Native polyacrylamid gel elektroforese Immunoblot analyse af endogene IRF5 Dimerization

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En Native Western blot metode til at analysere endogene interferon regulerende faktor 5 denne i CAL-1 plasmacytoid dendritiske cellelinje er beskrevet. Denne protokol kan også anvendes på andre cellelinjer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Interferon reguleringsfaktor 5 (IRF5) er en vigtig transkriptionsfaktor til regulering af immunresponset. Det er aktiveret downstream af den Toll-lignende receptor myeloid differentiering primære respons gen 88 (TLR-MyD88) signalering pathway. IRF5 aktivering involverer fosforylering, dimerization, og efterfølgende translokation fra cytoplasmaet ind i kernen, som igen inducerer genekspression af forskellige pro-inflammatoriske cytokiner. En detekterings analyse for IRF5 aktivering er afgørende for at studere IRF5 funktioner og dens relevante veje. Denne artikel beskriver en robust analyse til at detektere endogene IRF5 aktivering i CAL-1 Human plasmacytoid dendritiske Cell (pDC) linje. Protokollen består af en modificeret nondenatururing elektroforese assay, der kan skelne IRF5 i sin monomer og dimer former, og dermed give en overkommelig og følsom tilgang til at analysere IRF5 aktivering.

Introduction

Interferon reguleringsfaktor 5 (IRF5) er en vigtig transskription regulator, der spiller en fremtrædende rolle i reguleringen af immunresponset, især i frigivelsen af pro-inflammatoriske cytokiner og type I Interferoner (ifns)1,2 ,3. Fejl regulering af IRF5 er en medvirkende faktor i talrige autoimmune sygdomme, som tydeligt af forskellige polymorfier i IRF5 locus, der er forbundet med systemisk lupus erythematosus, multipel sklerose, reumatoid arthritis, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Derfor er en robust detekterings analyse for endogene IRF5 aktiveringstilstand afgørende for forståelsen af regulerings veje og downstream-effekter af IRF5 i en fysiologisk relevant cellulær kontekst.

IRF5 udtrykkes konstitutivt i monocytter, dendritiske celler (DCs), B-celler og makrofager1,11. Som med andre IRF familie transkriptionsfaktorer, IRF5 opholder sig i cytoplasmaet i sin latente tilstand. Ved aktivering, IRF5 er fosforyleret og danner homodimers, som derefter translokeres i kernen og binde til specifikke regulerende elementer af gener kodning type jeg IFNs og pro-inflammatoriske cytokiner, i sidste ende inducerende ekspression af disse gener1 ,2,11,12,13. IRF5 regulerer den medfødte immunrespons nedstrøms for forskellige bompenge-lignende receptorer (TLRs), såsom TLR7, TLR 8, og TLR 9, som er lokaliseret i endosomes og bruge MyD88 til signalering1,11,14. Disse tlr'er genkender primært fremmede nukleinsyre arter såsom enkeltstrenget RNA (ssrna) og umethyleret CPG-DNA, der er symptomatisk for en infektion15,16,17,18. IRF5 har vist sig at regulere immunresponset mod bakterielle, virale og svampeinfektioner19,20,21. Overvejer IRF5's indflydelsesrige og forskelligartede rolle i immunsystemet, øge eller dæmpe IRF5 aktivitet kan tjene som en roman Avenue for udvikling af terapeutiske agenter22. Derfor er det afgørende at udvikle en protokol til at overvåge aktiveringsstatus af endogene IRF5 for at muliggøre grundig undersøgelse af de veje og mekanismer, der regulerer IRF5 aktivitet i forskellige celletyper.

Efter vores bedste overbevisning er ingen biokemisk eller gel elektroforetisk analyse for endogen IRF5 aktivering blevet offentliggjort forud for udviklingen af denne protokol. Fosforylering har vist sig at være et vigtigt første trin i IRF5 aktivering, og der blev udviklet et phosphospecific IRF5-antistof, som førte til opdagelsen og bekræftelsen af en Serin-rest, som er vigtig for IRF5 aktivitet13. Men, mens antistoffet klart registrerer fosforyleret IRF5 når immunoprecipitated eller overudtrykt23, det undlader at opdage IRF5 fosforylering i en hel celle lysat i vores hænder (data ikke vist). Dimerization er det næste trin i IRF5 aktivering, og mange vigtige undersøgelser til dato undersøger dette skridt er baseret på overekspression af epitope-mærkede IRF5, ofte i irrelevante celletyper, der normalt ikke udtrykker IRF511,12 ,24,25. Tidligere undersøgelser har vist, at dimerized IRF5 ikke altid omplacere sig i kernen og dermed ikke nødvendigvis fuldt aktiveret25,26. En analyse for endogene IRF5 nukleare lokalisering blev udviklet for at vurdere IRF5 aktivering af Imaging flow flowcytometri27. Denne analyse er blevet anvendt i undersøgelser, der var afgørende for at forstå IRF5 aktivitet, især i primære eller sjældne celletyper28,29 og i høj grad avanceret viden på området. Men, denne analyse bygger på et specialiseret instrument, der ikke er alment tilgængelige for forskere. Endvidere er det ofte nødvendigt at undersøge de indledende aktiverings trin, samtidig med at man dissekting IRF5 regulerings veje og identificerer upstream-regulatorer og pathway-komponenter. Denne undersøgelse giver en robust og pålidelig biokemisk analyse for de tidlige aktiveringshændelser af IRF5, der kan udføres i laboratorier udstyret med molekylærbiologiske værktøjer. Den protokol, der er beskrevet her, vil være meget nyttig til at undersøge veje og mekanismer for IRF5 handlinger, især når de kombineres med ortogonale analyser såsom billedbehandlings strømmen cytometrisk analyse af IRF5 nuklear lokalisering23, 27,28,30.

Native polyacrylamid gel elektroforese (native Page) er en meget anvendt metode til at analysere protein komplekser31,32. I modsætning til natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side), Native side adskiller proteiner på grundlag af deres form, størrelse, og ladning. Det bevarer også indfødte protein struktur uden denaturering31,33,34,35. Protokollen præsenteres udnytter disse funktioner i native side og registrerer både mono og dikemeje former for IRF5. Denne metode er særlig vigtig for at opdage tidlige aktiveringshændelser, fordi der ikke er noget egnet kommercielt tilgængeligt antistof, der kan detektere endogene fosforylerede IRF5. Tidligere, flere offentliggjorte undersøgelser brugt Native PAGE til at vurdere IRF5 dimerization. Størstedelen af disse undersøgelser afhang imidlertid af overekspression af eksogene epitope-mærkede IRF5 for at analysere aktiveringsstatus2,13,24,36,37 . Dette arbejde præsenterer en trin-for-trin-protokol til at analysere endogene IRF5 denne via en modificeret Native side teknik i en human plasmacytoid dendritiske Cell (pDC) linje, hvor IRF5 aktivitet har vist sig at være afgørende for sin funktion1, 38,39,40. Denne samme teknik er blevet anvendt til andre cellelinjer23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Den protokol, der er beskrevet her, bruger CAL-1 pDC-cellelinje behandlet med resiquimod (R848), en agonist for TLR7/8. Denne protokol er blevet anvendt på andre humane og murine celletyper, herunder rå 264,7 (murine makrofag linje), THP-1 (humant monocytisk cellelinje), bjab (Human b cellelinje), Ramos (Human b Cell Line), og mutz-3 (Human dendritiske cellelinje)23.

1. stimulering af CAL-1-celler

  1. Opretholde CAL-1-cellekulturer i en T75 kolbe ved 37 °C og 5% CO2 under sterile forhold med 20 − 25 ml rpmi 1640-medium indeholdende 5% føtal bovint serum (FBS), 25 mm Hepes og 1x mercaptoethanol (dvs. komplet rpmi 1640 medium).
  2. Cellerne overføres til et 50 mL konisk rør.
    Bemærk: CAL-1-celler er ikke-klædige. For overtrædende celletyper kan standard trypsinisering udføres for at høste celler.
  3. Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten fjernes, og celle pellet opslæmmes i 8 mL af det komplette RPMI 1640-medium for at opnå en homogen enkelt cellesuspension.
  4. Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer. Frø cellerne i en densitet på 1 x 106 celler pr brønd i en 6 brønd plade med 4 ml forvarmet komplet rpmi 1640 medium i hver brønd. Inkuber i 20 − 24 timer ved 37 °C og 5% CO2 for at give mulighed for at nå 90% − 95% (svarende til ca. 1,5 x 106 celler).
  5. Cellerne stimuleres ved tilsætning af 4 μL 1 mg/mL R848 pr. brønd af 6-brønd pladen (slutkoncentration på 1 μg/mL). Også oprette en ustimuleret kontrol godt med celler uden R848 behandling.
  6. Sørg for, at R848 er jævnt fordelt ved forsigtigt at Rocking pladen side til side. Derefter Inkubér cellerne for 2 − 16 timer i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.

2. ekstraktion af cellulære proteiner

  1. Celle suspensionerne overføres fra 6-brønd pladen til 5 mL centrifugeglas.
  2. Centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved rt. Fjern supernatanten, og resuspender celle pellet i 1 ml fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at opnå en homogen enkelt cellesuspension.
  3. Cellesuspensionen overføres til et 1,5 mL centrifugeglas.
  4. Drej kortvarigt ned ved 12.000 x g for 0,5 − 1 min ved 4 °c, og fjern forsigtigt supernatanten.
  5. Der fremstilles en lyse buffer med 6,25 mL 1 M Tris-HCl pH 7,4 (endelig koncentration på 25 mM), 7,5 mL af 5 M NaCl (slutkoncentration på 150 mM), 0,5 mL af 0,5 M EDTA (slutkoncentration på 1 mM), 2,5 mL NP-40 (slutkoncentration på 1%) og 7,5 mL glycerol (endelig koncentration på 5%) i 250 mL deioniseret vand (ddH2O). Tilsæt 100x proteasehæmmere inhibitor engangs cocktail til en endelig koncentration af 1x til lysis buffer lige før brug. Opbevar den forberedte lysis-buffer på isen.
    Bemærk: Lysis-bufferen uden proteasehæmmere kan opbevares ved 4 °C.
  6. Resuspender celle pellet i 30 μL iskold lyse buffer og bland ved pipettering op og ned.
  7. Inkuber på is i 15 − 20 minutter.
  8. Præcis lysningen ved at centrifuge ved 12.000 x g i 15 − 20 minutter ved 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt, forkølet 1,5 mL centrifugeglas. Opbevar ekstrakter på is på alle tidspunkter.
    Bemærk: Celle lysater kan opbevares ved-20 °c eller-80 °c. Prøverne må ikke koges.
  9. Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford reagens.

3. analyse af IRF5 Dimerization af Native PAGE

  1. Forbered de øvre (-) og nedre (+) kammer elektroforese buffere. Den øvre kammer buffer består af 0,3% natriumdeoxycholat (NaDOC) i 1x Native side kører buffer, og den nederste kammer består af kun 1x Native side kører buffer.
    Bemærk: Forbered en frisk øvre kammer buffer til hver ny løbetur.
  2. Skyl en 3% − 12% naturlig side gel grundigt med vand uden at forvrænge brøndene. Sæt gelen i mini gel tanken og fjern kammen. Gelen i et 4 °C koldt rum eller på is ved 150 V i 30 min.
    Bemærk: Prerunning fjerner overdreven ammoniak og persulfationer, der kan forstyrre driften af gelen.
  3. Under prerun, forberede prøverne til lastning ved at blande de cellulære proteiner holdes på is med 4X Native prøve buffer.
  4. Efter prerun indlæses 10 − 15 μg protein med et endeligt volumen på 10 − 15 μL pr. prøve.
    Bemærk: Overbelastning af protein kan forårsage smearing.
  5. Kør gel på 85 V i 30 min, derefter 150 V for 2 h.
    Bemærk: I betragtning af forskelle i udstyr og cellelinjer, der anvendes af forskellige laboratorier, mindre ændringer i koncentrationen af protein prøver, spænding og køretiden kan være hensigtsmæssigt at optimere denne protokol. Sænkning pre-løb og løb spænding samtidig øge køretiden kan bidrage til at forbedre dimer opløsning og resultat konsistens.
  6. Læg gelen i SDS-løbe bufferen (25 mM Tris pH 8,3, 250 mM glycin, 0,1% SDS) i 30 minutter ved RT.
    Bemærk: Ingen agitation er nødvendig. Lejlighedsvis, intensiteten af båndet kan ikke være proportional med mængden af protein lastet på grund af ineffektiv overførsel i nærværelse af deoxycholate (DOC), som hovedsagelig påvirker den monomeriske form af IRF5. Iblødsætning gel i SDS kører buffer før overførslen løser dette problem. Gelen er skrøbelig. Håndtag med ekstrem omhu fra bunden (dvs. højere procentdel) enden af gelen.

4. immunoblot-analyse af IRF5

  1. Aktiver polyvinylidendifluorid (PDVF) membranen ved at suge den i methanol i ca. 5 minutter.
  2. Lav et snit på det ene hjørne af membranen for at angive dets retning. Saml Transfer sandwich i henhold til den sekventielle rækkefølge, der er beskrevet i producentens protokol med ekstra omhu for at sikre, at ingen luftbobler er fanget i.
  3. Placer overførings kassetten i tanken og Overfør ved 20 V i 1 time på is.
    Bemærk: Udfør alle inkubationer og skyller i efterfølgende trin med en gynge shaker.
  4. Fjern membranen fra kassetten med plastik pincet, når overførslen er fuldført. Bloker membranen i blokerende buffer (TBS) i 45 min ved RT.
    Bemærk: TBS buffer med 5% BSA kan også bruges som en blokerende buffer.
  5. Membranen med det primære antistof, der er anført i tabel 1. Membranen vaskes med 1x TBST-vaskebuffer (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20) i 3 min. mens Rocking. Gentag vask 2x.
Dillution Dillution buffer Inkubation Kommentarer
Primært antistof (anti-IRF5) 1/1000 TBS blokerende buffer Overnatning ved 4 °C eller 2 timer ved RT Fortyndede antistoffer kan genbruges flere gange, hvis de opbevares ved 4 °C ved tilstedeværelse af 0,02% natriumazid.
Sekundært antistof (anti-kanin) 1/10000 TBS blokerende buffer 45 min på RT Fortyndede antistoffer kan genbruges flere gange, hvis de opbevares ved 4 °C ved tilstedeværelse af 0,02% natriumazid.
Bemærk: Fortynding skal optimeres, da det varierer mellem producenter.

Tabel 1: specifikationer for de antistoffer, der anvendes i blot-proceduren.

  1. Membranen med det sekundære antistof, der er anført i tabel 1. Skyl membranerne i 3 minutter i 1x TBST vaskebuffer. Gentag vask 2x.
  2. Scan den blot ved hjælp af et passende gel dokumentationssystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immun (Ib) med anti-IRF5-antistoffer blev udført på Cal-1-celler ustimuleret eller stimuleret med 1 μg/ml R848 i 2 timer (figur 1). Celle lysater blev forberedt, og den indfødte side blev udført. I ustimulerede CAL-1-celler blev IRF5 detekteret som et enkelt bånd på den oprindelige side, svarende til dets monomeriske form. Ved behandling af CAL-1-celler med R848 i 2 timer faldt niveauet af IRF5 monomer med en samtidig stigning i ophobningen af et langsomt migrerende bånd, der svarede til den dikemiske form for IRF5.

Figure 1
Figur 1: endogene IRF5 dimerized i CAL-1 celler, når stimuleret med TLR7/8 agonist. CAL-1-celler blev ubehandlet eller behandlet med R848 i den angivne tid. Protein prøverne blev løst efter Native PAGE og efterfulgt af IB ved hjælp af anti-IRF5-antistoffet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Immun med anti-IRF5 antistof blev udført på IRF5-overekspudende 293t celler utransfected og transficeret med forskellige konstruktioner. Celle lysater blev forberedt og Native side blev udført (figur 2). Ingen IRF5 blev påvist i utransfected 293T celler, der demonstrerer specificiteten af anti-IRF5 antistof. Et enkelt bånd svarende til mono IRF5 blev kun påvist i de 293t-celler, der overudtrykker IRF5. Når konstruerer kodning IRF5-aktiverende proteiner, herunder NRIG (konstitutivt aktiv RIG-I), MAVS, og IKKβ blev cotransfected, et langsomt migrerende bånd, der svarer til den dikemiske form af IRF5 dukkede op. Men NMDA5 (konstitutivt aktiv MDA5), et beslægtet protein til RIG-I, inducerede ikke IRF5 dimerisering, når de blev cotransfected.

Figure 2
Figur 2: cotransfection af IRF5-aktiverende faktorer induceret IRF5 denne i 293t celler. De 293t celler blev ikke transficeret (Lane 1) eller transficeret med IRF5 (Lane 2) sammen med forskellige IRF5 regulatorer (Lanes 3 − 6). Protein prøverne blev løst efter Native PAGE og efterfulgt af IB ved hjælp af anti-IRF5-antistoffet. NRIG = N-terminal for RIG-I; NMDA5 = N-terminal på MDA5. (Oprindeligt offentliggjort i Journal of Immunology. KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M Knoll, YM Loo og M gale Jr. 2018. Differentiale og overlappende immun programmer reguleret af IRF3 og IRF5 i Plasmacytoid dendritiske celler. J. Immunol. 201 (10) 3036-3050. Copyright © 2018 den amerikanske sammenslutning af immunologer, Inc.23). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen er beskrevet her er en modificeret Native side, der adskiller både monomeriske og dikemeje former for endogene IRF5. Der har været få undersøgelser rapporterer påvisning af endogene IRF5 aktivering ved hjælp af specialiserede Imaging flow flowcytometri teknik23,27,28,30. Denne protokol anvender en fælles teknik og almindelige reagenser og værktøjer til at vurdere den endogene IRF5 aktiveringstilstand under de tidlige hændelser af aktivering. Protokollen indebærer enkle modifikationer til en standard Native side protokol for at muliggøre sondring mellem mono og dikemeje former for IRF5. Det kan let tilpasses til undersøgelser ved hjælp af andre cellelinjer23. Denne modificerede Native PAGE Protocol kan løse endogene IRF5 i sine to former klart uden ikke-specifikke protein interferenser (figur 2). Endogene IRF5 fra ustimulerede celler blev påvist som et klart enkelt bånd i dette gel-system, hvorimod behandling med R848 i 2 timer resulterede i et bånd, der svarer til IRF5 dimere (figur 1).

En Native side denne assay for IRF3, en lignende transkriptionsfaktor til IRF5 i samme familie, er blevet udviklet og udbredt i de seneste to årtier32. På trods af omfattende test og fejlfinding, vi var ude af stand til at anvende den samme protokol, der beskæftiger Laemmli Tris-Glycine system til at løse IRF5 monomer og dimer. Den protokol, der er beskrevet i denne artikel bruger bis-Tris gradient gels, som har en meget forskellig kemi til Tris-glycin enkelt procent geler anvendes i IRF3-protokollen. Den forskellige pH og kemiske sammensætning af gelelektroforetiske systemer kan være afgørende for at skelne de forskellige former for IRF3 og IRF5. Faktisk, IRF3 og IRF5, mens lignende, har forskellige egenskaber (f. eks isoelektriske punkter og modifikation sites) sandsynligvis resulterer i forskellige adfærd samtidig være adskilt på forskellige gel-systemer.

En 1x Native side løbe buffer indeholdende DOC blev brugt til gel Run. Bufferen skal tilberedes frisk eller opbevares i et rent og proteinfrit miljø for at undgå forekomsten af hvide bundfald, der overskygge opløsningen i det øvre kammer som følge af DOC-udfældning af ikke-specifikke proteiner. Det anbefales stærkt, at de ekstraherede endogene IRF5 prøver blive udsat for den indfødte side så hurtigt som muligt, helst inden for en uge med minimal fryse-tø cyklusser. Ellers kan der være signifikant protein nedbrydning. Nedbrydningen observeres med opbevaring ved både-80 °C og-20 °C. Desuden bør pH-værdien af SDS-løbe bufferen og TBST-vaskebufferen justeres ved RT.

Den ideelle endelige volumen af prøven lastet i hver brønd var 10 − 15 μL, men mindre justeringer kan være påkrævet afhængigt af forskellige celletyper. Efter den første kørsel på 85 V i 30 min, anbefales det at fortsætte med at køre gel på 150 V i ca 2 til 3 h for at opnå tydelig adskillelse og opløsning af IRF5 monomer og dimer. Efter kørslen er færdig, er det af yderste vigtighed at håndtere gelen omhyggeligt fra sin nederste ende på grund af dens differentiale niveauer af tæthed, der spænder fra 3% i toppen og stigende mod 12% i bunden. I dette tilfælde er det at foretrække at fjerne gelen fra pladen ved at fordybe den i den brugte løbe buffer, som fungerer som en stødpude for at minimere friktion og gør det muligt for gelen at flyde væk fra pladen for at undgå brud.

Et par mindre ulemper ved denne protokol omfatter det begrænsede udvalg af geler til rådighed for at opnå de ønskede resultater. Hjemmelavede gels og et par andre mærker af kommercielt tilgængelige gels er blevet testet uden succes. I vores hænder bidrog brugen af et kommercielt løbe buffer-og gel-system til denne protokols robusthed og reproducerbarhed, selv om der ikke er udført omfattende test af hjemmelavede buffere. Opmærksomhed på detaljer er afgørende, og erfaring er nøglen til succes med at opnå klare resultater. Endelig, at opløsningen af IRF5 krævede en lang tid (dvs., 2 − 3 h) for at få en ideel adskillelse af monomer og dimer. Yderligere forbedringer og modifikationer i fremtiden kan forbedre effektiviteten og minimere ulemperne ved denne protokol.

Afslutningsvis, denne protokol er en robust analyse til påvisning af endogene IRF5 monomer og dimer. Det er velegnet til applikationer i forskellige menneskelige og murine celletyper udtrykker endogene IRF5. Det vil være et værdifuldt værktøj til at studere de IRF5 regulatoriske veje og signalering komponenter i forskellige celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Arbejdet blev støttet af finansiering fra Croucher Foundation og City University Startup fonde. Vi takker alle medlemmer af Chow-laboratoriet for at få hjælp til eksperimentet og den kritiske læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434, (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10, (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8, (1), 1789 (2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67, (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42, (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184, (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63, (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280, (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28, (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22, (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13, (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8, (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34, (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18, (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38, (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10, (1), 1349 (2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286, (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201, (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176, (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7, (3), 33098 (2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280, (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64, (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24, (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292, (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6, (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865, (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66, (3), 1002 (1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43, (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22, (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283, (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178, (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43, (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7, (5), 1001345 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics