उतार चढ़ाव परख के साथ माइक्रोबियल उत्परिवर्तन दरों को मापने

Genetics
 

Summary

यहां, एक प्रोटोकॉल एक उतार चढ़ाव परख प्रदर्शन और फेनोटाइपिक मार्कर का उपयोग कर माइक्रोबियल उत्परिवर्तन दर का अनुमान लगाने के लिए प्रस्तुत किया जाता है । यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को विविध रोगाणुओं और वातावरण में उत्परिवर्तन परख करने में सक्षम बनाएगा, यह निर्धारित करेगा कि जीनोटाइप और पारिस्थितिक संदर्भ सहज उत्परिवर्तन दरों को कैसे प्रभावित करते हैं ।

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Krašovec, R., Richards, H., Gomez, G., Gifford, D. R., Mazoyer, A., Knight, C. G. Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay. J. Vis. Exp. (153), e60406, doi:10.3791/60406 (2019).

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Abstract

उतार चढ़ाव परख व्यापक रूप से तरल वातावरण में बढ़ रोगाणुओं में उत्परिवर्तन दरों का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । कई संस्कृतियों प्रत्येक कुछ हजार कोशिकाओं के साथ टीका लगाया जाता है, प्रत्येक एक चयनात्मक मार्कर के प्रति संवेदनशील है जिसे आम तौर पर परपर किया जा सकता है। ये समानांतर संस्कृतियां फेनोटाइपिक मार्कर की अनुपस्थिति में कई पीढ़ियों तक बढ़ती हैं। संस्कृतियों के सबसेट का उपयोग उत्परिवर्तनों के जोखिम में कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है (यानी, विकास अवधि के अंत में जनसंख्या का आकार, या एनटी)। शेष संस्कृतियों को चयनात्मक आगर पर चढ़ाया जाता है। समानांतर संस्कृतियों के बीच मनाया प्रतिरोधी म्यूटेंट का वितरण तब गणितीय मॉडल का उपयोग करके म्यूटेशनल घटनाओं की अपेक्षित संख्या का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, एम। एनटी द्वारा एम को विभाजित करना प्रति पीढ़ी प्रति लोकस उत्परिवर्तन दर का अनुमान देता है। परख में तीन महत्वपूर्ण पहलू हैं: चुने हुए फेनोटाइपिक मार्कर, समानांतर संस्कृतियों की चुनी हुई मात्रा, और यह सुनिश्चित करना कि चुनिंदा आगर पर सतह ऊष्मायन से पहले पूरी तरह से सूखी है। परख अपेक्षाकृत सस्ती है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की जरूरत है । यह वैकल्पिक दृष्टिकोणों की तुलना में भी कम श्रमसाध्य है, जैसे उत्परिवर्तन संचय और एकल-सेल परख। परख जीवों पर काम करता है कि कई पीढ़ियों के माध्यम से तेजी से जाना है और यह मार्कर और सेल मौत के फिटनेस प्रभाव के बारे में मांयताओं पर निर्भर करता है । हालांकि, हाल ही में विकसित उपकरण और सैद्धांतिक अध्ययन का मतलब है कि इन मुद्दों को अब विश्लेषणात्मक रूप से संबोधित किया जा सकता है । परख अलग-अलग जीनोटाइप के साथ कोशिकाओं में विभिन्न फेनोटाइपिक मार्कर के उत्परिवर्तन दर अनुमान की अनुमति देता है जो अलगाव में या समुदाय में बढ़ रहा है। समानांतर में कई परखों का आयोजन करके, परखों का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि एक जीव का पर्यावरणीय संदर्भ सहज उत्परिवर्तन दर को कैसे प्रभावित करता है, जो रोगाणुरोधी प्रतिरोध, कैंसरजन्य, उम्र बढ़ने और विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

Introduction

1 9 01 में डच वनस्पतिविज्ञानी ह्यूगो डी वेरियों ने उत्परिवर्तनशब्द गढ़ा1. छब्बीस साल बाद, जब हरमन जोसेफ मुलर ने एक्स-रे2की उत्परिवर्ती कार्रवाई की खोज की, तो उत्परिवर्तन ों को पहले से ही विकास की ड्राइविंग ताकतों में से एक माना जाता था। हालांकि म्यूटेशन की प्रकृति स्पष्ट नहीं थी। इस मूलभूत प्रश्न का उत्तर देने के लिए कि क्या उत्परिवर्तन अनायास उभरते हैं (यानी, एक सहज उत्परिवर्तन) या चयन (यानी, एक प्रेरित उत्परिवर्तन) के जवाब में, उत्परिवर्तनीय घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए एक विधि की आवश्यकता थी। इस तरह की विधि से प्रति सेल डिवीजन म्यूटेशन की अपेक्षित संख्या या जिसे पहले से ही म्यूटेशन रेट3,4के रूप में जाना जाता था , को मापना होगा ।

Figure 1
चित्रा 1: कैसे एक ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली में एक माइक्रोबियल तनाव के साथ उतार चढ़ाव परख प्रदर्शन करने के योजनाबद्ध उदाहरण । (क)50 मीटर ट्यूबों में टीका और एक्लाइमेट कोशिकाओं जिसमें पांच अलग-अलग वातावरण ('लाल', 'नीला', 'हरा', 'बैंगनी', और 'नारंगी' परस शामिल हैं)। (ख)एक ९६ गहरी अच्छी थाली में संवेदनशील कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के साथ समानांतर संस्कृतियों तैयार करते हैं । 'लाल' परख में 20 समानांतर संस्कृतियां हैं, जबकि 'नीला', 'हरा', 'बैंगनी', और 'नारंगी' परख सभी के पास 19 समानांतर संस्कृतियां हैं। ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली पर समानांतर संस्कृतियों की स्थिति यादृच्छिक हैं । रैंडमाइजेशन अनुपूरक लेआउटजेनरेटर.आर स्क्रिप्ट या किसी अन्य उपकरण के साथ किया जा सकता है। शीर्ष दाईं ओर लेआउट यादृच्छिक परिणाम है। (ग)96 डीप वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं को विभाजित करने और अनायास रूपांतरित करने की अनुमति दें। गहरे कुओं A1, B1, C1, E1, F1, और G1 से छह संस्कृतियों से पता चलता है कि कैसे म्यूटेंट की संख्या में उतार चढ़ाव: 4, 0, 2, 2, 1, और तीसरे सेल डिवीजन के बाद 4 लाल कोशिकाओं, क्रमशः । म्यूटेंट की संख्या न केवल सहज उत्परिवर्तनों की विभिन्न संख्या (0, 1, या 2 के रूप में पहले लाल कोशिका द्वारा दिखाया गया है) के कारण अलग है, बल्कि इसलिए भी कि यह महत्वपूर्ण है जब संस्कृति चक्र के दौरान एक प्रतिरोध उत्परिवर्तन अनायास उभर ताहै (सेल डिवीजन 1, 2, या 3)। (D)96 डीप वेल प्लेट के ऊष्मायन के बाद म्यूटेंट की संख्या 81 समानांतर संस्कृतियों को चढ़ाना द्वारा निर्धारित की जाती है। लेआउट पर ये बोल्ड किनारों के बिना सर्कल हैं। पूरी समानांतर संस्कृति एक चयनात्मक आगर युक्त एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं पर चढ़ाया जाता है । (ई)शेष 15 संस्कृतियों को कोशिकाओं की औसत संख्या(एनटी)निर्धारित करने के लिए गैर-चयनात्मक आगर पर पतला और चढ़ाया जाता है । लेआउट पर इन्हें एनटीवेल्स के रूप में चिह्नित किया जाता है और किनारों को बोल्ड किया जाता है। प्रत्येक परख एनटी के लिए तीन समानांतर संस्कृतियों पर औसत है । नीचे दाईं ओर एक पेट्री डिश है जिसमें एक गैर-चयनात्मक आगर प्लेट है जिसमें एक गहरी अच्छी तरह से डी 1 (एक ' ग्रीन ' परख का हिस्सा) में उगाई जाने वाली पतला संस्कृति के 25 CFUs के साथ एक गैर-चयनात्मक आगर प्लेट है। (एफ)चयनात्मक 6 अच्छी प्लेटों के ऊष्मायन के बाद मनाए गए म्यूटेंट की संख्या गिनी गई और म्यूटेशनल घटनाओं की अपेक्षित संख्या, एम,अधिकतम संभावना अनुमानक का उपयोग करके अनुमान लगाया गया था। (जी)उत्परिवर्तन, एमऔर परख, एनटीप्रति कोशिकाओं की संख्या दोनों को जानते हुए भी उत्परिवर्तन दर का अनुमान एम/एनटीके रूप में लगाया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1 9 43 में साल्वाडोर लुरिया और मैक्स डेलब्रुक ने उतार-चढ़ाव परख5 (देखें चित्रा 1)के साथ इस समस्या का एक सरल समाधान प्रदान किया। परख कई आबादी (समानांतर संस्कृतियों नाम) के साथ शुरू होती है जो माइक्रोबियल कोशिकाओं की एक छोटी संख्या(चित्रा 1ए, बी)के साथ शुरू की जाती है। सौम्य, गैर-चयनात्मक वातावरण(चित्रा 1सी)में वृद्धि के बाद, समानांतर संस्कृतियों को चुनिंदा मार्कर (फेज, एंटीबायोटिक्स, आदि) वाली प्लेटों पर स्थानांतरित किया जाता है, जहां प्रतिरोध उत्परिवर्तन वाली केवल कोशिकाएं जीवित रहती हैं और एक कॉलोनी(चित्रा 1डी)का उत्पादन कर सकती हैं। मुख्य अपेक्षा यह थी कि यदि प्रतिरोध उत्परिवर्तन प्रेरित होते हैं, तो उत्परिवर्तन करने वाली कोशिकाओं की संख्या को विचरण के बराबर औसत के साथ विभिन्न आबादी के बीच वितरित किया जाना चाहिए। लुरिया और डेलब्रुक ने उतार-चढ़ाव परख के साथ क्या पाया है कि म्यूटेंट की संख्या में काफी उतार-चढ़ाव आया और विभिन्न आबादी के बीच म्यूटेंट की संख्या में भिन्नता मतलब से काफी अधिक थी। लुरिया और डेलब्रुक ने इस तरह दिखा दिया कि उत्परिवर्तन सहज हैं। उन्होंने दिखाया कि जब भी डीएनए की प्रतिकृति होती है तो उत्परिवर्तन अनायास ही उभर ते हैं और जनसंख्या के विकास के दौरान उत्परिवर्तन कब होता है, म्यूटेंट की संख्या इस बात पर निर्भर करती है । चित्रा 1सीदेखें, जहां छह आबादी, प्रत्येक माइक्रोबियल सेल (नीले रंग में) के साथ शुरू की गई, कोई भी, 1 या 2 एकल म्यूटेशन का अनुभव नहीं करती है। आबादी A1, E1, और F1 एक एकल उत्परिवर्तन (पहली लाल सेल) का अनुभव है, लेकिन क्योंकि एक एकल उत्परिवर्तन अनायास एक संस्कृति चक्र के दौरान विभिंन समय बिंदुओं पर उभर, आबादी मनाया म्यूटेंट (चार, दो, और एक, क्रमशः) की एक बहुत अलग संख्या के साथ समाप्त हो गया । दूसरी ओर, आबादी C1 और G1 E1 और A1 के रूप में मनाया म्यूटेंट की एक ही संख्या के साथ समाप्त हो गया, दो म्यूटेशन घटनाओं के बजाय एक का अनुभव करने के बावजूद । आबादी के बीच मनाया म्यूटेंट के उतार-चढ़ाव ने न केवल परख का नाम दिया, बल्कि यह भी दिखाया कि उत्परिवर्ती आवृत्ति (यानी, उत्परिवर्ती कोशिकाओं का अनुपात) उत्परिवर्तन दर का अपर्याप्त संकेतक है।

उतार-चढ़ाव परख का समग्र लक्ष्य एक विशेष तरल वातावरण में बढ़ रहे बैक्टीरिया या अन्य एकल-कोशिकीय जीव के एक विशेष जीनोटाइप की सहज उत्परिवर्तन दर का अनुमान लगाना है। उतार चढ़ाव परख माइक्रोबियल उत्परिवर्तन दरों की पर्यावरण निर्भरता का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त उपकरण बना हुआ है और तेजी से और सस्ती उत्परिवर्तन दर अनुमान की अनुमति देता है । उत्परिवर्तन दर अनुमान के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण, जैसे अधिकतम गहराई अनुक्रमण6,जनसंख्या अनुक्रमण7,उत्परिवर्तन संचय प्रयोग8,या माता-पिता9 के लिए एक संतान के जीनोम दृश्यों की तुलना करना बहुत अधिक श्रमसाध्य है, और इस प्रकार संभावित रूप से पर्यावरणीय निर्भरता का पता लगाने के लिए खराब अनुकूल है। हालांकि, उत्परिवर्तन की पीढ़ी और मरम्मत के गतिशील पहलू काफी हद तक उतार-चढ़ाव परख या ऊपर सूचीबद्ध उत्परिवर्तन दर को परखने के तरीकों में से किसी के लिए दुर्गम हैं। अध्ययन करने के लिए कैसे समय, अंतरिक्ष, या एक जनसंख्या के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच में परिवर्तन की संख्या, एकल सेल11,12 दृष्टिकोण आवश्यक हैं, जो उतार चढ़ाव परख से अधिक श्रमसाध्य होने के अलावा, अत्यधिक विशेष कौशल और उपकरणों की आवश्यकता है ।

व्यवहार में, एक उतार चढ़ाव परख एक उत्परिवर्तन है कि एक है कि मार्कर के लिए चयन की कमी वातावरण में होता है के कारण एक फेनोटाइपिक मार्कर प्राप्त कोशिकाओं की गिनती है । प्रकाशित परख ों के सैकड़ों के मेटा विश्लेषणसे पता चलता है कि १९४३ में परख की स्थापना के बाद से कम से ३९ विभिन्न फेनोटाइपिक मार्कर का इस्तेमाल किया गया है । उतार चढ़ाव परख का उपयोग प्रयोगशाला, नैदानिक, नॉनम्यूटेंटर और स्वतंत्र वातावरण में बढ़ रहे म्यूटेटर उपभेदों के बीच उत्परिवर्तन दरों के औसत और पर्यावरणीय निर्भरता की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। परख या तो ंयूनतम या समृद्ध वातावरण में बढ़ रही विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ कोशिकाओं में उत्परिवर्तन दर अनुमान के लिए अनुमति देता है। परख न केवल एक मोनोकल्चर के रूप में बढ़ रही आबादी के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह भी उत्परिवर्तन दरों11पर सेल सेल बातचीत के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब ब्याज के तनाव को दूसरे तनाव के साथ सहसंस्कारित किया जाता है, और उपभेदों को अलग करने के लिए एक तटस्थ मार्कर का उपयोग किया जाता है, तो उत्परिवर्तन दरों को एक ही समय में एक ही ट्यूब में दो उपभेदों के लिए परख दिया जा सकता है।

उतार-चढ़ाव के परखों से पता चला है कि सहज उत्परिवर्तन दर एक सेल के जीनोटाइप और उसके पर्यावरण12 दोनों पर निर्भर करती है और यह एक विशेषता है जो खुद13विकसित होती है । जब भी एक विशेष जीनोटाइप की उत्परिवर्तन दर पर्यावरण के साथ बदलती है, तो इसे म्यूटेशन-रेट प्लास्टिसिटी11के रूप में वर्णित किया जाता है । प्लास्टिक उत्परिवर्तन दरों को तनाव से प्रेरित म्यूटाजेनेसिस (सिम)14के लिए सबसे अच्छी तरह से संबोधित किया गया है । इसके अलावा, उतार-चढ़ाव परख ों का उपयोग करते हुए, हाल ही में यह दिखाया गया है कि जिस घनत्व से कोशिकाओं की आबादी बढ़ती है (आमतौर पर क्षमता में एक बैच संस्कृति) बैक्टीरिया और एककोशिकीय यूकेरियोट्स में उत्परिवर्तन दरों से निकटता से जुड़ी होती है। प्रति पीढ़ी प्रति जीनोम उत्परिवर्तन दर घने आबादी में 23 गुना10,11तक कम हो जाती है . यह घनत्व से संबंधित उत्परिवर्तन दर प्लास्टिसिटी (डीएएमपी) कोरम-सेंसिंग सिस्टम15 पर निर्भर कर सकती है और सिम16से स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकती है।

यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक ग्लूकोज ंयूनतम मीडिया वातावरण में एंटीबायोटिक रिफाम्पिसिन के लिए प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल उतार चढ़ाव परख के लिए प्रस्तुत किया है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल को एक बुनियादी टेम्पलेट के रूप में देखा जाना चाहिए जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के रोगाणुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है ताकि केवल संस्कृति की स्थिति और उत्परिवर्तन के फेनोटाइपिक मार्कर को संशोधित किया जा सके। यह प्रोटोकॉल अपनीस्थापना5,17, 18,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29 से विकसित हुआ है, इसके उपयोग के माध्यम से रोगाणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला और यहां तक कि कैंसर कोशिकाओंको 30 पर संशोधित किया गया है और इसे बढ़ाने के लिए संशोधित किया गया है थ्रूपुट, जो माइक्रोबियल म्यूटेशनदरों 10,11,16के पर्यावरणनिर्भरता ठीक से परीक्षण के लिए आवश्यक था . यहां वर्णित प्रोटोकॉल में उतार-चढ़ाव परख के सभी पद्धतिगत और विश्लेषणात्मक मुद्दों को शामिल नहीं किया गया है जो साहित्य में पहले से ही अच्छी तरह से चर्चा कर चुके हैं, विशेष रूप से प्रतिरोधी उत्परिवर्तनों के फिटनेस प्रभाव31,फेनोटाइपिक देरी32,सेल डेथ33,और उत्परिवर्तन दरों का अनुमान लगाने के लिए उपलब्ध विभिन्न एल्गोरिदम की उपयुक्तता26,34। उदाहरण के लिए, यह महत्वपूर्ण हो सकता है, जब फिटनेस प्रभावों की पर्यावरणीय निर्भरता उत्परिवर्तन दरअनुमानों 35में गलत भिन्नता को जन्म दे सकती है। हालांकि, हम ध्यान दें कि विश्लेषणात्मक उपकरण है कि हम यहां का उपयोग उत्परिवर्ती फिटनेस और सेल मौत में भिन्नता से निपटसकते हैं । जैसा कि नोटों और चर्चा में संबोधित किया गया है, यह भी सिफारिश की जाती है कि कई फेनोटाइपिक मार्कर जो पर्यावरण की दृष्टि से निर्भर फिटनेस प्रभाव ों पर विचार करने की संभावना नहीं है। यह प्रोटोकॉल लोगों को नियमित रूप से माइक्रोबियल उपभेदों और वातावरण की विविधता में उत्परिवर्तन दरों की पर्यावरणीय निर्भरता परख लगाने में सक्षम बनाएगा । विभिन्न वातावरणों में उत्परिवर्तन ों को अभी तक अच्छी तरह से परीक्षण नहीं किया गया है और एक बार जनसंख्या घनत्व पर विचार किया जाता है, उतार-चढ़ाव परख उत्परिवर्तन दर10का अधिक सटीक अनुमान दे सकते हैं । यह प्रोटोकॉल अधिक उतार-चढ़ाव वाले परखों को पूरा करने में सक्षम बनाएगा, जैसा कि उत्परिवर्तन दरों को रेखांकित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए आवश्यक है, जो बदले में विकास, कैंसरजन्य, उम्र बढ़ने और रोगाणुरोधी प्रतिरोध को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

Protocol

1. दिन 1: टीका और संस्कृतियों के अनुकूलन

  1. तरल लाइसोजेनी शोरबा (एलबी, ई. कोलाई MG1655 ग्लाइसेरोल स्टॉक (18% ग्लाइसेरोल, -80 डिग्री सेल्सियस) से बर्फ के कुरेदने के साथ पूरक तालिका 1देखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 7 घंटे के लिए 120 आरपीएम पर एलबी संस्कृति हिला।
    नोट: इस प्रयोग में, एलबी में बढ़ रही ई कोलाई K12 MG1655 का उपयोग किया जाता है, लेकिन इस परख का प्रदर्शन किसी भी ई. कोलाई तनाव या किसी अन्य कृषि योग्य माइक्रोबियल प्रजातियों के साथ किया जा सकता है। ऊष्मायन तापमान, ऊष्मायन समय, और विकास मीडिया के पोषक तत्वों का स्तर सभी प्रजातियों या तनाव से भिन्नता के अधीन हो सकते हैं।
  2. नमकीन समाधान का उपयोग कर संस्कृति 2,000 गुना पतला। तरल डेविस न्यूनतम माध्यम (डीएम, देखें अनुपूरक तालिका 1)के 10 मिलीग्राम के साथ तीन 50 मीटर स्क्रू कैप शंकुल बॉटम पॉलीमर ट्यूब (50 मीटर ट्यूब) के लिए पतला समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें, क्रमशः 80 मिलीग्राम/एल, 125 मिलीग्राम/एल, या ग्लूकोज के 250 मिलीग्राम/एल युक्त। यह वही माध्यम (यानी पर्यावरण) है, जिसमें नामांतरण दर का अनुमान लगाया जाएगा। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात 120 आरपीएम पर संस्कृतियों हिला।
    नोट: मीडिया का चुनाव प्रजातियों, तनाव या अनुसंधान प्रश्न द्वारा भिन्नता के अधीन है।

2. 2 दिन: समानांतर संस्कृतियों में म्यूटेंट की पीढ़ी

  1. सबसे पहले, वातावरण है जिसमें बैक्टीरिया सुसंस्कृत किया जाएगा तैयार करते हैं। हमेशा आवश्यकता से 10% अधिक तैयार करें (यानी, बीस 1 मिलीलीटर संस्कृतियों को 22 एमएल की आवश्यकता होती है)। 1 की 22 मिलीग्राम) डीएम के साथ तैयार करें ग्लूकोज, 2) ग्लूकोज के 125 मिलीग्राम/एल के साथ डीएम, 3) ग्लूकोज के 250 मिलीग्राम/एल के साथ डीएम, 4) ग्लूकोज के 80 मिलीग्राम/एल के साथ डीएम, और 5) डीएम पांच 50 मिलीग्राम ट्यूब में ग्लूकोज के 250 मिलीग्राम/एल के साथ। उन्हें क्रमशः जीएलसी-80ए, जीएलसी-125, जीएलसी-250ए, जीएलसी-80बी और जीएलसी-250बी के रूप में लेबल करें।
  2. वातावरण के लिए इनोकुला तैयार करें। सुनिश्चित करें कि पर्यावरण के 1 mL के लिए इनोकुलम में 1,000−5,000 कोशिकाएं शामिल हैं। नीचे दिए गए चरणों का पालन करके ऐसा करें।
    1. 600 एनएम पर रातोंरात संस्कृतियों (चरण 1.2 से) के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें।
    2. ग्लूकोज के साथ डीएम के प्रति 1,000-5,000 कोशिकाओं प्रति एमएल के अंतिम घनत्व तक पहुंचने के लिए प्रत्येक रात की संस्कृति को पतला करें। हमारे हाथों में, यदि 2.2.1 में मापा गया ओडी 0.3 है, तो इसका मतलब है कि रात भर की संस्कृति का 100 गुना कमजोर पड़ना (खारा समाधान में) बनाना, फिर 22 मीटर वातावरण में इस समाधान का 11μl जोड़ना।
  3. समानांतर संस्कृतियों को तैयार करें।
    नोट:
    यह प्रोटोकॉल एक 96 गहरी अच्छी तरह से प्लेट के लिए लिखा गया है, पांच उतार चढ़ाव परख (एक 96 अच्छी प्लेट पर अधिकतम उचित संख्या) प्रदर्शन, तीन वातावरण का उपयोग कर. अनुभव के साथ, कई गहरी अच्छी तरह से प्लेटें समानांतर में चलाया जा सकता है ।
    1. एक 96 गहरी अच्छी तरह से थाली के लिए समानांतर संस्कृतियों का एक यादृच्छिक लेआउट बनाएं। सप्लीमेंट्री आर स्क्रिप्ट लेआउटजेनरेटर.आर (फिगर 1बीमें लेआउट देखें) का उपयोग इसके लिए किया जा सकता है। लेआउट के अनुसार 96 गहरी अच्छी तरह से प्लेट पर प्रत्येक समानांतर संस्कृति की स्थिति।
      नोट: लेआउटजेनरेटर.आर चलाने से यह सुनिश्चित होगा कि पहली परख में 20 समानांतर संस्कृतियां हैं, और दूसरे, तीसरे, चौथे और पांचवें परख में 19 समानांतर संस्कृतियां हैं।
    2. बेतरतीब लेआउट के अनुसार 96 गहरी अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में टीका मीडिया के 1 mL स्थानांतरित करें।
    3. टेप के साथ डीप वेल प्लेट के ढक्कन को ठीक करें। ढक्कन को कसकर ठीक न करें, क्योंकि संस्कृति वृद्धि वात्सल्य की मात्रा के प्रति संवेदनशील है।
    4. ढक्कन और टेप के साथ पूरी थाली वजन और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर थाली हिला। प्रायोगिक सेटों के बीच वाष्पीकरण की मात्रा को स्थिर करने के लिए इनक्यूबेटर में आसुत पानी के 2 एल रखें।
  4. गैर-चयनात्मक टेट्राज़ोलियम (टीए) एगर प्लेट (पूरक तालिका 1देखें) पर टीका लगाने वाले मीडिया में से प्रत्येक के 10 माइक्रोन चढ़ाना द्वारा इनोकुलम आकार निर्धारित करें। जब तक आगर की सतह सूखी न हो जाए तब तक बाँझ एल के आकार के स्प्रेडर का प्रयोग करें। इनक्यूबेट टीए एगर प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नीचे ढक्कन।
    नोट: टीए एगर एक समृद्ध आगर है जिसमें चीनी एल-अरबीनोज और पानी में घुलनशील डाइ 2,3,5-ट्रिप्फेनहाइटेट्राज़ोलियम क्लोराइड होता है, जो इसके ऑक्सीकृत रूप में बेरंग होता है। जब बैक्टीरिया रंग को कम करते हैं, तो यह फोराज़न के बनने के कारण लाल हो जाता है। टीए एगर पर उपनिवेश जो एल-अरबीनोज़ का उपयोग नहीं कर सकते हैं, गहरे लाल हैं। MG1655 जैसे अन्य उपभेद गुलाबी हैं। मानक एलबी एगर के बजाय टीए एगर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि रंगीन जीवाणु उपनिवेशों को हाजिर करना आसान होता है, जो कॉलोनी को अधिक विश्वसनीय और तेज गिनती बनाता है।
  5. 6 अच्छी प्लेटों में रिफामपिसिन युक्त चुनिंदा टीए एगर तैयार करें। 6 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में चयनात्मक टीए आगर के 5 mL पिपेट। टीए एगर में जोड़ने से ठीक पहले एंटीबायोटिक रिफामिसिन तैयार करें।
    नोट:
    जब एक मार्कर के रूप में cycloserine प्रयोग किया जाता है, २५० मिलीग्राम/ग्लूकोज के एल के साथ डेविस ंयूनतम माध्यम का उपयोग करें आगर और एल-अरबीनोज और २,३,५-triphenyltetrazolium क्लोराइड के साथ एक चयनात्मक आगर के रूप में पूरक । अर्थात्, टीए एगर केवल उन कोशिकाओं का चयन नहीं करता है जो सायरेमेन के प्रतिरोधी हैं, क्योंकि ट्राइप्टोन और खमीर निकालने (टीए एगर के दोनों आवश्यक घटक) में अमीनो एसिड डी-अलानिन होते हैं। यह अमीनो एसिड साइक्लोजिन के रोगाणुरोधी प्रभाव को विरोधी बनाता है और सभी कोशिकाओं को उपनिवेश बनाने की अनुमति देता है।
    1. कमरे के तापमान पर अंधेरे में चयनात्मक और शेष गैर-चयनात्मक प्लेटों (उदाहरण के लिए, एक बॉक्स में) छोड़ दें।

3. दिन 3: चयनात्मक और गैर चयनात्मक आगर प्लेटों पर चढ़ाना संस्कृतियों

  1. गैर-चयनात्मक आगर प्लेटों पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना करें और सीएफयू को गुणा करके इनोकुला के आकार को 100 तक निर्धारित करें। यह समानांतर संस्कृति की मात्रा (1 mL = 1,000 μL) और चढ़ाया मात्रा (10 μL) के बीच एक अनुपात है।
    नोट: यदि गैर-चयनात्मक प्लेटों को फ्रिज में संग्रहित किया जाता है तो सीएफयू को बाद में गिना जा सकता है।
  2. 24 एच के ऊष्मायन के बाद, वाष्पीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए पूरी गहरी अच्छी प्लेट का वजन करें। यह 10% के आसपास होने की संभावना है ।
  3. माइक्रोलीटर में 24 घंटे के ऊष्मायनकेबाद एकसमानांतर संस्कृति की औसत मात्रा की गणना करें , जो शुरुआती मात्रा V[0h]= 1,000 माइक्रोलीटर में परिवर्तित हो ता है और प्लेट का वजन माइक्रोलीटर में परिवर्तित हो जाता है, जहां विकास माध्यम का घनत्व एमजी/μl में मापा जाता है। यह अध्ययन 1 मिलीग्राम/μl के घनत्व का उपयोग करता है:
  4. परख के अनुसार तीन बेतरतीब ढंग से चुनी गई संस्कृतियों (कुल में 15, चित्रा 1बीमें लेआउट में एक काले सर्कल के साथ प्रकाश डाला) लेबल माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। अंतिम जनसंख्या आकार (या एनटी)का निर्धारण करने के लिए उन्हें बाद में उपयोग करने के लिए बेंच पर छोड़ दें (चरण 3.6 देखें)।
  5. प्लेट शेष ८१ समानांतर संस्कृतियों गहरी अच्छी तरह से थाली से चयनात्मक टीए आगर पर rifampicin युक्त । एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली से एक पूरे समानांतर संस्कृति पिपेट । सुनिश्चित करें कि किसी भी 6 अच्छी तरह से थाली एक से अधिक उतार चढ़ाव परख से समानांतर संस्कृतियों में शामिल हैं ।
    1. चुनिंदा आगर प्लेटों से ढक्कन निकालें, और बाँझ परिस्थितियों में खुला छोड़ दें । चुनिंदा टीए एगर की सतह पर सभी तरल को सुखा लें।
      नोट: आगर पूरी तरह से सूखा होने के नाते महत्वपूर्ण है । हालांकि, चयनात्मक टीए आगर को ओवरड्राई न करें, क्योंकि इसे क्रैक करने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।
  6. जबकि चयनात्मक टीए एगर प्लेटें सूख रही हैं, जिसमें कई घंटे तक का समय लग सकता है, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) का उपयोग करके चरण 3.4 में तैयार 15 संस्कृतियों में से एनटी निर्धारित करें।
    1. माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबों से संस्कृतियों को कमजोर करके सीएफयू का निर्धारण करें। प्रत्येक चरण पर संस्कृति के 100 माइक्रोन के साथ खारा समाधान के मिश्रण और भंवर 900 μL, मिश्रण और भंवर पांच 10 गुना कमजोर पड़ने वाले चरणों का प्रयोग करें। प्लेट 40 माइक्रोन ऑफ द लास्ट डिल्यूशन (105के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ) नॉन-चुनिंदा टीए एगर और इनक्यूबेट प्लेट्स 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नीचे ढक्कन।
      नोट: 96 वेल प्लेट्स में कमजोर पड़ने वाली सीरीज को मल्टीचैनल पिपेट के साथ किया जा सकता है, जो इस स्टेप की स्पीड बढ़ा सकता है।
  7. एक बार एक 6 अच्छी तरह से थाली पर सभी कुओं संस्कृति तरल से मुक्त कर रहे हैं, ढक्कन पर वापस डाल दिया और ढक्कन के साथ 6 अच्छी तरह से थाली बेंच पर नीचे जगह जब तक सभी 6 अच्छी तरह से प्लेटें सूखी हैं । एक बार जब सभी सूख जाते हैं, तो प्लेटों को 44-48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन करें।
    नोट: अन्य मार्कर (नैलिडिक्सिक एसिड, साइक्लोजर, हाइग्रोमाइसिन बी, या 5-FOA) के लिए प्लेटों को 68-72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर में आर्द्रता अधिक है। यह महत्वपूर्ण है कि चुनिंदा आगर प्लेटें ऊष्मायन अवधि के दौरान सूखी नहीं हैं।

4. 4 दिन: संस्कृतियों में कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण

  1. बिना चुनिंदा आगर प्लेटों पर सीएफयू की गणना करें। कमजोर पड़ने वाले कारक (105)के साथ सीएफयू को गुणा करके संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाएं और गणना औसत मात्रा V[24घंटे]के बीच का अनुपात माइक्रोलीटर में (चरण 3.3 देखें) और चढ़ाया गया मात्रा (40 μ) ।
  2. एक विशेष वातावरण में बढ़ रही एक विशेष जीनोटाइप के एन टी तीन संस्कृतियों से इन मूल्यों का मतलब है ।

5. 5 दिन: उत्परिवर्तन दर का अनुमान

  1. चुनिंदा टीए एगर प्लेटों पर एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोधी कॉलोनियों की संख्या की गणना करें (यानी, 2−3 दिनों में डीप-वेल प्लेट में सहज उत्परिवर्तन के माध्यम से उत्पन्न प्रतिरोधी कोशिकाओं की संख्या)। एक विशेष परख के लिए म्यूटेंट की देखी गई संख्या की समानांतर संस्कृतियों के बीच वितरण रिकॉर्ड करें (उदाहरण के लिए, शून्य गिनती सहित 16 या 17 मूल्य)।
    नोट:
    यदि चुनिंदा प्लेटों को फ्रिज में संग्रहीत किया जाता है, तो एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोधी कॉलोनियों को बाद में गिना जा सकता है।
    1. आर पैकेज फ्लैन36का उपयोग करके म्यूटेशनल घटनाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए प्रत्येक वितरण का उपयोग करें।
      नोट: इसी तरह की कार्यक्षमता29के साथ आर-पैकेज आरसाल्वाडोर भी है।
    2. एक ही कॉलम के रूप में एक पाठ फ़ाइल में एक परख के लिए मनाया म्यूटेंट के वितरण को बचाओ ।
  2. नीचे विस्तृत के रूप में एम का अनुमान लगाने के लिए Shinyflan सॉफ्टवेयर (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) का उपयोग करें।
    1. टैब परिकल्पना परीक्षण में चूक के रूप में मूल्यों को छोड़ (यानी, अज्ञात फिटनेस टिक, अनुमान विधि = अधिकतम संभावना (एमएल), उत्परिवर्ती लाइफटाइम का वितरण = घातीय (एलडी मॉडल), विंसर पैरामीटर = 1,024, उत्परिवर्तन संख्या और फिटनेस = 1, आत्मविश्वास स्तर = 0.95, कक्षा की संख्या और मैक्सिमल वैल्यू = 100)।
    2. ब्राउज़ करें और मनाया म्यूटेंट के वितरण के साथ पाठ फ़ाइल का चयन करें। सबसे पहले सप्लीमेंट्री डाटा फाइल के साथ प्रयास करें।
    3. फाइल अपलोड करने के बाद, प्रदर्शन टेस्टपर क्लिक करें । एक नमूना एमएल-टेस्ट (एलडी मॉडल) के तहत परीक्षण के परिणाम केतहत दाईं ओर दाईं ओर, उत्परिवर्तन संख्यापाते हैं । यह एम,म्यूटेशनल घटनाओं की अपेक्षित संख्या है।
    4. उत्परिवर्तन संख्या के लिए 95 प्रतिशत विश्वास अंतराल के तहत एमके ऊपरी और निचले बंधे पाते हैं ।
  3. एक बार एम और एनटी (सीएफयू द्वारा निर्धारित) उपलब्ध हैं, एक विशेष वातावरण में एक विशेष जीनोटाइप की उत्परिवर्तन दर का अनुमान के रूप में । म्यूटेशन दर पर विश्वास अंतराल उत्पन्न करने के लिए एनटी द्वारा एम पर ऊपरी और निचली सीमा को विभाजित करें (एनबी यह एनटीमें अनिश्चितता के लिए खाता नहीं है)।
    नोट: परिणाम प्रति पीढ़ी आरपीओबी लोकस प्रति उत्परिवर्तन दर के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। प्रति आधार जोड़ी उत्परिवर्तन दर 79 द्वारा प्रति आरपीओबी लोकस को विभाजित करके उत्पन्न होती है, जो कि एक आरपीओबी जीन के भीतर कितने बिंदु उत्परिवर्तन ों का हमारा वर्तमान ज्ञान है जो रिफाम्पिसिन37के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है। गुणसूत्र(ई कोलाई कश्मीर-12 MG1655 = 4,639,675 बीपी) के आकार से प्रति न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तन दर गुणा करना, प्रति जीनोम उत्परिवर्तन दर देता है।
  4. शेष चार उतार-चढ़ाव के साथ चरण 5.1−5.3 दोहराएं।

Representative Results

परिणाम तीन अलग अलग अलग शोधकर्ताओं, जहां प्रत्येक सप्ताह एक ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली पांच उत्परिवर्तन दर अनुमान उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था द्वारा चार अलग अलग हफ्तों में रिपोर्ट प्रोटोकॉल के साथ इकट्ठे हुए थे । कुल मिलाकर तीन 96 गहरी अच्छी तरह से प्लेटें उत्पन्न 15 उत्परिवर्तन दर अनुमान (± 95% विश्वास अंतराल, सीआई) ई. कोलाई के-12 MG1655 (चित्रा 2 ए, जैसा कि प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाताहै), जबकि ई कोलाई के -12 बीडब्ल्यू251131311111115 म्यूटेशन रेट अनुमान (± 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल, सीआई) ई कोलाई के-12 MG1655(चित्रा 2ए,जैसा कि प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है) उत्पन्न किया गयाथा। चित्रा 2 में अनुमान लगाने की इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत परिशुद्धता 17.5% (1.00%−28.9%, n = 20) है। परिशुद्धता उत्परिवर्तनीय घटनाओं की अपेक्षित संख्या की भिन्नता का गुणांक है(एम)की गणना एम/एम एक्स 100% (जहां गणना पहले 38के रूप में की जाती है)। चित्रा 2 के लिए रॉ डेटा अनुपूरक डेटा फ़ाइल "Krasovec_etal_JoVE_data.csv" में उपलब्ध है। सप्लीमेंट्री डाटा फाइल में फिगर 2जेनरेट करने के लिए आर स्क्रिप्ट के साथ होता है । बैक्टीरियल उपभेदों के बारे में अधिक जानकारी के लिए अनुपूरक तालिका 2 और पूरक तालिका 3भी देखें, जहां डेटा फ़ाइल में कॉलम समझाए जाते हैं । रिफाम्पिसिन और नैलिडिक्सिक एसिड के साथ प्राप्त डेटा बिंदु पहले क्रासोवेक एट अल10 में प्रकाशित किए गए थे और पहली बार प्रकाशित होने पर यहां एक ही आईडीएस है।

चित्रा 2मेंतीन अलग-अलग फेनोटाइपिक मार्कर, साइकरीबेरिन, रिफमपिसिन और नैलिडिक्सिक एसिड की MG1655 उत्परिवर्तन दर प्रस्तुत की जाती है। यहां, म्यूटेशन दरों का आकलन डेविस न्यूनतम माध्यम में ८०, १२५ और ग्लूकोज के २५० मिलीग्राम/एल के साथ किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में बताया गया है । एक मामले में ग्लूकोज के 1,000 मिलीग्राम/एल का उपयोग किया गया था(चित्रा 1बी)। व्यवहार में, किसी भी प्रारंभिक ग्लूकोज एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि उम्मीद थी, नामांतरण दर साइक्लोजिन प्रतिरोध के लिए अधिक थी, जो नैलिडिक्सिक एसिड प्रतिरोध के लिए सबसे कम थी, और रिफिम्पिसिन प्रतिरोध की दर बीच में थी। यह इन तीन प्रतिरोधों के लिए ज्ञात लक्ष्य आकारों के अनुसार है, जहां सबसे बड़ा साइक्लोजिन के लिए है और नालिडिक्सिक एसिड के लिए सबसे छोटा है। चर्चा और चित्रा 3 कैसे लक्ष्य आकार, समानांतर संस्कृतियों की मात्रा, और पर्यावरण में पोषक तत्वों के स्तर का फायदा उठाने के लिए उतार चढ़ाव परख के साथ माइक्रोबियल उत्परिवर्तन दरों के मापने का अनुकूलन करने के बारे में विवरण दे ।

उतार-चढ़ाव परख से साफ पता चलता है कि कौन सा तनाव एक संविलियन म्यूटेटर है और जिसमें सामान्य उत्परिवर्तन दरें हैं । म्यूट स्ट्रेन में लगभग 50x उच्च उत्परिवर्तन दर नैलिडिक्सिक एसिड प्रतिरोध(चित्रा 2बी)के रूप में MG1655(चित्रा 2ए)थी। हालांकि, विभिन्न वातावरण ों में एक विशेष जीनोटाइप की उत्परिवर्तन दर निर्धारित करने के लिए, केवल एक फेनोटाइपिक मार्कर का उपयोग करके प्रति जीनोटाइप प्रति जीनोटाइप कम से कम पांच प्रतिकृति करने की सिफारिश की जाती है। पहले इस प्रकार के प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सांख्यिकीय तरीकों की विस्तृत रूपरेखा के लिए, क्रासोवक एट अल10में अनुपूरक जानकारी देखें।

Figure 2
चित्रा 2: उत्परिवर्तन दरों के प्रतिनिधि आंकड़ा Escherichia कोलाई आबादी में उतार चढ़ाव परख से अनुमानित । (A)जंगली प्रकार MG1655 (हलकों) में रिपोर्ट प्रोटोकॉल द्वारा निर्धारित उत्परिवर्तन दर। यह आंकड़ा रिफामपिसिन (हल्के नीले घेरे), नैलिडिक्सिक एसिड (लाल घेरे), और साइक्लोजिन (गहरे नीले घेरे) प्रतिरोध की उपस्थिति में उत्परिवर्तन दरों को दर्शाता है। नैलिडिक्सिक एसिड के लिए, 10 मिलील की बड़ी संस्कृति की मात्रा का उपयोग किया गया था (पूरक डेटा फ़ाइलदेखें)। रिफ्मेपिकिन और नालिडिक्सिक एसिड के लिए डेटा को Krašovec एट अल10में चित्रा 2 से फिर से प्लॉट किया जाता है। (ख)केओ 39में नैलिडिक्सिक एसिड प्रतिरोध के लिए उत्परिवर्तन दर39 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000000000 उत्परिवर्तन दर धुरी पर लॉगरिथमिक पैमाने पर ध्यान दें। त्रुटि सलाखों = 95% विश्वास अंतराल प्रोटोकॉल में समझाया के रूप में गणना की। डेटा Krašovec एट अल10में चित्रा 4 से फिर से प्लॉट किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: उतार चढ़ाव परख की शूटिंग के लिए एक फ्लोचार्ट । फ्लोचार्ट को ऊपर से फॉलो किया जाना है, बदले में पीले हीरे में तीन सवालों को संबोधित करते हुए, परिणामस्वरूप हरे बक्से की सामग्री के अनुसार प्रोटोकॉल को समायोजित करना, और लाल अंडाकार में इंगित प्रोटोकॉल को लागू करना। कैसे समस्या निवारण के लिए पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा के पहले तीन पैराग्राफ देखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मीडिया के लिए फार्मूले। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

अनुपूरक तालिका 2: बैक्टीरियल उपभेदों। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

अनुपूरक तालिका 3: कच्चे डेटा फ़ाइल में कॉलम का विस्तृत विवरण Krasovec_etal_JoVE_data.csv । कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

अनुपूरक डेटा फाइलें। इन फाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

उत्परिवर्तन दर के किसी भी अनुमान के लिए34अध्ययनों के भीतर और बीच में दोहराव और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्राप्त परिशुद्धता को अधिकतम करने की आवश्यकता होती है । एक उतार चढ़ाव परख के लिए, वहां तीन महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । पहले दो दिए गए प्रोटोकॉल में स्थापित किया गया है, लेकिन समस्या निवारण की आवश्यकता होगी (चित्रा 3देखें) अगर प्रोटोकॉल विभिन्न उपभेदों या वातावरण के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जाता है । सबसे पहले उपयुक्त फेनोटाइपिक मार्कर चुनना है। बैक्टीरिया के लिए, क्रमशः एंटीबायोटिक दवाओं रिफाम्पिकिन और नैलिडिक्सिक एसिड के प्रतिरोध को प्रदान करते हुए, दो मार्कर लोकी, आरपीओबी या जायरामें से एक पर दरों का अनुमान लगाने की सिफारिश की जाती है। इन दोनों लोकी पर एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए उत्परिवर्तन के लिए लक्ष्य आकार अलग है । क्रमशः रिफामिपिसिन37 और नैलिडिक्सिक एसिड 40 के प्रतिरोध को प्रदान करने वाले 79 और20 अद्वितीय उत्परिवर्तन हैं। व्यवहार में, इसका मतलब यह है कि औसतन, रिफाम्पिकिन प्रतिरोधी म्यूटेंट अधिक बार मनाए जाते हैं। तो, पहला सवाल (चित्रा 3में Q1) है कि जवाब देने की जरूरत है या नहीं तनाव एक उत्परिवर्ती है । जब संविलियन म्यूटेटर का अध्ययन किया जाता है, जहां कई देखे गए उत्परिवर्ती उपनिवेशों की उम्मीद की जाती है, तो छोटे लक्ष्य आकार (जैसे, नैलिडिक्सिक एसिड) के साथ मार्कर का उपयोग करना बेहतर होता है। देखें चित्रा 2बी,जहां संविलियन म्यूटर ई कोलाई के-12 BW25113की उत्परिवर्तन दरों का अनुमान एक मार्कर के रूप में नैलिडिक्सिक एसिड का उपयोग कर रहा था । नॉनम्यूटेटर बैक्टीरियल उपभेदों के साथ काम करते समय जिनमें जंगली प्रकार (यानी सामान्य) उत्परिवर्तन दर होती है, रिफामपिसिन एक बेहतर विकल्प है (चित्रा 2देखें)। यदि किसी कारण से अधिक देखे गए म्यूटेंट की आवश्यकता होती है, तो एक प्रासंगिक मार्कर एक साइक्लोजिन का प्रतिरोध है। इस मार्कर के लिए, प्रतिरोध उत्परिवर्तन दस से अधिक जीन41में उभर सकते हैं, जिसका अर्थ है कि लक्ष्य का आकार रिफाम्पिसिन की तुलना में भी बड़ा है। खमीर और आर्काया का अध्ययन करते समय 25S राइबोसोमल प्रोटीन और URA3 में उत्परिवर्तन दरों का अनुमान लगाने की सिफारिश की जाती है, जो क्रमशः हाइग्रोमाइसिन बी और 5-फ्लोरो-ऑरोटिक एसिड (5-FOA) के प्रतिरोध प्रदान करता है।

दूसरा महत्वपूर्ण विचार समानांतर संस्कृतियों की मात्रा है । उपयोग करने के लिए कौन सी मात्रा देखी गई म्यूटेंट की वास्तविक संख्या पर निर्भर करती है। मनाया म्यूटेंट की अपेक्षित संख्या चुने हुए फेनोटाइपिक मार्कर के लिए लक्ष्य आकार, म्यूटेशन (औसत उत्परिवर्तन दर) की मरम्मत और बचने की तनाव की क्षमता और पर्यावरण की वहन क्षमता से प्रभावित होती है, जो मीडिया द्वारा उपयोग किए गए और संस्कृति की मात्रा दोनों से प्रभावित होती है। यदि कोई समानांतर संस्कृतियों में रिफ्मेपिसिन के प्रतिरोधी उत्परिवर्ती उपनिवेश होते हैं, तो साइक्लोजिन का उपयोग किया जाना चाहिए या प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की जानी चाहिए। यह एक न्यूनतम माध्यम के लिए और अधिक ग्लूकोज जोड़कर या एक अमीर (या पूरा) वातावरण में कोशिकाओं को बढ़ाकर प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, कई मामलों में, जनसंख्या घनत्व में इस तरह की वृद्धि उत्परिवर्तन दर में कमी के साथ जुड़ी हुई है, जिसके परिणामस्वरूप सीमित, यदि कोई हो, उत्परिवर्ती कॉलोनियों की संख्या में वृद्धि10देखी गई । यदि पोषक तत्वों को बढ़ाना कोई समाधान नहीं है, तो प्रत्येक समानांतर संस्कृति की मात्रा में वृद्धि करके कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि एक विकल्प है। जब पर्यावरण में कार्बन और ऊर्जा के एकमात्र स्रोत के रूप में चीनी के साथ न्यूनतम लवण शामिल होते हैं (यानी, चित्रा 3 में Q2 का उत्तर "न्यूनतम माध्यम" है), तो 0.5 और 1.5 mL के बीच की मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि पर्यावरण समृद्ध है, तो समानांतर संस्कृतियों की मात्रा 0.35−1 मिलील के बीच होनी चाहिए। अंतिम प्रश्न प्रतिरोधी कॉलोनियों की औसत संख्या से संबंधित है। यदि बहुत कम उत्परिवर्ती उपनिवेशों को देखा जाता है (यानी, चित्रा 3 में Q3 का उत्तर 0 है) और पर्यावरण को संशोधित नहीं किया जाना चाहिए, तो समानांतर संस्कृतियों की मात्रा को बढ़ाया जाना चाहिए या एक बड़े लक्ष्य आकार (जैसे, cycloserine) के साथ एंटीबायोटिक का उपयोग किया जाना चाहिए। दूसरी ओर, यदि सभी चयनात्मक प्लेटों (प्रति प्लेट ~ 150 से अधिक) पर बहुत सारी उत्परिवर्ती उपनिवेशों को देखा जाता है, तो चित्रा 3देखें), तो प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या में कमी की जानी चाहिए, जिसका अर्थ है आमतौर पर कम मात्रा का उपयोग करना या छोटे लक्ष्य आकार (जैसे, नैलिडिक्सिक एसिड) के साथ एंटीबायोटिक पर स्विच करना।

एक बार मात्रा चुना जाता है, यह सबसे अच्छा है कि एक ९६ गहरी अच्छी तरह से थाली पर सभी समानांतर संस्कृतियों एक ही मात्रा है । कि थाली के वजन से समानांतर संस्कृतियों की वास्तविक मात्रा के अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देता है । जब किसी विशेष जीनोटाइप की उत्परिवर्तन दरों की तुलना विभिन्न वातावरणों के बीच की जाती है, तो सभी वातावरणों में समानांतर संस्कृतियों की समान मात्रा का उपयोग करना फिर से सबसे अच्छा होता है। यदि नालिडिक्सिक एसिड का उपयोग जंगली प्रकार (यानी सामान्य) उत्परिवर्तन दरों या कुछ अन्य फेनोटाइपिक मार्कर का आकलन करने के लिए किया जाता है जिसका उपयोग किया जाता है जिसमें नैलिडिक्सिक एसिड की तुलना में एक भी छोटा लक्ष्य आकार होता है, तो मात्रा को और भी अधिक बढ़ाया जाना चाहिए। एक विकल्प के लिए 15 mL तक की मात्रा के साथ ५० mL ट्यूबों में समानांतर संस्कृतियों बनाने के लिए है । उदाहरण के लिए, 10 मिलीग्राम समानांतर संस्कृतियों को 50 मिलीग्राम ट्यूबों में तैयार किया गया था जब ई कोलाई के-12 MG1655 उत्परिवर्तन दर का अनुमान लगाते समय नैलिडिक्सिक एसिड (चित्रा 2देखें)। समानांतर 10 मीटर संस्कृतियों तो चयनात्मक टीए आगर पर चढ़ाया गया और मानक ९० मिमी पेट्री व्यंजन के बजाय बड़ी १५० मिमी प्लेटों में डाला । 50 एमएल ट्यूबों में समानांतर संस्कृतियों को तैयार करने का नकारात्मक पक्ष यह है कि थ्रूपुट 96 गहरी अच्छी प्लेट में उत्परिवर्तन दरों को परसने की तुलना में काफी कम है। एक समाधान समानांतर संस्कृतियों की संख्या को कम करना है। हालांकि, यह एमके अनुमान के लिए सटीकता को प्रभावित करेगा, जो उत्परिवर्तनीय घटनाओं की अपेक्षित संख्या और समानांतर संस्कृतियों की संख्या26पर निर्भर करता है। 14−17 समानांतर संस्कृतियों के साथ मनाया म्यूटेंट का वितरण प्राप्त करना (जैसा कि चित्रा 2में किया गया था), एक ठोस थ्रूपुट और 20% के एक स्वीकार्य सटीक स्तर26 के बीच एक अच्छा संतुलन है। 17.5% का औसत सटीक स्तर 16.4% (5.7%−38.9%, n = 580) की एक इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत परिशुद्धता के समान है, जिसकी गणना10बहुत बड़े डेटा सेट से की जाती है। इस प्रकार, यह सिफारिश की जाती है कि 96 गहरी अच्छी प्लेटों या 50 मीटर ट्यूबों में समानांतर संस्कृतियों को तैयार करते समय देखा म्यूटेंट का वितरण कम से कम 14 समानांतर संस्कृतियों के साथ प्राप्त किया जाता है। जब उत्परिवर्तन दरों का अनुमान विभिन्न वातावरणों में किया जाता है तो मल्टीप्लेट प्रयोग करके सटीक स्तर का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है, जहां एक प्लेट पर सभी 96 समानांतर संस्कृतियां एक ही वातावरण में उगाई जाती हैं। इसके अलावा, समानांतर संस्कृतियों को तैयार करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि इनोकुला में कोशिकाओं की कम संख्या होती है, क्योंकि यह किसी भी प्रतिरोधी कोशिकाओं के इनोकुलम में मौजूद होने की संभावना को कम कर देता है। पहले से मौजूद प्रतिरोधी म्यूटेंट इनोकुलम में नहीं चाहते हैं, क्योंकि वे संख्या में वृद्धि करेंगे और चयनात्मक प्लेटों पर लॉन बनाएंगे और उत्परिवर्तन दर का अनुमान संभव नहीं होगा। उदाहरण के लिए, अधिकांश नॉनम्यूटेंटर ई. कोलाई आबादी में, रिफामपिसिन प्रतिरोध के लिए उत्परिवर्तन दर ~ 10-8 के क्रम में है। इस प्रकार, पहले से मौजूद प्रतिरोधी उत्परिवर्ती के साथ संस्कृति को टीका लगाने से बचने के लिए, किसी को 10 से कम8 कोशिकाओं (जैसे, 103−104 कोशिकाओं) के साथ टीका लगाना चाहिए। अंतिम महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि चुनिंदा आगर प्लेटों को इनक्यूबेटेड करने से पहले, चयनात्मक आगर पर सतह पूरी तरह से सूखी है। स्प्रेडर्स का उपयोग नहीं किया जा सकता है यदि 6-अच्छी प्लेटों का उपयोग किया जाता है और समानांतर संस्कृति की प्रारंभिक मात्रा 1 मिलीहै, उदाहरण के लिए। प्लेटों को बाँझ परिस्थितियों में खुला छोड़ दिया जाना चाहिए ताकि सतह तरल सूख जाए। समय यह लेता है अत्यधिक चर, परिवेश की स्थिति और प्लेटों की स्थिति पर निर्भर हो सकता है । इस समय को कम किया जाना चाहिए लेकिन कई घंटे तक हो सकता है।

उतार-चढ़ाव परख में अंतर्निहित बाधाएं हैं । यह केवल जीनोम के एक छोटे से सबसेट में उत्परिवर्तन के फेनोटाइपिक मार्कर परख करता है। इस प्रकार परख के लिए बड़ी आबादी की आवश्यकता होती है जो पर्याप्त संख्या में पीढ़ियों से गुजरती है ताकि दर का अनुमान लगाने के लिए पर्याप्त उत्परिवर्तन का निरीक्षण किया जा सके। इसका मतलब यह है कि उतार चढ़ाव परख केवल उन जीवों पर इस्तेमाल किया जा सकता है जो बैक्टीरिया, बेकर के खमीर42,या तरल संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं30की तरह तेजी से बड़ी संख्या में पीढ़ियों के माध्यम से जाने में सक्षम हैं। इसके अलावा, म्यूटेशन किसी विशेष कोशिका की विशिष्ट जैव रासायनिक परिस्थितियों में होने वाली दुर्लभ घटनाएं हैं। तथ्य यह है कि उतार चढ़ाव परख समय के साथ कोशिकाओं की बड़ी आबादी भर में देखो का मतलब है कि उन परिस्थितियों में काफी अंतर कर सकते हैं । इस परख का उपयोग करके, अंतराल चरण से प्रारंभिक और देर से घातीय चरण और अंत में एक स्थिर चरण तक किसी विशेष आबादी की उत्परिवर्तन दरों की प्रगति का अध्ययन करना मुश्किल है। जनसंख्या के भीतर एकल कोशिकाओं के बीच उत्परिवर्तन दरों का कोई भी भेदभाव पूरी तरह से उतार-चढ़ाव परख से छिपा हुआ है। एकल कोशिका उत्परिवर्तन गतिशीलता डीएनए मरम्मत प्रोटीन MutS४३ के एक एकल अणु ट्रैकिंग के साथ या संचित MutL प्रोटीन४४के foci गिनती के साथ अध्ययन किया जा सकता है । उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण में हाल की प्रगति ने माता-पिता-संतान तिकड़ी9,45 और बहुपीढ़ी वंशावली46से उत्परिवर्तन दरों का सीधा अनुमान लगाना भी संभव बना दिया है। इस तरह के पद्धतिगत अग्रिम एक ही पीढ़ी के भीतर होने वाले उत्परिवर्तनों की सीधी गिनती की अनुमति देने लगे हैं। हालांकि, इस प्रत्यक्ष दृष्टिकोण को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, माइक्रोफ्लूइडिक्स, या पूरे जीनोम अनुक्रमण जैसी महंगी और अत्याधुनिक प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, उतार चढ़ाव परख अपेक्षाकृत सस्ती है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की जरूरत है । अधिक उतार-चढ़ाव वाले परखों को करने से उपन्यास परिकल्पनाओं की पीढ़ी को भी सुविधा होगी, जिनका परीक्षण अधिक प्रत्यक्ष एकल-कोशिका दृष्टिकोणों के साथ किया जा सकता है।

म्यूटेशन के अध्ययन में लंबे समय से रुचि है, इसलिए उतार-चढ़ाव परख की संभावना एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि रहेगी। पिछले 4 वर्षों (2015-2018) में लुरिया और डेलब्रुक5 द्वारा मौलिक कागज के प्रशस्ति पत्रों की संख्या सभी इस पेपर के प्रशस्ति पत्र के लिए शीर्ष पांच में से एक रही है। हालांकि, एक उतार चढ़ाव परख को ठीक से बाहर ले जाने के लिए आवश्यक सटीक मैनुअल काम की एक बड़ी राशि के कारण, अधिकांश अध्ययन केवल मुट्ठी भर उतार-चढ़ाव परख का संचालन करते हैं। हालांकि, यह उत्परिवर्तन दर की पर्यावरणीय निर्भरता को प्रकट करने के लिए अपर्याप्त है। मल्टीवेल प्लेटों का उपयोग करके उतार-चढ़ाव के परखों को सुव्यवस्थित करके, जैसा कि इस पेपर में समझाया गया है, वर्तमान अधिकतम थ्रूपुट संभव है 11 गहरी अच्छी तरह से प्लेटें (५५ उतार-चढ़ाव परख) समानांतर में, जैसा कि यहां वर्णित है । उतार चढ़ाव के दो सेट चल रहा है समानांतर में एक दिन से कंपित, प्रति सप्ताह ११० परख तक ले जाने की अनुमति देता है । थ्रूपुट में एक और कदम परिवर्तन अभी तक विशुद्ध रूप से मैनुअल प्रोटोकॉल से उतार चढ़ाव परख के विभिन्न चरणों को स्वचालित करके संभव हो सकता है। साथ ही, उत्परिवर्तन दर की पर्यावरणीय निर्भरताओं का अध्ययन करने के लिए जनसंख्या घनत्व को ध्यान में रखने की आवश्यकता है । पिछले परिणाम10 से पता चलता है कि जब ज्ञात कारकों कि उत्परिवर्तन दर को प्रभावित करने के लिए हिसाब कर रहे हैं, जनसंख्या घनत्व के लिए नियंत्रित उत्परिवर्तन दर अनुमानों में भिन्नता ९०% से अधिक कम कर सकते हैं । घनत्व को नियंत्रित करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि एनटी (उत्परिवर्तन दर का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है) जनसंख्या घनत्व निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि से स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जाए। बैक्टीरिया में, एनटी CFU और घनत्व द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक एटीपी आधारित ल्यूमिनेसेंस परख10के साथ ।

उच्च थ्रूपुट और नियंत्रण घनत्व दोनों आवश्यक हैं जब अध्ययन कैसे एक जीव के पारिस्थितिक संदर्भ सहज उत्परिवर्तन दर को प्रभावित करता है । उत्परिवर्तन दर प्लास्टिसिटी के अस्तित्व को जानना महत्वपूर्ण है, लेकिन इसके कारणों और प्रभावों को समझना महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं जिन्हें पूरा करने की आवश्यकता है यदि उत्परिवर्तन दर प्लास्टिसिटी को व्यापक जैविक संदर्भ में शामिल किया जाना है। उतार-चढ़ाव परख एक महान उपकरण है जिसका उपयोग कई परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि परिणाम तेजी से प्राप्त किए जाते हैं, और परख अन्य तरीकों के सापेक्ष सस्ती होती है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल समुदायों और माइक्रोबायोम में उत्परिवर्तन दर की पर्यावरणीय निर्भरताका अध्ययन करने के लिए चरण निर्धारित किया गया है। सहसंस्कृतियों के लिए उतार चढ़ाव परख अनुकूल परिकल्पना है कि उपभेदों छोटे अणुओं के माध्यम से एक दूसरे के उत्परिवर्तन दरों को प्रभावित परीक्षण कर सकते हैं । सहसंस्कृतियों के साथ उतार चढ़ाव परख के हजारों कर निर्धारित कर सकते है अगर उपभेदों दोनों को एक दूसरे के उत्परिवर्तन दरों को संशोधित करने की क्षमता में बदलती है और उनकी संवेदनशीलता में उनके उत्परिवर्तन दर दूसरों के द्वारा संशोधित किया है । शायद उत्परिवर्तन दर हेरफेर के लिए संवेदनशीलता में उपभेदों के बीच भिन्नता विशिष्ट आनुवंशिक भिन्नता के कारण है । यह कैसे विकास जटिल समुदायों में काम करता है पर हमारे विचारों को बदल सकते हैं, इस तरह के रूप में व्यापक महत्व के उदाहरण में कम नहीं कैसे रोगाणुरोधी प्रतिरोध उभर ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

आरके को बीबी/M020975/1 और यूनिवर्सिटी ऑफ मैनचेस्टर स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज ने सपोर्ट किया । एचआर को बीबी/जे01478/1 ने सपोर्ट किया । GG BBSRC डॉक्टरेट प्रशिक्षण भागीदारी बीबी/M011208/1 द्वारा समर्थित था । डीआरजी को यूकेआरआई अवार्ड नंबर एमआर/आर024936/1 ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge tubes Starlab International GmbH S1615-5550
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877-10g
6-well plates Greiner Bio-One REF 657102
90 mm Petri Dishes Triple Vented ThermoFisher Scientific REF 120189
96 deep-well plate (Masterblock 2 mL) Greiner Bio-One REF 780270
Ammonium sulfate Fisher Chemical A/6440/53
Bacto Agar Becton, Dickinson and Company REF 214010
Bacto yeast extract Becton, Dickinson and Company REF 212750
Cycloserine Sigma-Aldrich 1158005-250MG Only for assaying an alternative phenotypic marker
D-Glucose anhydrous Fisher Chemical G/0500/61
50 mL Centrifuge Tube Corning REF 430828
L-(+)-Arabinose Sigma-Aldrich A3256-500g
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Chemical M/1050/53
Nalidixic acid Sigma-Aldrich N8878-5G Only for assaying an alternative phenotypic marker
Potassium phosphate dibasic trihydrate Sigma-Aldrich P5504-500g
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662-500g
Rifampicin EMD Millipore Corp, USA 557303-1GM
Sodium chloride Fisher Chemical S/3160/60
Spectophotometer Jenway 6320D
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625-25g
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804-500g
Tryptone Fisher Chemical 1278-7099

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