें। चैंबर के भीतर वीसी एकाग्रता का पता लगाने के लिए वीसी डिटेक्टर ट्यूब के रंग परिवर्तन का निरीक्षण करें।
  7. प्रयोगशाला नोटबुक में कुलपति डिटेक्टर ट्यूब पढ़ने रिकॉर्ड और सैद्धांतिक मूल्य की तुलना करें। एक उपयुक्त कंटेनर में कुलपति डिटेक्टर ट्यूब और प्रीट्रीट ट्यूब का निपटान करें।

8. साँस लेने के जोखिम प्रयोग की समाप्ति

नोट: एक्सपोजर के वांछित समय के बाद, उदाहरण के लिए, 6, 8, और/या 12 सप्ताह साँस लेना जोखिम की शुरुआत के बाद, प्रयोगों को समाप्त किया जा रहा है और जानवरों को इच्छामृत्यु दी जाएगी (टाइमलाइन के लिए चित्रा 1 देखें)।

  1. इच्छामृत्यु के समय से 4 घंटे पहले चूहों को तेज करें।
    नोट: यह प्रक्रिया मेटाबोलिक विश्लेषण के लिए उपवास रक्त ग्लूकोज और इंसुलिन के स्तर के निर्धारण की अनुमति देती है।
  2. अमेरिकी पशु चिकित्सा चिकित्सा संघ (AVMA) दिशानिर्देशों के अनुरूप इच्छामृत्यु दृष्टिकोण का उपयोग करें, जैसे कि एक्ससेंक्शन के बाद संज्ञाहरण।
  3. संज्ञाहरण को प्रेरित करने के लिए प्रत्येक माउस को इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा केटामाइन/जाइलाज़ीन (100/15 मिलीग्राम/किलो) का प्रशासन करें।
    नोट: सोडियम पेंटोबार्बिटल को पूर्व-इच्छामृत्यु एनेस्थेटिक के रूप में बचें, क्योंकि विनाइल क्लोराइड एक्सपोजर इसकी प्रभावशीलता में बाधा डाल सकता है।
  4. रक्त जमावट को रोकने और नमूना संरक्षण के लिए, अवर वेना कावा से सोडियम साइटरेट समाधान (अंतिम, 0.38%) में रक्त एकत्र करें।
  5. लिवर और/या किसी अन्य वांछित अंग को हटा दें। तरल नाइट्रोजन में जिगर और स्नैप-फ्रीज भागों को विच्छेदन करें, जमे हुए नमूने माध्यम में एम्बेड करें, और हिटोलॉजी के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन में ठीक करें।
  6. सेंट्रलाइज्ड के माध्यम से रक्त से अलग प्लाज्मा और सिटेड प्लाज्मा को एक उपयुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें और विश्लेषण के लिए आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. जिगर की चोट के हिस्टोलॉजिकल सूचकांकों का मूल्यांकन करने के लिए, हेमैटोक्सिलिन और ईसिन (एच एंड ई) 5 माइक्रोन फॉर्मेलिन फिक्स्ड-पैराफिन एम्बेडेड लिवर सेक्शन के साथ धुंधला प्रदर्शन करें और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ छवियां प्राप्त करें।
  8. प्लाज्मा ट्रांसमिनेस स्तर प्राप्त करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके सिटरेटेड प्लाज्मा पर एलेनिन अमीनोट्रांसफरेज (एसीटी) और एस्पार्टेट अमीनोट्रांसफरेज़ (एसीटी) काइनेटिक परख दोनों करें।
    नोट: गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, C57Bl/6J चूहों के लिए प्लाज्मा ट्रांसामिनिस सामान्य श्रेणी में होना चाहिए (35−45 आईयू/एल) एलएफडी + कुलपति समूह के लिए, जबकि मूल्यों को एचएफडी + कुलपति समूह(चित्रा 3सी)के लिए ऊंचा (~ 150 आईयू/एल) होना चाहिए।

Representative Results

प्रयोग के दौरान, पशु स्वास्थ्य सुनिश्चित करने और वीवो मेटाबोलिज्म में मूल्यांकन करने के लिए पशु शरीर के वजन और खाद्य खपत की साप्ताहिक निगरानी की गई थी । चित्रा 3 में 12 सप्ताह के प्रयोग के लिए शरीर के वजन और भोजन की खपत को दर्शाया गया है। शरीर के वजन प्रति सप्ताह एक बार मापा गया था और भोजन की खपत सभी समूहों के लिए प्रति सप्ताह दो बार मापा गया था । सभी चूहों ने अध्ययन के दौरान वजन प्राप्त किया। जबकि, जैसा कि उम्मीद थी कि एचएफडी समूहों में चूहों ने एलएफडी समूहों में चूहों के रूप में अधिक वजन प्राप्त किया, वीसी के संपर्क में आए चूहों ने संबंधित नियंत्रण समूह में चूहों की तुलना में अधिक वजन नहीं बढ़ाया। खाद्य पदार्थों की खपत सभी समूहों12,24के बीच भिन्न नहीं थी .

चित्रा 3बी सामान्य आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए एच एंड ई के साथ दाग जिगर वर्गों के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ को दर्शाया गया है। एलएफडी समूह में वीसी ने कोई भी अधोापैथ परिवर्तन नहीं किया । एचएफडी फीडिंग में काफी वृद्धि हुई है जो स्टीटोसिस (वसा संचय) और कुलपति एक्सपोजर ने इस प्रभाव को बढ़ाया है। इसके अलावा, एचएफडी समूह में कुलपति एक्सपोजर के परिणामस्वरूप कुछ भड़काऊ फोसी12,24हुआ ।

प्लाज्मा ट्रांसमिनेज (एएलटी और एसीटी) के स्तर को यकृत क्षति के संकेतक के रूप में मापा गया था और एक ऊंचा ट्रांसामिनिस स्तर यकृत क्षति का सूचक है। एलएफडी ग्रुप में वीसी ने ट्रांसमिनेस का स्तर नहीं बढ़ाया। अकेले एचएफडी ने ट्रांसमिनेस के स्तर में थोड़ी वृद्धि की और महत्वपूर्ण बात यह है कि वीसी ने इस प्रभाव को काफी बढ़ाया(चित्रा 3सी)12,24

शरीर के वजन अनुपात के लिए जिगर के वजन प्रत्येक समूह के लिए गणना की गई । एचएफडी ने लिवर को शरीर के वजन अनुपात में काफी बढ़ा दिया। हालांकि, वीसी ने इस प्रभाव(चित्रा 3डी)12में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं की ।

Figure 1
चित्रा 1: साँस लेना मॉडल प्रक्रिया का अवलोकन। चूहों को शुद्ध आहार के लिए अनुकूलित करने के लिए 1 सप्ताह के लिए संबंधित कम वसा (13% संतृप्त वसा) या उच्च वसा (42% संतृप्त वसा) आहार विज्ञापन लिमिटम खिलाया जाता है। एक सप्ताह के बाद, चूहों को साँस लेना आहार के लिए पेश किया जाता है। इसके लिए, चूहों को 12 सप्ताह के लिए 6 एच/दिन, 5 दिन/सप्ताह के लिए 6 एच/डे, 5 दिन/सप्ताह के लिए एक उप-OSHA स्तर के कुलपति एकाग्रता के संपर्क के लिए अत्याधुनिक पूरे शरीर के साँस लेने वाले कक्षों में रखा जाता है । साँस लेना प्रक्रिया के दौरान चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच की अनुमति है। 12 हफ्तों में चूहों को सुबह से ही इच्छामृत्यु दी जाती है। इस मॉडल को पुरानी एक्सपोजर की लंबी अवधि तक बढ़ाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: साँस लेना कक्ष डिजाइन। समरूप विषाक्त सांद्रता प्रदान करने वाले स्वचालित साँस लेने वाले एक्सपोजर सिस्टम का एक आरेख दिखाया गया है। कस्टम सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता को साँस लेने के जोखिम के दौरान पर्यावरणीय चरों को बदलने, निगरानी करने और रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: अकेले विनाइल क्लोराइड से लिवर की चोट नहीं होती बल्कि आहार प्रेरित जिगर की बीमारी को बढ़ाता है। (A)शरीर के वजन और भोजन की खपत पर साप्ताहिक निगरानी की गई । (ख)एच एंड ई धुंधला द्वारा सामान्य यकृत आकृति विज्ञान के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ दिखाए गए हैं (आवर्धन = 200x)। (ग)जोखिम अवधि के अंत में सिटेड प्लाज्मा एकत्र किया गया था और जिगर की क्षति के सूचकांक के रूप में ट्रांसामिनेस एंजाइमेमेटिक गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गया था । (घ)जिगर का वजन विभिन्न प्रयोगात्मक समय बिंदुओं पर निर्धारित किया गया था और पूरे शरीर के वजन की तुलना में। परिणाम संबंधित एलएफडी नियंत्रण की तुलना में मतलब ± एसईएमए,पी एंड एलटी; 0.05 के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं; बी,पी एंड एलटी; 0.05 वीसी की अनुपस्थिति की तुलना में। नमूनों का आकार प्रति समूह एन = 8−10। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

वीसी-एन्हांस्ड NAFLD का यह मॉडल पूरे शरीर के साँस लेने वाले प्रतिमान में उप-OSHA सीमा कुलपति एक्सपोजर के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक उपन्यास विधि है। यह मॉडल जांचकर्ताओं को अकेले कुलपति के निम्न स्तर से उप-हेपेटोटॉक्सिक और संवेदनशील प्रभावों का अध्ययन करने की अनुमति देता है। दरअसल, यह सह-एक्सपोजर मॉडल बढ़ी हुई जिगर की चोट, प्लाज्मा एएलटी और एसीटी की ऊंचाई और मध्यम सूजन को प्राप्त करता है, जबकि काफी हद तक इस एकाग्रता23पर दिल जैसे अन्य अंग प्रणालियों को प्रभावित नहीं करता है। इस पुरानी मॉडल पूरे शरीर साँस लेना कक्षों की आवश्यकता है, लेकिन तनाव और जोखिम सांद्रता को कम करता है । हालांकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक सॉफ्टवेयर संचालित दृष्टिकोण है, हमारे अनुभव से पता चला है कि मैनुअल दृष्टिकोण भी12,24जोखिम का एक सटीक और सुसंगत तरीका है । इसके अलावा, यह अस्थिर कार्बनिक यौगिक एक्सपोजर22के कारण अन्य अंग क्षति23 सहित कई अनुसंधान क्षेत्रों पर आसानी से लागू होता है। विशेष रूप से, यह मॉडल पर्यावरणीय रसायनों और अंतर्निहित रोग5के लिए मानव सह-एक्सपोजर के रोगजनन के समान हो सकता है।

इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल अनुकूलन के कुछ महत्वपूर्ण कदम प्राप्त किए जाने चाहिए। उदाहरण के लिए, जांचकर्ताओं को यह स्थापित करना चाहिए कि कक्षों के भीतर वीसी या अन्य विषाक्त की एकाग्रता जोखिम की वांछित सीमा (यानी, निम्न स्तर, उप-OSHA, या तीव्र स्तर) के भीतर है। साँस लेना कक्ष के इस कदम का अनुकूलन ब्याज के मानव जोखिम के एक सफल मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, प्रति दिन एक्सपोजर के समय और प्रयोग की अवधि को समायोजित करने को भी संशोधित किया जा सकता है। इस समूह के हितों के अनुसार, एक व्यावसायिक एक्सपोजर सेटिंग हासिल की गई थी, और आहार के एक अतिरिक्त पैरामीटर का भी अध्ययन किया गया था। हालांकि, पर्यावरण और तीव्र एक्सपोजर भी इस प्रोटोकॉल के साथ मॉडलिंग किया जा सकता है ।

यह काम प्रतिमान को चुनौती देता है कि कुलपति (व्यावसायिक और पर्यावरण) की वर्तमान एक्सपोजर सीमाएं सुरक्षित हैं। दरअसल, हालांकि कुलपति के लिए वर्तमान OSHA एक्सपोजर सीमा 1 पीपीएम है, इस मॉडल ने साबित कर दिया है कि इस सीमा से नीचे वीसी की सांद्रता चूहों में एचएफडी की वजह से जिगर की चोट को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। यह प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को अध्ययन करने और एक उपन्यास विषाक्त एक्सपोजर प्रतिमान और मॉडल ताश की विशेषता की अनुमति देता है।

यह क्रोनिक, कम खुराक कुलपति एक्सपोजर का पहला मॉडल है। पिछले काम में वीसी एक्सपोजर के लिए सरोगेट के रूप में बहुत उच्च बोलस सांद्रता, तीव्र एक्सपोजर या सक्रिय मेटाबोलिट्स का उपयोग किया जाता था। इन दृष्टिकोणों के सभी मानव जोखिम के लिए निष्कर्षों की प्रासंगिकता कम । इसलिए, TASH-NAFLD इंटरैक्शन का यह उपन्यास मॉडल जांचकर्ताओं को निम्न स्तर के कुलपति एक्सपोजर की जटिल बातचीत की जांच करने के लिए आवश्यक मंच प्रदान करता है।

विष-प्रेरित यकृत चोट के इस मॉडल का उपयोग अन्य अस्थिर कार्बनिक यौगिकों के लिए और अन्य बातचीत का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जो यकृत और अन्य अंग प्रणालियों8,22,23को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, इस मॉडल गया है, और आगे किया जा सकता है, हस्तक्षेप चिकित्सा और इस प्रचलित विष24के लिए कार्रवाई के तरीके के गहन यंत्रवादी अध्ययन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया । चूंकि वीसी एक ज्ञात कार्सिनोजन26,27,28है, इस एक्सपोजर प्रतिमान को वीसी-प्रेरित कैंसर के अध्ययन के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। वीसी सह-एक्सपोजर द्वारा अल्कोहलिक लिवर रोग जैसी अन्य सह-रुग्णताओं को भी बढ़ाया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, विभिन्न प्रकार के वसा का अध्ययन करना रुचि होगी, जैसे पॉलीअनसैचुरेटेड फैट18,29,30,या विभिन्न प्रकार के कार्बोहाइड्रेट31 और इस मॉडल में वीसी के साथ उनके सह-एक्सपोजर। दरअसल, इन कारकों के सभी जिगर की चोट के विकास पर अंतर प्रभाव है और कुलपति प्रेरित hepatic रोग में एक भूमिका निभा सकता है जाना जाता है ।

अंत में, यह पर्यावरण विषाक्त प्रेरित जिगर की चोट का एक उपन्यास साँस लेना मॉडल है और पुरानी, निम्न स्तर के कुलपति जोखिम के लिए एक जोखिम प्रतिमान स्थापित करता है । इस मॉडल में उपयोग की जाने वाली वीसी की एकाग्रता अपने आप में उप-हेपेटोटॉक्सिक है, जबकि यह चूहों में एक अन्य कारक (एचएफडी) के कारण होने वाली यकृत चोट को बढ़ाती है। यह मॉडल जांचकर्ताओं को पुरानी कुलपति विषाक्तता के लिए तंत्र और हस्तक्षेप का अध्ययन करने की अनुमति देगा और उजागर मानव विषयों को देख रहे अनुवादात्मक अध्ययनों के लिए उपयोगी हो सकता है और एक्सपोजर के लिए उच्चतम जोखिम पर।

Disclosures

WT सुनार IEStechno में वित्तीय रुचि है, जो वर्णित प्रणाली के लिए टेम्पलेट है । शेष लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जूलियन बियर को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (K01 DK096042 और R03 DK107912) से पुरस्कारों द्वारा वित्त पोषित किया गया था। अनुसंधान को अनुदान संख्या P20GM113226 और राष्ट्रीय शराब के दुरुपयोग और शराब पर संस्थान के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (IDeA) द्वारा भी समर्थित किया गया था पुरस्कार संख्या P50AA024337 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALT/AST reagents Thermo Fisher TR70121, TR71121
C57Bl/6J mice The Jackson Laboratory 000664 Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the
appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age.
CO2 Monitor IEStechno Ex-Sens
Eosin Sigma E6003
Hematoxylin Sigma HHS16
Inhalation exposure chamber system IEStechno GasExpo The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs
Saturated fat (13%) control diet Teklad Diets TD.120336
Saturated fat (42%) diet Teklad Diets TD.07511
Sodium citrate Sigma 71497
Vinyl Chloride MATHESON TRI-GAS Series 3590-CGA* Handle gas with caution

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