Author Produced

Høy-gjennomstrømning total intern refleksjon fluorescens og direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi bruke en fotoniske chip

Biochemistry
 

Summary

Chip-basert super-oppløsning optiske mikroskopi er en ny tilnærming til fluorescens mikroskopi og gir fordeler i kostnadseffektivitet og gjennomstrømning. Her vises protokollene for klargjøring av chip og bildebehandling for TIRF-mikroskopi og lokaliserings BAS ert super oppløsnings mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Coucheron, D. A., Helle, Ø. I., Øie, C. I., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip. J. Vis. Exp. (153), e60378, doi:10.3791/60378 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) er vanligvis brukes i enkelt molekyl lokalisering basert super-oppløsning mikroskopi som det gir forbedret kontrast på grunn av optisk snitting. Den konvensjonelle tilnærmingen er å bruke høy numerisk blenderåpning mikroskop TIRF mål for både eksitasjon og samling, sterkt begrenser synsfelt og gjennomstrømning. Vi presenterer en ny tilnærming til å generere TIRF eksitasjon for Imaging med optiske bølgeledere, kalt chip-baserte nanoscopy. Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan chip-basert Imaging er utført i en allerede bygget oppsett. Den største fordelen med chip-basert nanoscopy er at eksitasjon og samlingen trasé er koblet. Imaging kan deretter gjøres med en lav forstørrelse linse, noe som resulterer i store synsfelt TIRF bilder, til prisen av en liten reduksjon i oppløsning. Liver sinusformet endothelial celler (LSECs) ble avbildet ved hjelp av direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (dstorm), viser en oppløsning som kan sammenlignes med tradisjonelle super-oppløsning mikroskop. I tillegg viser vi høy gjennomstrømming evnene ved Imaging en 500 μm x 500 μm regionen med en lav forstørrelse linse, som gir en oppløsning på 76 NM. Igjennom dens kompakt blokkannulleringstegn, flis-basert tenkelig kan ettermonteres i høyst vanlig mikroskop og kan kombinert med annet opp på-flis optisk teknikker, som opp på-flis sensing, spektroskopi, optisk overlappe, etc. Teknikken er således ideell for høy gjennomstrømming 2D super-oppløsning Imaging, men tilbyr også store muligheter for multi-modal analyse.

Introduction

Siden den første demonstrasjonen av enkelt molekyl lokalisering mikroskopi, har mange variasjoner blitt utviklet for å løse ulike utfordringer1,2,3. En utfordring som har vært, men er stort synsfelt dSTORM Imaging. Mange dstorm oppsett bruke samme objektiv linse til både opphisse prøven og til bildet det. For å øke synsfeltet, er en lav forstørrelse linse nødvendig. Lav forstørrelse og lav numerisk blenderåpning (NA) objektiv linser vanligvis har en stor dybdeskarphet, noe som resulterer i en økt ut-av-fly signal som vil redusere lokalisering presisjon. TIRF mål brukes vanligvis til å øke bildekontrasten ved å redusere ut-av-plan-fluorescens. Gjennom TIRF er eksitasjon begrenset til en optisk tykkelse på ca. 150 NM fra overflaten ved hjelp av et evanescent felt4. TIRF objektiv linser krever en stor NA som resulterer i et lite felt-of-view (FOV) (f. eks, 50 x 50 μm2), som begrenser gjennomstrømningen betraktelig. Det finnes imidlertid alternative måter å generere et evanescent felt på.

En optisk waveguide er en struktur som vil begrense og veilede lys hvis det er koblet inn i strukturen. Vanligvis brukes bølgeledere i fiberbasert telekommunikasjon. Det er gjort stor innsats for å utvikle 2D-integrerte bølgeledere som en hovedkomponent i fotoniske integrerte kretser. Teknologien har avansert til et punkt der fabrikere lavt tap nano-strukturert optiske bølgeledere kan rutinemessig gjøres5. I dag kan flere støperier rundt om i verden brukes til å utvikle fotoniske integrerte kretser. Bølgeledere guide lys gjennom totale interne refleksjon også viser et evanescent felt på overflaten. Ved forsiktig utforming av waveguide strukturen, kan en høy intensitet oppnås i evanescent feltet. En prøve plassert direkte på toppen av den waveguide overflaten kan dermed også bli opplyst av evanescent-feltet for bildebehandlingsprogrammer. Det evanescent feltet vil bli generert langs hele lengden og bredden av waveguide, og dermed kan det gjøres vilkårlig stor6.

Vi presenterer en ny tilnærming til TIRF dstorm som tilbyr et vilkårlig stort synsfelt. I stedet for å bruke en TIRF linse for både eksitasjon og samling, vi opphisse bruker evanescent feltet fra optiske bølgeledere. Dette decouples eksitasjon og oppsamlings lys vei, noe som åpner for total frihet langs oppsamlings lys banen uten at det går ut over den optiske snitting for en gitt bølgelengde gitt av waveguide chip-belysning. Lav forstørrelse linser kan dermed brukes til bildet svært store regioner i TIRF modus, selv om en mindre NA vil redusere lateral oppløsning. Videre er flerfarget Imaging også sterkt forenklet med bølgeledere7, som flere bølgelengder kan styres og oppdages uten justere systemet. Dette er fordelaktig for dstorm, så lave bølgelengder kan brukes til å forbedre fluoroforen blinke og for flerfarget Imaging. Det er verdt å merke seg at gjennomtrengning dybden av evanescent feltet vil endres som en funksjon av bølgelengde, selv om det ikke påvirker hvordan tenkelig prosedyren er utført. Brikken er kompatibel med live celle Imaging8 og er ideell for applikasjoner som integrering av materialer. Hver chip kan inneholde titalls bølgeledere, som kan tillate brukeren å bilde under ulike forhold eller bruke optisk overlapping9 og Raman spektroskopi10.

Det chip-baserte systemet fungerer like godt for både Diffraksjon og super oppløselig bildebehandling. En lignende tilnærming ble innført i 2005 ved hjelp av et prisme for å generere evanescent feltet eksitasjon4. Den fotoniske chip interesserer også gjennom evanescent feltet, men med moderne waveguide fabrikasjon teknikker, kan man generere eksotiske lys mønstre med bølgeledere. Den nåværende chip-baserte nanoscopy gjennomføringen er begrenset til 2D Imaging bare, som eksitasjon feltet er låst inne i waveguide overflaten. Fremtidig utvikling vil sikte for 3D-applikasjoner. I tillegg utvikles andre super oppløsnings teknikker som strukturert belysnings mikroskopi ved hjelp av samme chip-baserte mikroskop11.

Protocol

1. utarbeidelse av Polydimethylsiloxan (PDMS) lag

  1. Forbered en 10:1 blanding av Sylgard 184 monomer og herding agent.
  2. Plasser blandingen i et vakuum kammer til luftbobler er borte.
  3. Pour 1,7 g PDMS blanding i sentrum av en 3,5 tommer (diameter) Petri parabolen.
  4. Plasser Petri parabolen på vakuum Chuck av en spin elektrostatisk.
  5. Spin coat Petri parabolen for 20 s på 900 RPM, med en akselerasjon på 75 RPM/s.
  6. Cure fatet på en kokeplate ved 50 ° c i minst 2 timer.

2. prøve forberedelser

  1. Waveguide rengjøring
    1. Forbered 100 mL av en 1% fortynning av konsentrat av rengjøringsmiddel (tabell av materialer) i DEIONISERT (di) vann.
    2. Plasser brikken i et glass Petri parabolen ved hjelp av en wafer TWEEZER og dekk helt med vaskemiddel løsning.
    3. Plasser Petri parabolen på en varm plate ved 70 ° c i 10 min.
    4. Mens du fremdeles på den varmeplaten, gni overflaten med en renrom vevs dott.
    5. Fjern brikken fra Petri parabolen. Skyll med minst 100 mL av DI vann.
    6. Skyll med minst 100 mL isopropanol, ta vare på at løsemiddel ikke tørker på overflaten for å hindre fordampning av flekker.
    7. Skyll med minst 100 mL av DI vann. Blås brikken tørr med en nitrogen pistol.
  2. Kammer forberedelse
    1. Forbered et lag med 150 μm-Polydimethylsiloxan (PDMS) i en Petri-rett (del 1).
    2. Bruk en skalpell til å skjære en 1,5 cm x 1,5 cm ramme fra PDMS laget.
    3. Løft rammen fra Petri parabolen med en TWEEZER. Sett den flatt på en ren og polert chip. Eksemplet er nå klart for celle seeding.
  3. Fluorescerende merking
    1. Forbered følgende kjemikalier: fosfat-bufret saltoppløsning, fargestoff oppløsning (er), dstorm Imaging buffer.
    2. Etter celle seeding, fjerne brikken fra Media.
    3. Bruk en pipette for å fjerne overflødig væske fra utsiden av PDMS-kammeret.
    4. Fjern den aktuelle væsken fra innsiden av PDMS-kammeret med en pipette mens du legger til ca. 60 μL av ren PBS samtidig.
      Merk: beløpet legges til kammeret må endres i henhold til kammer størrelse. Vær forsiktig så du ikke fjerner alle medier fra celleoverflaten.
    5. Erstatt PBS med 60 μL av ren PBS og la den ruge i 1 min.
    6. Gjentagelse gårsdagen steg, utleie den ruge for 5 min i denne omgang.
    7. Fjern PBS og erstatte den med 60 μL av fargestoff løsning. La prøven stå i ruge i ca. 15 minutter, og dekk den fra lyset.
      Merk: dette trinnet må kanskje endres betydelig, avhengig av fluorescerende fargestoff som brukes. Vi bruker CellMask Deep Red til å merke cellemembranen for dette eksperimentet
    8. Vask prøven med PBS som i trinn 2.3.3-2.3.5.
    9. Fjern PBS og erstatte den med 40 μL av bilde bufferen samtidig.
      Merk: det er flere forskjellige bilde buffere for ulike fluorescerende fargestoffer.
    10. Plasser en dekkglass oppå, og hindre at luftbobler dannes under. Trykk forsiktig dekkglass mot bilde kammeret for å fjerne overflødige medier.
    11. Bruk en pipette for å fjerne overflødige medier utenfor dekkglass. Rengjør området utenfor dekkglass med en vann fuktig serviett for å unngå krystaller dannet av tørket nedsenking Media rester.

3. Imaging prosedyre

  1. Oppsett av komponent
    Merk: denne versjonen av oppsettet består av tre hovedkomponenter: mikroskopet, koblingspunktet og prøvefasen. Se tabellen over materialer.
    1. Bruk mikroskop med filter holder, hvit lyskilde, kamera og objektiv revolver.
    2. Bruk en 3-akse piezo koplings trinn med en fiber koblet laser og en koplings linse.
    3. Bruk en manuell prøve fase med én akse med spiss og vippe og en vakuum holder.
    4. Monter både koplingen og prøvefasen på en 2-akse motorisert scene for eksempel oversettelse.
  2. Waveguide kopling
    1. Plasser brikken på vakuum Chuck med koplings fasett mot koplings målet. Sørg for at brikken er omtrent en brennvidde unna koplings målet.
    2. Slå på vakuumpumpen.
    3. Slå på laseren til 1 mW. Grovt justere chip høyde slik at strålen treffer kanten av den. Slå av laseren.
    4. Slå på den hvite lyskilden. Velg objektiv med lav forstørrelse (f.eks. 10x). Fokuser mikroskopet på en waveguide.
    5. Oversett mikroskopet langs waveguide for å se om det er godt innrettet med den optiske banen. Flytt mikroskopet til koplings kanten.
    6. Slå på laseren ved 1 mW eller mindre. Oversett mikroskopet langs koplings kanten for å finne laser lyset. Fokuser strålen på chip kanten.
    7. Juster koplings trinnet langs den optiske banen i retningen som reduserer spot størrelsen for laserstrålen til den forsvinner. Strålen er nå enten over eller under chip overflaten.
    8. Juster høyden på koplings trinnet til stråle punktet vises på nytt og maksimert.
    9. Gjenta de to foregående trinnene til laseren danner et fokusert sted.
    10. Flytt fokuspunktet til waveguide av interesse.
    11. Oversett mikroskopet et lite stykke unna kanten, slik at det fokuserte stråle punktet ikke lenger er synlig. Slå av det hvite lyset.
    12. Juster kontrasten. Hvis waveguide ledes, skal det spredte lyset langs waveguide være klart synlig.
    13. Juster aksene på koblings trinnet for å maksimere den spredte lysstyrken. Slå av laseren.
    14. Skru på det hvite lyset. Juster om nødvendig kontrasten.
    15. Naviger til bildeområdet.
  3. Diffraksjon begrenset bildebehandling
    1. Fokuser med ønsket bilde målsetting. Slå av det hvite lyset.
    2. Sett inn fluorescens filteret og drei laser strømmen til 1 mW.
    3. Still kameraets eksponeringstid til ca. 100 MS. Juster kontrasten etter behov. Kontroller at koplingen fortsatt er optimert.
    4. Finn et område av interesse for bildebehandling. Skru på det piezo scene looper å middel ut måter.
      Merk: 20 μm skanneområde med en trinn størrelse på 50 NM er egnet for de fleste waveguide strukturer.
    5. Fang inn minst 300 bilder.
    6. Legg fanget bildet stabelen til Fiji ved hjelp av en virtuell stabel. Fra bildemenyen på Fiji velger du stabler og z-prosjekt.
    7. Beregn TIRF-bildet ved å velge projeksjons type gjennomsnittlig intensitet.
  4. d STORM-avbildning
    1. Slå på laseren til 1 mW og Still kameraets eksponeringstid til 30 MS.
    2. Juster kontrasten og fokuset.
    3. Øk laser strømmen til det er observert en blinking.
      Merk: Dette kan ta en stund, avhengig av evanescent felt intensitet.
    4. Zoom inn på et lite område av prøven.
    5. Juster kontrasten.
    6. Capture noen bilder for å se om blinker er godt separert.
    7. Juster kameraets eksponeringstid for optimal blinking.
      Merk: optimalisering blinker er en komplisert oppgave, men mye egnet litteratur er tilgjengelig12.
    8. Slå på piezo scenen looping.
    9. Spill inn en bildestakk på minst 30 000 bilder, avhengig av den blinkende tettheten.
  5. d STORM bilde rekonstruksjon
    1. Åpne Fiji og laste dstorm stack som virtuelle bilder.
    2. Juster om nødvendig kontrasten.
    3. Bruk rektangel verktøyet til å velge området som skal rekonstruere.
    4. Åpne Run analyse i tordenvær13 plugin i Fiji.
    5. Still inn de grunnleggende kamerainnstillingene i tordenvær som svarer til enheten. De resterende standardparametrene er vanligvis tilfredsstillende.
    6. Start gjenoppbyggingen.
      Merk: for hele synsfeltet kan det hende at dataene må deles i substacks på grunn av stor filstørrelse.
    7. Filtrer lokaliserings listen fra gjenoppbyggings programvaren for å fjerne løs lokaliseringer. Apple en ekstra drift-korreksjon om nødvendig.

Representative Results

TIRF mikroskopi er en populær teknikk som den fjerner ut-av-plan fluorescens, øker kontrasten og således gjøre bedre image kvalitet, og er færre fototoksisk sammenlignet med annet fluorescens basert mikroskopi teknikker. Sammenlignet med den tradisjonelle mål-baserte tilnærmingen, tilbyr chip-baserte mikroskopi TIRF eksitasjon uten den begrensede gjennomstrømningen som vanligvis er ledsaget med en TIRF linse. Du finner en oversikt over det presenterte oppsettet i figur 1A. Vi presenterer Diffraksjon-begrenset samt dstorm bilder av leveren sinusformet endothelial celler (LSEC) Hentet fra mus. Et stort synsfelt av LSECs med merket microtubulin er også presentert, som demonstrerer egenskapene til høy gjennomstrømming Imaging. En konvensjonell dstorm setup ved hjelp av en olje nedsenking TIRF linse (enten 60x eller 100 x forstørrelse) vanligvis bilder et område på 50 μm x 50 μm, som er 100 ganger mindre enn chip-basert bilde i figur 2, avbildet med en 25x, 0,8 na mål.

I denne metoden bruker vi multi-moded si3N4 bølgeledere for eksitasjon. De benyttet chips består av en stripe-etset guiding lag med 150 NM si3N4 avsatt over en 2 μm oksidert lag av en silisium chip. En skjematisk av chip finnes i figur 1B. Waveguide bredder kan variere mellom 200 og 1000 μm. fabrikasjon detaljer kan bli funnet andre steder8. Gjennom interferens mellom de overfører moduser eksitasjon lyset vil ikke ha en homogen intensitet fordeling, men snarere en romlig varierende mønster. Figur 2A presenterer et bilde med godt synlig modus mønstre. Dette forstyrrelser mønsteret vil endres med plasseringen av laserstrålen på kanten av waveguide. For å oppnå homogen eksitasjon i den endelige bilder, bruker vi en piezo scenen for å svinge langs kombinert fasett. I løpet av Imaging prosedyren, nok variasjon av forstyrrelser mønstrene finnes slik at de kan være gjennomsnitt, fjerne intensitet svingninger i bildet. Bildet stabelen vil bestå av flere bilder som i figur 2A, men med ulike mønstre, men når gjennomsnittet, vil stabelen gi et bilde med homogen eksitasjon som figur 2B. En alternativ tilnærming er å bruke Adiabatisk som er i ferd med å oppnå bred, enkelt moded bølgeledere8,14, noe som fjerner nødvendigheten av modus snitt. Imidlertid er flere millimeter med en lengde som er nødvendig for å opprettholde en enkelt modus tilstand for å oppnå en 100 μm waveguide bredde. Multi-moded bølgeledere omgå dette er en nødvendig og etterlater ingen begrensninger på strukturen bredde. Utover belysningen mønster, den svært effektive brytningsindeks av modusene gir mulighet for enestående muligheter mot strukturert belysning mikroskopi11 og svingninger mikroskopi metoder7.

Det første trinnet i bildebehandling er å samle en Diffraksjon begrenset bilde. Eksperimentet resulterer i en stabel på rundt 300 bilder og det endelige bildet er laget ved å ta gjennomsnittet av stabelen. I figur 2, presenterer vi Diffraksjon begrenset og dstorm Imaging av LSECs merket med CellMask Deep Red bruke en 60x, 1,2 na vann nedsenking mål. Figur 2A viser inhomogen belysning forårsaket av utilstrekkelig modus snitt. Vellykket modus i snitt vises i figur 2B. Figur 2C er et stormbilde av samme region, med den markerte regionen vist i figur 2d. Liver sinusformet endothelial celler har nano-sized porer i plasma membranen15, som kan sees her. En Fourier ring korrelasjon analyse gitt en oppløsning på 46 NM.

Figur 3 presenterer en dSTORM bilde av en 500 μm x 500 μm regionen, demonstrere høy gjennomstrømning evnene til teknikken. Et zoomet bilde av Figur 3A, som tilsvarer en typisk dstorm felt-of-View, er presentert sammen med Diffraksjon begrenset bilde i Figur 3B. En Fourier-ring korrelasjon å anslå oppløsningen ble utført, noe som gir en verdi på 76 NM.

Figure 1
Figur 1: bildesystem og waveguide. (A) fotografi av bilde systemet. Prøven er plassert på et vakuum Chuck på prøven scenen, med koplingen fasett av waveguide mot koplingen målet. En fiber kombinert laser og en kopling mål er plassert på toppen av en 3D piezo scenen. En linse turret med bilde linser fanger bildet ovenfra og releer det til et kamera. (B) skjematisk av waveguide med kopling og bilde linser. Koblings linsen par lys inn i waveguide. Prøvene (oransje perler) holdes inne i et forseglet PDMS kammer. Evanescent-feltet langs waveguide vil opphisse prøven og bilde målet vil fange de utsendte fluorescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Diffraksjon-begrenset og dstorm bilder. (A) bilde av Liver sinusformet endothelial celler med utilstrekkelig modus snitt, noe som resulterer i en godt synlig eksitasjon mønster. (B) det samme området som i (A), men med tilstrekkelig modus snitt, noe som resulterer i homogen eksitasjon. (C) Diffraksjon begrenset bilde av innfelt i (B); (D) Dstorm bilde av samme region. (E) innfelt av (D), tydelig viser fenestrations i plasma membranen av cellen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: dstorm bilde av rotte LSECs. (A) stort synsfelt dSTORM bilde av Alexa 647 beiset tubulin i rotte LSECs. Scale bar = 50 μm. (B) større merket område fra (A) sammenligne Diffraksjon (nederst til venstre) og dstorm bilde (øverst til høyre). (C) mindre markert område fra (A). Scale bar = 1 μm. Bildet har en oppløsning på 76 NM. Tilpasset med tillatelse fra helle et al. 20196. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Chip-basert Imaging ligner konvensjonelle dstorm Imaging. Bildekvaliteten kan dermed gauged ved hjelp av de samme tilnærmingene som for tradisjonelle dstorm Imaging. Den største forskjellen for brukeren er at den gjennomsiktige glass lysbilde utveksles med en ugjennomsiktig si-wafer. Selv om de vises svært forskjellige, er prøven håndtering praktisk talt analoge til et glass lysbilde. Flisen er ganske solid og kan enkelt håndteres ved hjelp av wafer pinsett. Den Imaging prosedyre og bilde rekonstruksjon er den samme som i en vanlig dstorm eksperiment. Å sette opp et funksjonelt chip-basert mikroskop krever ingen spesielle komponenter, bortsett fra de fotoniske sjetongene. Ytterligere detaljer om oppsettet finnes i tidligere arbeid6,7. Sjetongene som brukes i dette arbeidet har blitt fabrikkert ved hjelp av standard Foto litografi8.

Prøve preparatet omfatter tilberedning av prøvekammeret. Når du fester PDMS-rammen til brikken, er det avgjørende å unngå små folder eller riper der luft kan komme inn. Hvis PDMS folder når du fester den, bare ta den forsiktig med en TWEEZER og fest den. Når prøven er klar inne i PDMS kammeret, må dekkglass trykkes mot den, tetting regionen. Det er viktig å unngå eventuelle luftbobler som kan dannes når du fester dekkglass. Hvis en luftboble dannes, Fjern forsiktig dekkglass og Legg PBS til prøvekammeret for å sikre at prøven er dekket. Utarbeidelse og festing av dekselet slip kan deretter bare gjøres om.

Koplings lys inn i waveguide er forenklet ved hjelp av protokollen foreslått i dette papiret. Det er imidlertid noen vanlige utfordringer som kan begrense koplingen. For det første, hvis brikken ikke ble rengjort riktig og eventuelle leftover PBS fjernet helt, kan det være skitt eller krystallisert PBS på waveguide. Dette kan innføre store tap, noe som resulterer i svært lite strøm i Imaging regionen. Ved hjelp av en fuktig serviett å rengjøre regionen utenfor dekselet glass kan forbedre kraften betraktelig. For det andre, hvis koblings egenskapen til waveguide er skadet (f.eks. ved uriktig håndtering), kan koplings tapet øke drastisk. Optisk inspeksjon av kanten vil vanligvis avdekke eventuelle skader lett. Hele koplingen fasett av brikken kan være polert nøye, mye som en optisk fiber, og vil gi en jevn kopling fasett, som deretter øker kombinert strøm.

Etter at lyset er koplet, er bildebehandlingen den samme som i enhver konvensjonell dstorm setup. Hvis bildet har inhomogen eksitasjon, som demonstrert i figur 2A, så mest sannsynlig modus snitt ikke fungerte bra. De to vanligste årsakene til dette er: 1) for få bilder tatt for å skape en gjennomsnittlig stabel og 2) for kort av en bevegelse avstand/for stor av en trinn størrelse. Samle for få bilder kan utelate noen eksitasjon mønstre og gjennomsnittet vil dermed bli inhomogen. Dette kan lett løses ved å øke antall bilder i den gjennomsnittlige stakken. For kort av en bevegelse avstand kan også føre til et inhomogen bilde, som ikke nok modus mønstre er spent. Dette kan også enkelt løses ved å øke avstanden mellom bevegelse og/eller redusere trinn størrelsen. I dette arbeidet har vi brukt en piezo scene for å skanne input laserstrålen over 20 μm og tilegne seg minst 300 bilder. En annen tilnærming kan være å bruke høyhastighets galvo-speil for å skanne lyset over input waveguide fasett innenfor en enkelt oppkjøp tid, for eksempel 10-30 MS. dette alternativet er egnet for Live celle TIRF Imaging, hvor sub-cellulære organeller er i konstant bevegelse.

Chip-basert dstorm tilbyr et enestående stort område TIRF eksitasjon, som gjør den ideell for høy gjennomstrømming Imaging. Den kompakte karakteren gir mulighet for ettermontering til kommersielle systemer, der brikken kan plasseres opp ned for invertert oppsett eller gjennomsiktige underlag kan utvikles. Sjetongene er masse fabrikkert og kan endres for å passe mange behov. Foreløpig er den viktigste begrensningen at det er begrenset til 2D. Den evanescent feltet er bare tilgjengelig ca 200 NM unna waveguide overflaten, så bare fluorophores innenfor denne regionen vil bli begeistret. Til sammen tilbyr feltet integrert optikk mange muligheter for chip-baserte mikroskopi i nær fremtid, ved å takle nye Imaging spørsmål samt gi nye muligheter til eksisterende.

Disclosures

BS Ahluwalia har søkt om patent GB 1606268.9 for chip-baserte optiske nanoscopy. De andre forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne det europeiske forskningsråd (Grant no. 336716 til B.S.A.). Forfatterne vil også takke Irati Lagfragua for hennes uvurderlig hjelp med innspilling og redigering av video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-axis sample stage Standa 7T173-20
2-axis sample translation stage Mad City Labs Custom order
3-axis NanoMax stage Thorlabs MAX311D
BXFM microscope body Olympus OLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologies ThermoFisher C10046
Cleanroom grade swabs MRC Technology MFS-758
Fiber-coupled laser Cobolt Flamenco
Filter Holder Homemade
Hellmanex III, Hellma Gmbh Sigma-Aldrich Z805939 Cleaning detergent concentrate
Isopropanol Sigma-Aldrich 563935-1L
KL 1600 LED Olympus OLY-LSM-E0433314
Olympus Coupling lens Olympus LMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2 Hamamatsu
PBS tablets Sigma-Aldrich P4417-50TAB Mix according to descriptions
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit Dow 1673921
Tip-tilt stage Thorlabs APR001
Vacuum holder Thorlabs HWV001
Wafer Tweezers Type 2W Agar scientific AGT5051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5, (6), 527-529 (2008).
  2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, (5864), 810-813 (2008).
  3. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104, (4), 229-237 (2012).
  4. Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
  5. Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24, (12), 4600-4615 (2006).
  6. Helle, ØI., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27, (5), 6700-6710 (2019).
  7. Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11, (5), 322-328 (2017).
  8. Tinguely, J. C., Helle, ØI., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25, (22), 27678-27690 (2017).
  9. Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18, (20), 21053-21061 (2010).
  10. Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31, (14), 1127-1130 (2019).
  11. Helle, ØI., Dullo, F. T., Lahrberg, M., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV. https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019).
  12. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  13. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30, (16), 2389-2390 (2014).
  14. Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
  15. Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics