Síntese de Peptoides portadores de informações e sua Auto-montagem Dinâmica Covalent e dirigida por sequência

Chemistry
 

Summary

Um protocolo é apresentado para a síntese de oligômeros peptoides codificados por informações e para a auto-montagem dirigida por sequência desses peptoides em escadas moleculares usando aminas e aldeídos como pares reagentes covalentes dinâmicos e Lewis ácido rare-terra triflates metálicos como reagentes multi-função.

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Leguizamon, S. C., Alqubati, A. F., Scott, T. F. Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly. J. Vis. Exp. (156), e60442, doi:10.3791/60442 (2020).

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Abstract

Este protocolo apresenta o uso de reagentes multi-papéis ácidos de Lewis para contornar armadilhas cinéticas observadas durante a automontagem de fios oligoméricos codificados por informações mediadas por interações covalentes dinâmicas emparelhadas de uma maneira que imita o ciclo térmico comumente empregado para a auto-montagem de sequências de ácido nucleico complementar. Momeros de amina primária com aldeído e moieties de pingente de amina são funcionados com grupos de proteção ortogonais para uso como pares reagentes covalentes dinâmicos. Usando um sintetizador de peptídeo automatizado modificado, os monômeros de amina primária são codificados em fios oligo (peptoide) através da síntese submonomera em fase sólida. Após a purificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e caracterização por espectrometria de massa de ionização eletrospray (ESI-MS), os oligômeros específicos da sequência são submetidos ao alto carregamento de um triflate metálico de terra rara ácido de Lewis que tanto desprotege os moieties de aldeído e afeta o equilíbrio do par reagente de tal forma que encalhe completamente dissocia. Posteriormente, uma fração do ácido Lewis é extraída, permitindo a afusão de fios específicos de sequência complementar para formar escadas moleculares codificadas por informações caracterizadas pela espectrometria de massa de desorização/ionização de laser assistido por matriz (MALDI-MS). O simples procedimento descrito neste relatório contorna armadilhas cinéticas comumente experimentadas no campo da montagem covalente dinâmica e serve como uma plataforma para o design futuro de arquiteturas robustas e complexas.

Introduction

O progresso na automontagem, processo pelo qual pequenas subunidades geram arquiteturas maiores através de vias termodinamicamente orientadas, proporcionou um melhor controle sobre nanoestruturas macro e supramoleculars tipicamente explorando interações intermoleculares como o acúmulo de π e a ligação de hidrogênio1,2,3,4. Em particular, os ácidos nucleicos (ou seja, polinucleotídeos) emergiram como uma mídia de nanoconstrução notavelmente versátil como a alta densidade de informação fornecida pela combinação de base watson-Crick permite a montagem de estruturas complexas e seqüenciais-seletivas4,5. Considerando que a força inerentemente baixa dessas ligações intermoleculares transitórias permite rearranjo sub-unidade e correção de erros, as estruturas resultantes são muitas vezes suscetíveis à degradação térmica e mecânica6. Em contrapartida, interações covalentes dinâmicas7,8,9, uma classe de reações covalentes que são reversíveis ou reorganizáveis em condições leves e recentemente foram empregadas para produzir macromoléculas intrincadas como escadas10,11,12,13, gaiolas14,15,16, e pilhas17, oferecem aumento dos pontos fortes de vínculo e estruturas robustas. Infelizmente, a capacidade de rearranjo e verificação de erros é diminuída pelas taxas relativamente baixas de rearranjo dessas espécies covalentes, reduzindo sua capacidade de automontagem em produtos desejados18. Para lidar com esta armadilha cinética, catalisadores ou condições de reação severas são frequentemente utilizados em conjunto com simples blocos de construção. Aqui, relatamos um processo que contorna a armadilha cinética para permitir a automontagem de escadas moleculares de oligômeros específicos de sequência onde a hibridização é direcionada pelas informações codificadas nas sequências de resíduos oligomeros.

Dada a sua acessibilidade sintética, poli (n-substituiu glicina)s (ou seja, peptoides) são empregados como os precursores oligoméricos dos quais as escadas moleculares são montadas19. Peptoides são isôndeiros estruturais de peptídeos em que grupos pendentes são afixados ao nitrogênio suportado pela espinha dorsal em vez de serem acoplados com o α-carbono20. Usando a síntese em fase sólida, a colocação exata de grupos de pingente covalente dinâmicos ao longo da cadeia peptoide é prontamente alcançada, permitindo o design de oligômeros precursores que podem se reunir em estruturas supramoleculares complexas21.

O rearranjo dinâmico covalente da conectividade imine é empregado neste procedimento, pois a reação de condensação geradora de imine fornece um meio conveniente para caracterizar a automontagem por espectrometria de massa à medida que cada vínculo formado resulta em uma redução em massa de 18 g/mol22. Além disso, o equilíbrio entre os reagentes de amina e aldeído e o produto imine pode ser variado alterando a concentração de ácido. Especificamente, triflates metálicos de terra rara são usados para afetar o equilíbrio, e além de desproteger aldeídos protegidos por acetileno23,24,25. Para notar, o triflate de scandium já é comumente utilizado no campo da auto-montagem covalente dinâmica, incluindo seu recente sucesso em auxiliar na síntese de estruturas orgânicas covalentes (COFs) à temperatura ambiente26,27. Além disso, a solubilidade contrastante das sequências de oligo (peptoide) e do triflate metálico de rara terra permite o controle de equilíbrio através da extração líquido-líquido. O processo relatado utiliza esse controle para contornar as barreiras cinéticas que impedem a automontagem dirigida pela informação.

Protocol

ATENÇÃO: Vários produtos químicos utilizados neste protocolo são corrosivos, inflamáveis ou tóxicos e só devem ser usados uma capa de fume química. Use equipamentos de proteção individual adequados e consulte todas as folhas de dados de segurança (SDS) relevantes antes do uso.

1. Síntese monomer

NOTA: As aminas primárias foram sintetizadas de acordo com abordagens publicadas.

  1. Síntese de 4-(2-aminoetill)-N-(allylcarbonyloxy)phenylamina (Npam)25,28
    1. Adicione 5,0 g (36,7 mmol) de 4-(2-aminoetill)anilina a 150 mL de ácido 10% acetic (solução aquosa, v/v).
      NOTA: O uso de ácido fraco permite proteção seletiva da amina aromática sem afetar a amina alifática devido à grande diferença de pKum valor entre os dois grupos.
    2. Prepare uma solução de 4,9 g (40,4 mmol; 1,1 equiv.) cloroforfore aliado em 150 mL de 1,4 dioxano.
    3. Combine as soluções em um frasco inferior redondo de 500 mL equipado com uma barra de agitação magnética e mexa a mistura de reação à temperatura ambiente durante a noite.
    4. Para trabalhar a reação, dilua com 500 mL de água desionizada (DI) e lave com éter diethyl (Et2O, 300 mL × 3). Descarte as frações orgânicas.
    5. Ajuste a fase aquosa ao pH 14 adicionando 2 M NaOH (solução aquosa) e extrato com Et2O (150 mL × 3).
    6. Misture as frações orgânicas e lave com água DI (150 mL × 3).
    7. Seque sobre naNa 2SO4,depois filtre.
    8. Evaporar para secar pressão reduzida.
    9. Confirme a identidade do produto isolado, Npam,por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RM). Espere os seguintes resultados: 1H NMR (500 MHz, CdCl3) δ: 7.31 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar), 7,14 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar), 6,65 (s, 1H, -N H- ), 6,04 – 5,89 (m, 1H, C H =CH 2), 5,36 (dq, dq,dq,dq, 5.36 (dq, dq, dq, dq, dq, dq, dq, dq, dq, dq, 5.36 (dq, dq, dq, dq, dq, dq, 6,04 – 5,89 (m, 1H, CH=CH 2), 5,36 (dq, dq, dq, dq, 6,04 – 5,89 (m, 1H, C H =CH2),5,36 (dq, dq, dq, dq, dq, dq, dq, dq, dq, J = 17,1, 1,6 Hz, 1H, -CH=CHH), 5,26 (dq, J = 10,5, 1,4 Hz, 1H, -CH=CHH),4,66 (dt, J = 5,8, 1,5 Hz, 2H, -CH2-CH=CH2),2,94 (t, J = 6,8 Hz, 2H,-H 2-NH2), 2,70 (t, J = 6,8 Hz, 2H, -CH2-Ar), 1,04 (s, 2H, -CH2-NH2). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 154.85, 137,00, 134,98, 133,51, 129.36, 119,41, 116,92, 65,62, 59,89, 43.47, 38,72.
      NOTA: O produto é um sólido amarelo claro e tem um rendimento global de 69%. Use o produto sem maior purificação.
  2. Síntese de 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzonitrile29,30
    1. Dissolva 25 g (0,19 mol) de 4-ciaanobenzaldeído em 200 mL de tolueno.
    2. Adicione 42,2 mL (0,768 mmol; 4 equiv.) de etileno glicol e 0,02 g (0,1 mmol; 0,05 mol%) detolueno- p-ácido sulfonico para a mistura de reação.
    3. Mexa e refluxo durante a noite a 120 °C usando uma armadilha Dean-Stark (ou seja, destilação azeotrópica) para remover a água gerada durante a reação.
    4. Depois que a reação estiver completa e resfriada à temperatura ambiente, adicione 40 mL de 5% na solução aquosa naHCO3 (w/v).
    5. Extrair a camada orgânica e lavar com água DI três vezes.
    6. Seque sobre naNa 2SO4,depois filtre.
    7. Evaporar para secar pressão reduzida.
    8. Confirme a identidade do produto isolado, por espectroscopia nmr. Espere os seguintes resultados: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7,67 (d, J = 8.0, 2H, Ar), 7,59 (d, J = 8,4, 2H, Ar), 5,84 (s, 1H, CH), 4.12 - 4.03 (AAaibb, 4H, (CH2O)2). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 143.20, 132.34, 127.30, 118,72, 113.02, 102,56, 65,57.
      NOTA: O produto é um sólido cristalino branco e tem um rendimento global de 86%. Use o produto sem maior purificação.
  3. Síntese de 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzylamina (Npal)29
    1. Prepare uma solução de 10 g (0,057 mol) de 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzonitrile em 100 mL de anidro Et2O.
    2. Adicione cuidadosamente 4,3 g (0,11 mol; 2 equiv.) de LiAlH4 a 100 mL de anidro Et2O em um frasco inferior redondo a 0 °C. Mexa para criar uma suspensão bem misturada e selar o sistema uma atmosfera inerte usando um balão cheio de argônio. Sacia cuidadosamente com etanol qualquer LiAlH4 residual em equipamentos utilizados para pesagem.
      ATENÇÃO: Hidreto de alumínio de lítio (LiAlH4) é um piróforo leve; lidar gás inerte e proteger da umidade.
    3. Adicione lentamente a solução benzonitrila 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)lentamente usando um funil de adição ou uma bomba de seringa, mantendo a mistura de reação a uma temperatura de 0 °C.
    4. Mexa a mistura de reação por 4h a 0°C, seguido com 12h de temperatura ambiente.
    5. Após a reação ser completa e resfriada a 0 °C, adicione lentamente 95% de etanol (30 mL). Mais saciando adicionando 50% de etanol em água (v/v, 20 mL). Um bolhador pode ser usado para monitorar o processo de extinção.
      NOTA: Adicione o Anidro Adicional Et2O conforme necessário para manter uma taxa de agitação adequada.
    6. Separe o supernatante éter e evaporar até a secura pressão reduzida.
    7. Filtre o óleo resultante através de um filtro de seringa de 0,45 μm.
    8. Confirme a identidade do produto isolado, NpaI,por espectroscopia nmr. Espere os seguintes resultados: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.44 (d, J = 8, 2H, Ar), 7,32 (d, J = 8, 2H, Ar), 5,80 (s, 1H, CH), 4.14 - 4.0 (Aaaibb, 4H, (CH2O)2),3,87 (s, 2H, -CH2-NH 2). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 144.53, 136,53, 127.16, 126,77, 103.72, 65,39, 46,35.
      NOTA: O produto é um óleo amarelo e tem um rendimento global de 70%. Use o produto sem maior purificação.
  4. Síntese de 2-(2-etoxyethoxy)etilato29,31
    1. Adicione 20 g (0,15 mol) de eter monoetileno glicol de dietile e 50 mL de tetrahidrofurano (THF) a um frasco inferior redondo de 250 mL com um agitador magnético.
    2. Esfrie a 0°C e seque o sistema uma atmosfera inerte usando um balão cheio de argônio.
    3. Adicione 50 mL de 6 M aquosos NaOH (2 equiv.).
    4. Dissolva 54 g (0,28 mol; 2 equiv.) de cloreto de tosyl em 80 mL de THF e adicione a solução à mistura de reação dropwise. Mexa por 1h a 0°C.
    5. Deixe a mistura de reação atingir a temperatura ambiente e mexa por mais uma hora.
    6. Extrair a mistura de reação com Et2O (400 mL).
    7. Lave a camada orgânica com 1 M NaOH, depois com água DI.
    8. Seque sobre naNa 2SO4,depois filtre.
    9. Evaporar para secar pressão reduzida.
    10. Confirme a identidade do produto isolado pela espectroscopia nmr. Espere os seguintes resultados: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.78 (d, J = 8.0, 2H, -S-C=CH-CH),7,33 (d, J = 8,5, 2H, -S-C=CH-CH),4.15 (t, J = 5.0, 2H, -CH2-CH2-O-Ts), 3,68 (t, J = 5.0, 2H, CH2-CH2-O-Ts), 3.60-3.42 (m, 6H, O-CH2-CH2-O-CH2-CH3), 2.43 (s, 3H, C-CH3), 1,17 (t, J = 7.0, 3H, O-CH2-CH3). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 144.79, 132,95, 130.26, 129.80, 127.90, 126,95, 70,75, 69,68, 69,29, 68.61, 66,57, 21.56, 15.11.
      NOTA: O produto é um líquido incolor e tem um rendimento global de 98%. Use o produto sem maior purificação.
  5. Síntese de 2-(2-etoxyethoxy)etila29,31
    1. Dissolva 40 g (0,14 mol) de 2-(2-etoxyethoxy)tosylate em 250 mL de dimetilformaida (DMF) em um frasco inferior redondo com um agitador magnético. Selar o sistema uma atmosfera inerte usando um balão cheio de argônio.
    2. Adicione 32 g (0,49 mol; 3,5 equiv.) de NaN3 à mistura de reação.
      ATENÇÃO: Não use uma espátula metálica ao pesar na NNa3. O NaN3 pode reagir com chumbo e cobre, o que resulta na formação de azidas metálicas altamente explosivas. É agudamente tóxico e fatal se engolido ou em contato com a pele.
    3. Aqueça a mistura de reação a 60 °C e deixe-a correr por 36 h. Então esfrie a temperatura ambiente.
    4. Diluir com grande quantidade de água (500 mL) e extrair com Et2O (150 mL × 3).
    5. Isole a camada orgânica e realize lava-louças.
    6. Seque sobre naNa 2SO4,depois filtre.
    7. Evaporar para secar pressão reduzida.
    8. Confirme a identidade do produto isolado pela espectroscopia nmr. Espere os seguintes resultados: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.64 (m, 4H, O-CH2-CH2-O), 3.58 (m, 2H, N3-CH2-CH2-O), 3,51 (q, J = 7,5, 2H, O-CH2-CH3), 3,38 (t, J = 5.0, 2H, N3-CH2-CH2-O), 1,19 (t, J = 7,5, 3H, O-CH2-CH3). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 70,70, 69,97, 69,80, 66,63, 50,60, 15,08.
      NOTA: O produto é um líquido amarelo e tem um rendimento global de 85%. Use o produto sem maior purificação.
  6. Síntese de 2-(2-etoxyetoxy)etilamina (Neee)29,31
    1. Dissolva 20 g (0,13 mol) de 2-(2-etoxyethoxy)azida etila em 160 mL de THF em um frasco inferior redondo de 500 mL com um agitador magnético.
    2. Adicione 40 g (0,15 mol, 1.1 equiv.) de tripéxifina e mexa durante a noite à temperatura ambiente argônio.
    3. Saqueie a mistura de reação com água (220 mL) e deixe que ela mexa por mais um dia.
    4. Lave a solução resultante com tolueno, seguido de diclorometano (DCM).
    5. Evaporar a camada aquosa vácuo.
    6. Confirme a identidade do produto isolado, Neee,por espectroscopia nmr. Espere os seguintes resultados: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.62-3.42 (m, 8H, NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3), 2,82 (m, 2H, NH2-CH2-CH2-O), 1,48 (s, 2H, NH2),1,16 (t, J = 7,5, 3H, O-CH2-CH3). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 73.14, 70.72, 69.64, 66.45, 41.35, 15,00.
      NOTA: O produto é um líquido amarelo e tem um rendimento global de 58%. Use o produto sem maior purificação.

2. Síntese submonomera em fase sólida de oligo (peptoides)

NOTA: A abordagem submonomera para a síntese em fase sólida (SPS) foi empregada, pois permite a produção de oligômeros específicos de sequência com alta eficiência de acoplamento. Um sintetizador peptídeo automatizado foi adaptado para gerar rapidamente oligo (peptoides). As configurações podem exigir modificação para diferentes instrumentações.

  1. Preparação
    1. Pesar 0,125 g de resina Fmoc-Photolabile SS (carregamento típico de 0,8 mmol/g, escala de 0,1 mmol, malha 100-200, 1% DVB) e adicionar a um vaso de reação sintetizador automatizado fritizado. Insira o vaso na porção de micro-ondas do sintetizador.
    2. Encha a garrafa principal de solvente com DMF e a garrafa de deproteção com 20% 4-metilpiperidina em DMF (v/v). Lixo vazio.
    3. Prepare 1 M soluções de ácido bromoáceo e N,N'-diisopropipropimidimidde (DIC) em DMF com volumes totais de 1,5 mL × (número de resíduos em sequência) + 5 mL. O extra de 5 mL garante que nenhum ar entre na máquina. Adicione 0,47 mL de anidrida ástica à DMF para fazer uma solução de tampa de 5 mL.
      ATENÇÃO: Dic pode causar sérios danos nos olhos, irritação da pele e sensibilização, e irritação respiratória e sensibilização.
    4. Prepare soluções de 0,5 M de cada amina primária (Npam, Npal, Neee e Nma (2-metoxyethylamina)) em N-metil-2-pirrolido (NMP) usado para a etapa de deslocamento. Os volumes totais das principais soluções de amina devem ser de 2,5 mL × (número de resíduos da amina primária apropriada) + 2,5 mL.
    5. Adicione todas as soluções ao sintetizador automatizado.
  2. Síntese
    NOTA: Execute usando um sintetizador peptídeo automatizado.
    1. Inchar a resina em temperatura ambiente por 5 min com 10 mL de DMF. Drene o vaso de reação.
    2. Cleave o grupo Fmoc com 3 mL da solução 20% 4-metilpiperidina para 30 s a 75 °C e 90 s a 90 °C. Escorra o vaso. Repetir. Lave com DMF (2 mL × 2).
    3. Adicione à embarcação 1,5 mL da solução de ácido bromoáceo e 1,5 mL da solução DIC. Aqueça a reação em 75 °C por 4,5 min para realizar a reação de bromoacetilação. Lave a resina (5 mL de DMF × 3).
    4. Realize a reação de deslocamento por adição de solução de monômero de amina primária de 2,5 mL ao vaso de reação. Aqueça a 75 °C por 4,5 min. Lave resina (5 mL de DMF × 3).
    5. Repita os passos 2.2.3. e 2.2.4. enquanto substituio sequencialmente o monomer de amina primária usado na etapa 2.2.4. para crescer cadeia de oligo (peptoide) de uma maneira específica de sequência.
    6. Após a etapa final de deslocamento, tampe a sequência adicionando 2,5 mL da solução de anidrito acético e 2 mL da solução DIC. Aqueça a 50 °C por 2 min. Lave a resina (5 mL de DMF × 6).
    7. Transfira a resina para um vaso de reação de vidro frited equipado com um paragalo de 3 vias. O vaso de reação de vidro deve ser previamente siliconado para evitar que as contas aderem às paredes. Silanize as paredes enchendo o navio com uma diclorometilsilane de 5% em solução de dicloroetileno (DCE) (v/v) para o topo e deixando-o sentar por 30 min. Escorra o vaso e lave com DCE e metanol. Vaso de vidro seco antes de usar.
    8. Lave a resina com DCM (5 mL × 3), borbulhando com N2 através de um braço e puxando o vácuo com outro.
    9. Resina seca e armazenae e oligo anexado (peptoide) até desproteção e decote.
  3. Desproteção e decote de aloc-amina
    1. Se a resina tiver sido armazenada por mais de um dia, reine a resina borbulhando com 5 mL de DMF por 10 min. Em seguida, escorra o vaso e adicione uma pequena barra de agitação magnética.
    2. Adicione 3 mL de DCM seco ao vaso peptídeo de vidro.
    3. Pesar 0,1 equivalentes de tetrakis (triphenylphosphine)palladium(0) e 25 equivalentes de fenilsilane por grupo Alloc. Use um grampo para posicionar o vaso de reação em um ângulo acima de uma placa de agitação de modo que a resina sofre de agitação suave enquanto permanece suspensa no solvente. Para evitar que o DCM evapore, tampe o vaso de reação.
    4. Depois de 1h, filtre a solução e lave a resina com DCM (3 × 5 mL).
    5. Repita os passos 2.3.2. e 2.3.3.
    6. Enxágüe a resina sequencialmente com metanol e DCM duas vezes.
    7. Transfira a barra de resina e a agitação magnética para um frasco de 20 mL.
    8. Submerga a resina em DMF, mexa e cleave irradiação por 36 h a aproximadamente 25 mW.cm-2 com 405 nm. Uma pequena porção de resina pode ser cleaved e caracterizada no ESI-MS antes desta etapa para garantir a completa desproteção alloc de amina. Se algum grupo Alloc permanecer, repita as etapas 2.3.2 e 2.3.3.
    9. Oligo (peptoide) separado da resina através de um filtro de seringa. Remova solvente vácuo.
  4. Purificação e caracterização de oligo (peptoides)
    1. Reconstitua os peptoides em uma mistura 50/50 de água/aceonitrila.
    2. Purificar com fase inversa preparação HPLC (C18). Combine frações purificadas, congele e liofilize para produzir pó off-white. O pó pode ser armazenado para uso adicional.
    3. Analise com o ESI-MS após a purificação.
    4. Realizar espectrometria de massa MALDI no modo íon positivo do refletor. Misture 2 μL de uma solução da amostra (1 mM) com 6 μL de uma mistura de 10 mg de matriz [2-(4-hidroxifenylazo)ácido benzofico (HABA)] em 200 μL de acetoonrila. Localize em uma placa de amostra MALDI e deixe secar o ar.
    5. Para a pureza, realize o HPLC analítico de oligo purificado (peptoides).

3. Seqüenciação de escada auto-montagem

  1. Auto-montagem através da dissociação/extração/annealing
    1. Prepare soluções de estoque de 10 mM de cada sequência de oligo (peptoide) usada para auto-montagem e uma solução de estoque de 10 mM de triflate scandium (Sc (OTf)3) em anidro aceonitrile.
    2. Para um frasco de 3 mL equipado com uma barra de agitação magnética, adicione 20 μL de cada solução de estoque peptoide. Adicione 1,5 eq de Sc (OTf)3 por potencial título de imina da solução de ações. Adicione água e acetoonitrila suficientes para formar um total de 200 μL 2% (v/v) de solução de água/acetoonitrila.
    3. Mexa suavemente a 70 °C por 2 h para desproteção acetal do aldeído e dissociação de todos os fios.
    4. Carregue o frasco com 200 μL de clorofórmio e 2 mL de água. Agite suavemente.
    5. Deixe a mistura ficar em pé (pelo menos 15 min) e, após a separação completa da fase, extrair a camada orgânica com uma seringa de microlitro.
    6. Misture um novo frasco a 70 °C para oligomer annealing, normalmente 6 h. A hibridização da escada também pode ser realizada à temperatura ambiente, mas durante um período mais longo.
  2. Caracterização de espécies auto-montadas
    1. Realize a espectrometria de massa MALDI-TOF nas soluções de mistura de reação após as etapas 3.1.3., 3.1.5.e 3.1.6. para monitorar a reação. Se a hibridização estiver incompleta, adicione 1,5 eq de Sc (OTf)3 por potencial ligação imine da solução de estoque e repita as etapas 3.1.3-3.1.6. até completar.
    2. Seque a amostra um fluxo constante de nitrogênio e reconstitua em 1 mL de 2% de ácido nítrico (solução aquosa, v/v). Diluir 4 × 106-dobracom água HPLC. Determine a concentração de escândio pós-extração com espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS).

Representative Results

Para demonstrar a capacidade dos peptoides codificados por informações de se submeterem à auto-montagem covalente dinâmica sequencial em escadas moleculares, uma vertente representativa, H2N-N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma, foi sintetizada e hibrificada com sua sequência complementar peptoide. Os monômeros Npam e Npal (caracterizados por 1H NMR (500 MHz), Figura 1) foram empregados como pares reagentes covalentes dinâmicos com Neee auxiliando a solubilidade dos produtos auto-montados finais. Além disso, a incorporação do monomer Nma disponível comercialmente permite uma diferenciação em massa entre as duas sequências complementares. Após a conclusão da síntese submonomera em fase sólida, o grupo Alloc foi removido com PD (PPh3)4. Antes e após a desproteção, partes da resina foram acopladas luz de 405 nm e caracterizadas pelo ESI-MS (Figura 2). A sequência foi purificada pela prep HPLC, liofilizada para alcançar um pó off-white, e pureza confirmada com HPLC analítico (Figura 3). The oligo(peptoid) was subsequently hybridized with its complementary sequence, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal, to afford an in-registry ladder confirmed by MALDI-MS (Figure 4).

Figure 1
Figura 1: Esquemas sintéticos monomer e 1espectro h-NMR. (A) Esquemas sintéticos monomercom reagentes e condições: (i) cloroforme aliado, ácido acético 10% aquoso, 1,4 dioxano, temperatura ambiente, durante a noite; (ii) glicol de etileno, ácido tolueno-p-sulfonic, tolueno, refluxo, durante a noite; (iii) LiAlH4, anidro Et2O, 0 °C para 4 h e temperatura ambiente por 12 h; (iv) cloreto de tosyl, THF, 0 °C; vNaN3, DMF, 60 °C, 36 h; (vi) triphenylphosphine, THF, durante a noite. (B) Espectro de Monômero 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): (i) 4-(2-aminoethyl)-N-(allylcarbonyloxy)phenylamine (Npam); (ii) 4-(1,3-dioxacyclopent-2-yl)benzylamina (Npal); (iii) 2-(2-etoxyetoxy)etilamina (Neee). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Síntese e desproteção de um oligo específico de sequência (peptoide). (A) Estruturas de H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma antes e depois da remoção do grupo protetor do Alloc com espectro de massa ESI (B) acompanhante. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Purificação e caracterização de um peptoide codificado por informações. (A) Cromromatograma HPLC da purificação da cadeia por preparado hplc com gradiente linear de aceonitrila (MeCN) e água: (1) 30% MeCN, 0,1-2,1 min; (2) 30-95% MeCN, 2,1-16,1 min; (3) 95% MeCN, 16,1-23,1 min; (4) 95% MeCN, 23,1-26,1 min. Picos i e ii correspondem a subprodutos de reação de baixo peso molecular, principalmente DIC-urea e espécies oligoméricas, incluindo o produto desejado, respectivamente. (B) Cromromatograma analítico hplc e (C) espectro de massa ESI de H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma após a liofilização. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Auto-montagem de H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma e sua sequência complementar, H2N-N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal. (A) Estruturas das duas sequências e o conjunto resultante de sequências. (B) Espectro de massa MALDI da escada molecular seguindo a temperatura ambiente durante a noite. Missas: esperada [M+Na]+ = 3306,7, encontrada 3306,0; esperado [M-1 imine+Na]+ = 3324,7, encontrado 3323,9; esperado [M-2 imine +Na]+ = 3342,7, encontrado 3342,8; esperado [M-2 imine +CH3OH+H]+ = 3352,8, encontrado 3352,0. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Discussion

A técnica descreve a dinâmica montagem covalente de oligômeros peptoides de rolamento de informações, onde as informações são codificadas na sequência de seus grupos pendentes. O uso de um monomer de amina protegido pelo Alloc em conjunto com um momero aldeído protegido por acetileno permite a desproteção ortogonal, permitindo a desproteção e alásia alloc em situ durante a reação de auto-montagem, garantindo assim que as sequências sintetizadas não reajam prematuramente antes da purificação e caracterização oligomer. É importante ressaltar que a síntese em fase sólida é realizada usando uma resina fotolabile para permitir o decote oligomer do bead irradiação de luz UV ou violeta, impedindo a desproteção prematura do grupo de proteção acetal ácido-labile etileno. Vários esquemas alternativos de desproteção podem ser considerados. Por exemplo, inicialmente empregamos grupos de proteção de ácido-ácido duplo (Boc-amina e acetal-aldeído de etileno) com a intenção de in situ deproteção por um ácido forte seguido de neutralização para permitir que a reação de auto-montagem prossiga; no entanto, essa abordagem resultou na geração imediata de precipitação após a adição da base. Alternativamente, a proteção da amina com um grupo de proteção fotolabile, 2-(2-nitrofenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), foi imaginada como o aldeído poderia ser seletivamente desprotegido no tratamento com ácido trifluorocético (TFA) antes da purificação. Infelizmente, na fotolise situ do grupo de proteção com luz UV não deu condições de desproteção quantitativa, mesmo na presença de fotosensitizers e após longos períodos de irradiação25. Trimetilsilylethoxycarbonyl (ou seja, Teoc) pode ser empregado como um grupo protetor de amina e está sujeito ao decote sobre o tratamento com triflates metálicos de terra rara; no entanto, a desproteção quantitativa teoc requer carregamentos triflate metálicos de terra rara muito maiores do que o necessário para a desproteção acetal de etileno. Para este protocolo, a Teoc-amines pode ser usada, mas a concentração de ácido de Lewis deve ser ajustada de acordo, pois a desproteção subquantitativa da mina pode ser problemática para estruturas auto-montadas maiores. Grupos funcionais alifáticos foram brevemente considerados, mas a desproteção de aldeídos alifáticos requer condições severas que truncam sequências peptoides32,33.

A incorporação de Neee e Nma como resíduos espaçadores inertes servem para melhorar a solubilidade do oligomer e permitir a marcação em massa fácil dos oligômeros precursores para pagar a identificação pronta das espécies geradas por espectroscopia em massa. Além disso, dada a conformação 'Σ-strand' de peptoides onde segmentos adjacentes da espinha dorsal adotam estados rotacionais opostos para formar um oligômero linear e sem torção34,35,sequências que incorporam resíduos dinâmicos alternados de covalente e espaçador inerte facilita uma estrutura na qual grupos de pingenteres reativos são orientados na mesma direção. Dada a versatilidade do método submonomerso, uma grande e diversificada biblioteca de aminas primárias pode ser empregada para modificar ainda mais os oligômeros peptoides, mas pode exigir ajustes no protocolo para manter alta eficiência de acoplamento.

Enquanto o ligo (peptoides) pode ser sintetizado manualmente em um vaso de reação de vidro19,a automação do processo diminui o tempo para cada adição de resíduos de várias horas para meia hora. Além disso, a automação diminui a quantidade de resíduos de solventes monomers osmômeros e lave, particularmente desejável ao usar monômeros de amina primária que não estão disponíveis comercialmente. Embora o decote alloc dos resíduos protegidos de amina seja uma reação eficiente, a oxidação do paládio pode resultar em desproteção incompleta. Consequentemente, sugere-se testar uma parte da resina e caracterizar a extensão da desproteção com o ESI-MS. Para decotes de teste, 30 min abaixo de 405 nm irradiação libera peptoide suficiente para espectrometria de massa. A desproteção parcial pode ser limitada com o uso de condições anaeróbicas ou repetindo a reação de desproteção.

Considerando que este artigo se concentra em Sc (OTf)3 como um reagente multifunção, outros triflates metálicos de terras raras, como o triflate do ytterbium, têm sido mostrados para mediar com sucesso a montagem dirigida pela informação de escadas moleculares. Notavelmente, Sc (OTf)3 é o mais ácido de Lewis dos triflates metálicos de terras raras; assim, devido à redução da capacidade catalítica oferecida por outros triflates metálicos de terras raras24,36, maiores equivalentes podem ser necessários para efetuar desproteção acetal completa e dissociação de fios. O número de equivalentes necessários pode ser determinado com espectrometria de massa MALDI observando ponto em que os fios se dissociam completamente. A dissociação é fundamental no processo de automontagem e é análoga ao derretimento de fios de ácido nucleico a temperatura elevada. A extração subsequente do catalisador permite a formação e interrupção de pares dinâmicos de covalente impulsionando a montagem de duplexes específicos de sequência. Esse aperto gradual dos fios oligoméricos contorna a armadilha cinética (que, para escadas moleculares, pode produzir espécies fora do registro ou emparelhar incorretamente sequências) experimentadas por outros métodos.

Clorofórmio é um excelente solvente como separação de fase no sistema de ternário clorofórmio/acetonitrile/água usado aqui promove a extração parcial do ácido Lewis sem resultar em precipitação de estruturas auto-montadas37. Além disso, o clorofórmio é um dos poucos solventes que promove a formação de imine, mantendo a solubilidade molecular da escada. Vestígios de duplexes fora do registro e incorretamente emparelhados podem ser observados devido à natureza dinâmica do sistema. Embora este sistema não seja afetado em grande parte por uma pequena variação nas concentrações de triflate metálicode terras raras após a extração, na ocasião, a extração catalisadorina insuficiente gera uma parcela significativa de hibridização incompleta e acoplamentos oligômeros não específicos. Neste caso, geralmente é preferível primeiro redissociar com mais 1,5 equivalentes de catalisador e, em seguida, extrair uma segunda vez em vez de reextrair imediatamente, já que a dissociação completa de fios únicos é vital para o processo. Para montar simultaneamente várias escadas moleculares codificadas por informações únicas, pode ser necessário aumentar a concentração da solução de estoque triflate metálico de terras raras usada para manter equivalentes e volume total de reação.

Embora essas auto-assembléias sejam caracterizadas principalmente pela espectrometria de massa, outras técnicas, incluindo fluorescência de transferência de energia de ressonância (FRET) são possíveis. As limitações incluem quantidade de material necessário, acessibilidade de monômeros e relação sinal-ruído. Técnicas que requerem solventes, como 1H NMR, podem sofrer adicionalmente de insolubilidade de estruturas automontadas. Além disso, as concentrações de triflate metálico de terra rara após a extração podem ser determinadas através de métodos como ICP-MS ou 19F NMR com um padrão interno.

À medida que o progresso em direção ao melhor controle sobre nanoestruturas e materiais macro e supramoleculars prossegue, surge o desafio de projetar e fabricar conjuntos regulares, mas modificáveis. O protocolo descrito neste relatório fornece um caminho para alcançar tais nanoestruturas através de montagens sequenciais através de interações dinâmicas covalentes.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciências Básicas de Energia, o prêmio #DESC0012479. A S.C.L. reconhece o apoio do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, e a A.F.A. reconhece o apoio da Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dioxane Fisher Scientific D1114 Certified ACS
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) Millipore-Sigma 54793 Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5%
4-(2-Aminoethyl)aniline Ontario Chemicals A2076 98%
4-Cyanobenzaldehyde Oakwood Chemical 049317 99%
4-Methylpiperidine TCI America P0445 ≥98.0%
4-Toluenesulfonyl chloride Oakwood Chemical BR1703 99%
50 mL High Performance Centrifuge Tubes VWR International 21008-240 Centrifuge Tubes used for automated synthesizer
Acetic acid Fisher Scientific A38-212 Glacial
Acetic anhydride Fisher Scientific A10 Certified ACS
Acetonitrile Millipore-Sigma 34851 For HPLC; Gradient grade; ≥99.9%
All-plastic Norm-Ject syringes Thermo Fisher Scientific S7510-10 Luer-Slip Syringe
Allyl chloroformate Acros Organics 221741000 97%
Bromoacetic acid Alfa Aesar A14403 ≥98.0%
Chloroform Millipore-Sigma 288306 Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Chloroform-d Acros Organics AC320690075 For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules
Dichlorodimethylsilane Acros Organics 1133100 ≥99.0%
Dichloroethane Fisher Scientific E175 Certified ACS
Dichloromethane Fisher Scientific D37-4 Stabalized; Certified ACS
Diethyl ether Acros Organics 615080010 Anhydrous; ACS reagent
Diethylene glycol monoethyl ether TCI America E0048 ≥99.0%
Ethanol Decon Labs 2701 200 Proof; Anhydrous
Ethylene glycol Fisher Scientific E178 Certified
Fmoc-Photolabile SS resin CreoSalus SA50785 100-200 mesh; 1% DVB
Glass Peptide Vessel Chemglass CG-1866-02 Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread
LC-6AD HPLC pumps Shimadzu Corporation Equipment
LED 405nm ThorLabs M405L2-C1 405 nm LED used for photocleavage of peptoid
LED Driver ThorLabs LEDD1B Driver for LED light used in photocleavage of peptoid
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer CEM Corporation Equipment
Lithium aluminum hydride Millipore-Sigma 199877 Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture
Luna C18 analytical RP-HPLC column Phenomenex 00G-4252-E0 Equipment
Luna C18 prepatory RP-HPLC column Phenomenex 00G-4253-P0-AX Equipment
Methanol Fisher Scientific A412 Certified ACS
Microliter Syringe Hamilton Company 80700 Cemented Needle (N)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Oakwood Chemical M02889 ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization
N,N-Dimethylformamide Millipore-Sigma 319937 ACS reagent; ≥99.8%
Nitric acid Fisher Scientific A200-212 Certified ACS Plus
Nitrogen gas Cryogenic Gases Contents under pressure, may explode if heated
Phenylsilane Oakwood Chemical S13600 97%
Prominence SPD-10A UV/vis Detector Shimadzu Corporation Equipment
p-Toluenesulfonic acid monohydrate Millipore-Sigma 402885 ACS reagent; ≥98.5%
Scandium(III) triflate Oakwood Chemical 009343 99%
Single-use Needle Exel International 26420 18G x 1 1/2″
Sodium azide Oakwood Chemical 094448 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin.
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233 Powder; Certified ACS
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Pellets; Certified ACS
Sodium sulfate Fisher Scientific S421-500 Anhydrous; Granular; Certified ACS
Syringe Filter 0.45 µm VWR International 28145-497 PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing
Tetrahydrofuran Fisher Scientific T397 Certified
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) Oakwood Chemical 034279 98%
Toluene Fisher Scientific T324 Certified ACS
Triphenylphosphine Oakwood Chemical 037818 99%

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