भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को संक्षिप्त करना

Developmental Biology
 

Summary

यह प्रोटोकॉल 30 दिनों के लिए सुसंस्कृत माउस लेट भ्रूण आंतों के ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण की नकल करने का वर्णन करता है।

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Garcia, T. M., Navis, M., Wildenberg, M. E., van Elburg, R. M., Muncan, V. Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (153), e60470, doi:10.3791/60470 (2019).

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Abstract

दूध पिलाने की अवधि के अंत में, कई स्तनधारी प्रजातियों आंतों के एपिथेलियम में बड़े बदलावों से गुजरना पड़ता है जो ठोस भोजन को पचाने की क्षमता से जुड़े होते हैं। इस प्रक्रिया को दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण और परिणाम वयस्क एपिथेलियम के साथ नवजात एपिथेलियम के प्रतिस्थापन में कहा जाता है जो मेटाबोलिक और रूपात्मक समायोजन के साथ हाथ में जाता है। ये जटिल विकासात्मक परिवर्तन एक आनुवंशिक कार्यक्रम का परिणाम हैं जो आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए आंतरिक है, लेकिन कुछ हद तक बाह्य कारकों द्वारा संग्राहक किया जा सकता है। देर से भ्रूण अवधि से माउस प्राथमिक आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं की लंबे समय तक संस्कृति, विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को फिर से तैयार करती है। यहां, हम माउस भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो इस प्रक्रिया को विट्रो में मॉडल करने के लिए सबसे उपयुक्त है। हम समय के साथ दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण से जुड़े आंतों के कार्यों के परिवर्तन की निगरानी के लिए डिज़ाइन किए गए कई उपयोगी परखों का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम एक बाह्य कारक का एक उदाहरण शामिल है जो विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को प्रभावित करने में सक्षम है, जो विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के समय को कम करने के प्रतिनिधित्व के रूप में है। इस इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के आणविक तंत्र ों के साथ-साथ इस प्रक्रिया के मॉड्यूलर का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, अनुसंधान में पशु नैतिकता के संबंध में, इस इन विट्रो मॉडल द्वारा आईएन वीवो मॉडल की जगह पशु प्रयोगों को परिष्कृत करने में योगदान देता है और संभवतः आंत परिपक्वता प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए जानवरों के उपयोग में कमी करने के लिए।

Introduction

चूहों और पुरुषों सहित कई स्तनधारी प्रजातियों में, नवजात आंत में कई विशेषताएं हैं जो पूरी तरह से परिपक्व आंतों के एपिथेलियम से अलग हैं। ये विशेषताएं नवजात आंत्रप्रेन्योर्स को दूध को पचाने और अवशोषित करने की सुविधा प्रदान करती हैं, जिसमें उच्च वसा और कम कार्बोहाइड्रेट होते हैं, जिसमें लैक्टोज प्रमुख कार्बोहाइड्रेट के रूप में होता है। नवजात आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं की ब्रश सीमा दूध को डिसैकराइड लैक्टोज को पचाने के लिए डिसैकराइड्स लैक्टेस-फ्लोरिजिन हाइड्रोलेस (एलसीटी)1 को व्यक्त करती है। दूध पिलाने की अवधि के बाद, आंत्रविज्ञान ठोस भोजन को पचाने के लिए अनुकूल होते हैं जो जटिल कार्बोहाइड्रेट से समृद्ध होते हैं और वसा में कम होते हैं। यह लैक्टेज से लेकर सुक्रैसे-आइसोमालटीज़ (सिस) और ट्रेहलसे (ट्रेह) तक ब्रश सीमा असक्धारी अभिव्यक्ति में एक स्विच द्वारा प्रकट होता है, जो ठोस भोजन2में मौजूद अधिक जटिल कार्बोहाइड्रेट को पचा सकता है। एक और मेटाबॉलिक स्विच दूध में आर्जिनिन की कम एकाग्रता से संबंधित है। आर्जिनिन की आवश्यकता प्रदान करने के लिए, नवजात आंत्रप्रेन्योट्स आर्जिनिन बायोसिंथेसिस, आर्गिनोक्सिनेट सिंथासे-1 (Ass1) में दर सीमित एंजाइम को व्यक्त करते हैं, आर्गिनाइन3का संश्लेषण करने के लिए। इसके विपरीत, वयस्क आंत्रप्रेन्योट्स आर्गिनेस 2 (एआरजी2) को व्यक्त करते हैं, जो एक एंजाइम जो आर्जिनिन को कैटाबोलकरने में सक्षम है जो ठोस खाद्य पदार्थों में प्रचुर मात्रा में है। इसके अलावा, नवजात आंतों के एपिथेलियम इम्यूनोग्लोबुलिन (एफसीआरएन) के लिए नवजात एफसी रिसेप्टर को व्यक्त करता है, जो दूध से मातृ आईजीजी के अवशोषण को परिसंचरण/रक्त प्रवाह4में मध्यस्थता करता है । एफसीआरएन की अभिव्यक्ति दूध पिलाने के लिए प्रातः संक्रमण5के दौरान काफी गिरावट आती है । चूहों में, पनेथ कोशिकाओं की परिपक्वता पोस्टटल ली जाती है, संयोग से क्रिप्टोप्स के गठन और परिपक्वता के साथ, और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स लिसोसोम (लायज़) और डिफेन्सिन6की अभिव्यक्ति की विशेषता है।

ये सभी परिवर्तन दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण का हिस्सा हैं, जो चूहों में एक महीने की उम्र तक जन्म के बाद धीरे-धीरे होने वाली एक प्रक्रिया है, जब आंतों का एपिथेलियम अपने परिपक्व वयस्क राज्य तक पहुंचता है। दूध पिलाने के लिए प्रातः संक्रमण आंतरिक रूप से विनियमित और विकास आंत ट्यूब में सेट है । ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बी लिम्फोसाइट-प्रेरित परिपक्वता प्रोटीन-1 (ब्लींप-1) इस आंतरिक परिपक्वता प्रक्रिया7में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । ब्लींप-1 नवजात एपिथेलियम में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, जबकि इसकी अभिव्यक्ति कम हो जाती है और दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के दौरान खो जाती है और इसलिए नवजात आंतों के एपिथेलियम के विश्वसनीय मार्कर के रूप में काम कर सकती है। एक आंतरिक प्रक्रिया होने के बावजूद, दूध पिलाने के लिए प्रातः संक्रमण बाहरी कारकों द्वारा संग्राहक किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कोर्टिसोल, डेक्सेस्टेथासोन के सिंथेटिक एनालॉग को वीवो8,9में आंत परिपक्वता में तेजी लाने के लिए जाना जाता है।

वर्तमान इन विट्रो मॉडल दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण सहित आंतों के एपिथेलियल परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, वयस्क एपिथेलियल सेल लाइनों और/या वयस्क ऑर्गेनॉइड का उपयोग करता है जो वयस्क आंतों के विशेषण की विशेषताओं को सहन करते हैं । हमने हाल ही में दिखा दिया है कि प्राथमिक आंतों के एपिथेलियल कोशिकाएं देर से भ्रूण आंत परिपक्व से अलग होती हैं और ऑर्गेनोइड10के रूप में विट्रो में बढ़ने पर दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को फिर से तैयार करती हैं। हमने आगे दिखाया कि विट्रो में यह आंत परिपक्वता प्रक्रिया वीवो की तरह ही गति से होती है । अंत में, हमने वीवो अध्ययनों में वर्णित समान फैशन में परिपक्वता प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए डेक्सेथेथासोन का उपयोग किया।

यहां, हम माउस देर से भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड के अलगाव और संस्कृति के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। हम विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण की निगरानी करने के लिए लंबे समय तक ऑर्गेनॉइड संस्कृति और तरीकों के लिए नमूने एकत्र करने के पसंदीदा तरीके का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग आंतों के एपिथेलियाल परिपक्वता और इस प्रक्रिया के मॉड्यूलर के इन विट्रो अध्ययनों के लिए किया जा सकता है और परिणामस्वरूप डेटा की गुणवत्ता और अनुवादमूल्य में वृद्धि होती है और पशु उपयोग में कमी आती है।

Protocol

यह अध्ययन वैज्ञानिक प्रयोजनों (ALC312) के लिए पशुओं के उपयोग के लिए यूरोपीय निर्देश 2010/63/EU के बाद पशु अनुसंधान पर राष्ट्रीय कानून के पूर्ण अनुपालन में एम्स्टर्डम विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग के लिए नीति समिति द्वारा स्थापित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था ।

1. भ्रूण छोटे आंतों के ऑर्गनॉइड का अलगाव

  1. अनुमोदित नैतिक नियमों के अनुसार, सर्जिकल कैंची के साथ डेपुटेशन द्वारा E18-E20 भ्रूण का बलिदान करें ।
  2. इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, ध्यान से आंतों की कैंची के साथ भ्रूण के निचले पेट को खोलें और पूरी आंत को हटा दें।
    नोट: अलगाव E18 और गर्भ के E20 के बीच आंतों के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए ताकि उचित दूध पिलाने के लिए प्रातः संक्रमण और विट्रो में परिपक्वता प्राप्त करने के लिए ।
  3. दो छोटे संदंश के साथ, आंत को फैलाते हैं। गाइड के रूप में पेट और परिशिष्ट का उपयोग करके, छोटी आंत के समीपस्थ और डिस्टल हिस्से को अलग करें।
    नोट: यदि विच्छेदन सावधानी से किया जाता है, तो पेट को भी अलग करना संभव है। गाइड(चित्रा 1)के रूप में परिशिष्ट का उपयोग करके इसे अलग करें।
  4. आंत को देशभर खोलें: आंत को लंबाई में रखे रेजर ब्लेड का उपयोग करके ठीक करें और रेजर ब्लेड के साथ संदंश (रेजर ब्लेड के प्रत्येक तरफ संदंश का एक हाथ) फिसलने से आंत को खींचें। बाद में, खोला आंत 1 सेमी टुकड़ों में काट लें।
  5. बर्फ ठंडफॉचेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के 10 मिलील के साथ दो 50 मिलीआर ट्यूब तैयार करें। छोटी आंत के समीपस्थ और डिस्टल हिस्से (और यदि लागू हो तो कोलन) को ट्यूबों में अलग से स्थानांतरित करें। अतिरिक्त चूहों की आंतों को विच्छेदन करते समय बर्फ पर ट्यूब रखें। एक ही ट्यूब में एक कूड़े के सभी आंतों के हिस्सों को एक साथ लीजिए।
    नोट: एक कूड़े में आमतौर पर 6-10 भ्रूण होते हैं। सभी भ्रूण ों की आंतों को संयुक्त किया जाना चाहिए। यह राशि ऑर्गेनॉइड के साथ 4-8 कुओं की उपज के लिए पर्याप्त होनी चाहिए, 48-अच्छी प्लेट में, प्रति आंतों के हिस्से में।
  6. ऑर्गेनोइड आइसोलेशन के साथ आगे बढ़ें जैसा कि पहलेवर्णित 11था । संक्षेप में, बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ आंतों के टुकड़ों को धोएं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2 एमएम एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड (EDTA) के साथ इनक्यूबेट, बर्फ ठंडे पीबीएस + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ टुकड़ों को कठोरता से धोकर ऊतक से तहखाने को अलग करके, 70 माइक्रोमीटर सेल छलनी और अपकेंद्रित्र का उपयोग करके फिल्टर करें 4 0 0 0 0 0 00 डिग्री के लिए 150 x ग्राम पर तहखाने इकट्ठा करने के लिए।
  7. प्लेट 4 से 8 कुओं को एक गर्म 48-अच्छी प्लेट में पैलेट के आकार के आधार पर एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल में क्रिप्टोप्स के साथ। प्रति अच्छी तरह से एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल में निलंबित तहखाने के 20 μL का उपयोग करें। 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स जेल को जमना दें।
    नोट: यह देखते हुए कि केवल 40% से 50% अलग-थलग क्रिप्टोफॉर्म ऑर्गेनोइड बनाते हैं, प्रति अच्छी तरह से 250 से 300 ऑर्गेनॉइड के घनत्व का लक्ष्य रखते हैं। सबसे पहले जरूरत से कम एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल जोड़ें। पहली अच्छी तरह से प्लैटिंग के बाद माइक्रोस्कोप के नीचे देखो विश्लेषण करने के लिए कि क्या अलग तहखाने का घनत्व आदर्श है । यदि आवश्यक हो, तो अधिक एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल जोड़ें।
  8. इस बीच ईएनआर माध्यम तैयार करें: उन्नत Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम/हैम के एफ-12 (DMEM/F12) 1:1 +++ (4-(2-हाइड्रोक्सेथिल के साथ पूरक)-1-piperazinethanesulfonic एसिड (HEPES) 1x, एल-ग्लूटामाइन 0.01 एम और 0.2U/mL पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन), नोगिन-वातानुकूलित मीडिया के 4 मिलील, आरएसपोइन-वातानुकूलित मीडिया के 2 मिलील, बी 27 सप्लीमेंट 1x के 400 माइक्रोनएल, एन2 सप्लीमेंट 1x का 200 माइक्रोन, 1.25 एमएम एन-एसिटिलसिस्टीन का 50 माइक्रोन, 0.05 माइक्रोन/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) का 20 माइक्रोन।
    नोट: कोलन ऑर्गेनॉइड की खुराक लेते समय, 50% WNt वातानुकूलित मीडिया के साथ पूरक करें।
  9. प्रति अच्छी तरह से एएनआर मीडियम के 250 माइक्रोन जोड़ें।

2. भ्रूण ऑर्गेनॉइड की सत्कार

  1. प्रति सप्ताह 3 बार संस्कृतियों का माध्यम बदलें। संस्कृति के 1 महीने के बाद ऑर्गेनॉइड की परिपक्वता प्राप्त की जाती है।
  2. प्रत्येक मार्ग के बाद 3 दिन में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्फेरॉइड और ऑर्गेनॉइड की संख्या गिनें। प्रति स्थिति कम से कम 3 कुओं और प्रत्येक कुएं में मौजूद सभी ऑर्गनॉइड की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: स्फेरॉइड की संख्या समय के साथ कम हो जाती है, जबकि ऑर्गेनॉइड की संख्या बढ़ जाती है(चित्र ा 2)।
  3. नीचे वर्णित यांत्रिक वियोजन द्वारा सप्ताह में एक बार ऑर्गनॉइड को पारित करें।
    1. मध्यम निकालें और बर्फ के 1 mL-ठंडा उंनत DMEM/F12 1:1 + + + जोड़ें । ऑर्गनॉइड के साथ सभी एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल को 15 mL ट्यूब में ले लीजिए। ऑर्गेनॉइड को बाधित करने के लिए 1000 माइक्रोन फिल्टर टिप के शीर्ष पर 200 माइक्रोन टिप का उपयोग करें और 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 150 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेटेंट को त्यागें और प्रति अच्छी तरह से एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल के 20 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। आमतौर पर, भ्रूण ऑर्गेनॉइड को 1:2 अनुपात में विस्तारित किया जा सकता है।
    3. एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल को 5-10 मीटर के लिए जमना चाहिए। 250 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से ईएनआर मीडियम डालें।

3. आरएनए और प्रोटीन स्तर पर परिपक्वता विश्लेषण

  1. प्रत्येक मार्ग के बाद हर 3 दिनों में संस्कृति का विश्लेषण करें, 1 महीने की अवधि के लिए (यानी, जिस समय में पूर्ण परिपक्वता प्राप्त की जाती है)(चित्रा 3)।
    नोट: भ्रूण ऑर्गेनॉइड संस्कृति गतिशील (मूवी 1) है और यांत्रिक व्यवधान के बाद ऑर्गनॉइड के सामान्य उत्थान से भिन्नता से बचने के लिए, पारित होने के बाद हमेशा एक ही दिन में नमूने एकत्र करना आवश्यक है।
  2. आरएनए अलगाव
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से पूरक के लिए आरएनए लिसिस बफर के 200 μL का उपयोग कर ऑर्गेनॉइड के 3 कुओं को इकट्ठा करें। अच्छी तरह से आरएनए लिसिस बफर + -मर्काप्टोथेनॉल जोड़ने के बाद, सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनोइड के साथ सभी एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल को आरएनसे-फ्री 1.5 mL ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है।
    2. भंवर सख्ती से और 1 महीने से अधिक समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिका स्पिन कॉलम किट का उपयोग करआरएन को अलग करें।
    3. आरएनए गुणवत्ता बढ़ाने के लिए, चरणधोने के बाद 80% EtOH के 500 माइक्रोन जोड़ें और कॉलम को उलटकर धीरे-धीरे मिलाएं। कॉलम को पूरी तरह से सुखाने के लिए 11,000 x ग्राम पर 2 मिन के लिए सेंट्रलाइज करें।
      नोट: ट्यूब के ढक्कन के अंदर को तीन से पांच बार ट्यूब को उल्टा करके 80% EtOH के साथ धोना सुनिश्चित करें ताकि ग्वानिडीन थिओसाइनेट के सभी निशानों से छुटकारा मिल सके।
    4. आरएनए उपज बढ़ाने के लिए, अपकेंद्री से पहले RNase मुक्त पानी लागू करने के बाद 1-2 मिन इंतजार करें । कॉलम में दूसरी बार पहले फ्लो-थ्रू एल्यूट लगाने से री-एलिट आरएनए।
      नोट: अलग आरएनए गुणवत्ता जीनोम-व्यापी अभिव्यक्ति विश्लेषण में उपयोग के लिए पर्याप्त है। जांच करें कि आरएनए अखंडता संख्या 8 से ऊपर है या नहीं।
  3. प्रोटीन अलगाव
    1. एक 15 मीटर ट्यूब में बर्फ-ठंडा सेल वसूली समाधान के 250 μL का उपयोग कर ऑर्गेनॉइड के 5 कुओं को इकट्ठा करें। एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल को भंग करने के लिए बर्फ पर कम से कम 30 मिन के लिए इनक्यूबेट (इससे एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स जेल से प्रोटीन योगदान कम हो जाएगा)।
    2. बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोएं। सेल लिसिस बफर के 250 माइक्रोन जोड़ें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: ध्वनि के बाद, नमूनों का उपयोग एंजाइम गतिविधि का पता लगाने के लिए या पश्चिमी दाग के लिए किया जा सकता है।
  4. इम्यूनोस्टेनिंग
    1. 15 मीटर ट्यूब में बर्फ-ठंडा सेल रिकवरी समाधान के 250 माइक्रोन का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड के 2 कुओं को एकत्र करें। अतिरिक्त मैट्रिक्स जेल को भंग करने के लिए बर्फ पर कम से कम 30 मिन के लिए इनक्यूबेट (यह धुंधला पृष्ठभूमि को कम करेगा)। बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोएं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडेजिडे (पीएफए) के 500 माइक्रोन का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड को ठीक करें। बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोएं। प्रकाशित प्रोटोकॉल12के अनुसार, पूरे ऑर्गेनोइड इम्यूनोफ्लोरेसेंस या पैराफिन एम्बेडिंग के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: ऑर्गनॉइड को संभालने के लिए प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। इससे इसका ढांचा बाधित होने से बच जाएगा।

4. ऑर्गेनोइड परिपक्वता प्रक्रिया पर बाह्य कारक (एक उदाहरण के रूप में dexamethasone) का प्रभाव

  1. संस्कृति के पहले दिन, ऑर्गेनॉइड में 0.01 M dexamethasone जोड़ें। हर बार मीडियम को बदलकर संस्कृति के पूरे महीने के दौरान डिक्सेथसोन के साथ ऑर्गेनॉइड को इनक्यूबेट करें ।
  2. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण
    1. ऊपर वर्णित आरएनए को अलग करना। संश्लेषण, एक ही समय में, सभी नमूनों के सीडीएनए की तुलना की जानी चाहिए (इलाज और अनुपचारित)। पसंदीदा क्यूआरटीपीसीआर विधि के साथ आगे बढ़ें।
    2. भ्रूण ऑर्गेनॉइड पर हर बार एक नए उपचार का उपयोग करने के लिए दो सबसे स्थिर संदर्भ जीन की पहचान करने के लिए GeNorm का उपयोग करें। सापेक्ष अभिव्यक्ति गणना के लिए दो चुने गए संदर्भ जीन के ज्यामितीय मतलब का उपयोग करें।
      नोट: माउस भ्रूण ऑर्गेनॉइड के लिए परीक्षण करने के लिए संदर्भ जीन के सुझाव: साइक्लोफिलिन, गगध, एकैटिन, 36बी4, एचपीआरटी, आरपीएल4, आरपीएल32, पीपीआईबी और टीबीपी।
    3. यह जांचने के लिए कि एक निश्चित बाह्य कारक प्रसवोत्तर माउस भ्रूण परिपक्वता को कैसे प्रभावित करता है, निम्नलिखित सभी जीन का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
      1. जांच करें कि क्या भ्रूण मार्कर लैक्टेस(एलसीटी),आर्जिनोक्सिकेंट सिंथासे 1(Ass1),बी लिम्फोसाइट-प्रेरित परिपक्वता प्रोटीन 1(ब्लींप-1)और नवजात एफसीरिसेप्टर (एफसीआरएन)संस्कृति के पहले दो हफ्तों के दौरान अभिव्यक्ति में कमी और शेष संस्कृति समय(चित्रा 4C)के लिए अनुपस्थित हैं । विश्लेषण करें कि क्या यह पैटर्न बदल गया है।
      2. जांच करें कि क्या वयस्क मार्कर सुक्रैसे-आइसोमालटीज़(सिस),आर्गिनेस 2(Arg2),ट्रेहलेज(ट्रेह)और lysozyme(Lyz)संस्कृति के दो सप्ताह के बाद अभिव्यक्ति में वृद्धि(चित्रा 4D)। विश्लेषण करें कि क्या यह पैटर्न बाहरी कारक द्वारा बदल दिया जाता है।
        नोट: Dexamethasone एक बाहरी कारक है जो भ्रूण ऑर्गेनॉइड की परिपक्वता में तेजी ला सकता है और अन्य बाह्य कारकों का परीक्षण करने के उद्देश्य से सभी प्रयोगों में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. एंजाइम गतिविधि विश्लेषण
    1. ऊपर वर्णित प्रोटीन को अलग-थलग कर दें। डाहलक्विस्ट और मेसर13,14द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार आंतों की असासीसी गतिविधि का पता लगाएं ।
    2. 0.625 एम पुरुष-बफर पीएच 6.0 (4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने के लिए रखें) तैयार करें। इस बफर का उपयोग करके, 0.05 मीटर लैक्टोज तैयार करें (लासोसोमल पी-गैलेक्टोसिदास गतिविधि को बाधित करने के लिए स्टेबलाइजर के रूप में पी-हाइड्रोक्सीमर्क्रेयूरिबेंजोएट सोडियम जोड़ें); 0.05 एम माल्टोज; 0.05 मीटर सुक्रोज और 0.05 मीटर ट्रेहलोज।
      नोट- इन सभी समाधानों को 5 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। परख तैयार करते समय बर्फ पर रखें।
    3. निम्नलिखित सांद्रता के साथ समाधान प्राप्त करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी के साथ 5.56 एम ग्लूकोज समाधान को कमजोर करके परख मानक तैयार करें: 0.125 एम; 0.1 एम; 0.075 मीटर; 0.05 मीटर और 0.025 मीटर
      नोट: समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 महीने के लिए स्थिर।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट में इनक्यूबेट:
      - लैक्टोज के 30μL के साथ ऑर्गेनोइड लिसेट का 30 μL
      - सुक्रोज के 30μL के साथ ऑर्गेनोइड लिसेट का 30 μL
      - माल्टोज के 30 माइक्रोन के साथ दस गुना पतला ऑर्गेनोइड लिसेट का 30 माइक्रोन
      - ट्रेहलसे के 30 माइक्रोन के साथ पांच गुना पतला ऑर्गेनोइड लिसेट का 30 माइक्रोन
      - नमूना पृष्ठभूमि के रूप में, मैलिक एसिड के 30 माइक्रोन के साथ 30 माइक्रोन
      - प्रत्येक ग्लूकोज मानक के 30 माइक्रोन
      - अल्ट्राप्योर पानी का 30 μL, खाली के रूप में
      - सकारात्मक नियंत्रण के 30 μL (कमजोर पड़ने का अनुकूलन; lysed भ्रूण आंतों के ऊतकों लैक्टेस गतिविधि के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि lysed वयस्क आंतों के ऊतकों को सुक्रैज, माल्टेस और तिरालसे के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है)
      नोट: नमूनों को कमजोर करने के लिए सेल लिसिस बफर के साथ किया जाना चाहिए। परख तैयार करते समय नमूने और प्लेट को बर्फ पर रखें।
    5. अपने संबंधित सब्सट्रेट्स के साथ ऊष्मायन के बाद ऑर्गेनॉइड लाइसेट में मौजूद एंजाइमों द्वारा उत्पादित ग्लूकोज की मात्रा निर्धारित करने के लिए, PGO-रंग समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मीटर के लिए हर 5 मिन में 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।
      नोट: PGO-रंग समाधान ताजा बनाओ। पीएच 7.0 पर 0.5मोल/एल ट्रिस-एचसीएल बफर में 10 यू/एमएल ग्लूकोज-ऑक्सीडेस, 2 यू/एमएल पेरोक्सिडेस और 7.88 एममोल/एल ओ-डायनिसिडीन का प्रयोग करें। प्लेट में जोड़े जाने पर समाधान कमरे के तापमान पर होना चाहिए।
    6. ग्लूकोज मानक के अनुसार गतिविधि की गणना करें और प्रोटीन की कुल मात्रा (बिकिनोनिनिक एसिड परख (बीसीए) द्वारा निर्धारित) के लिए सही करें। एंजाइम गतिविधि μM ग्लूकोज/μg प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जानाचाहिए-1 (चित्रा 5B)
      नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आर्गिनेज़ गतिविधि परख किट का उपयोग करके आर्गिनेस गतिविधि को मापें।

Representative Results

भ्रूण आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं की लंबी संस्कृति
विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण की नकल करने का प्रोटोकॉल लंबे समय तक संस्कृति के दौरान भ्रूण ऑर्गेनॉइड की सही हैंडलिंग पर निर्भर करता है। E18-E20 माउस भ्रूण से अलग समीपस्थ और डिस्टल आंत को अलग किया जाता है जैसा कि प्रस्तुत किया जाता है(चित्रा 1)। अलगाव पर, एपिथेलियल कोशिकाओं को बाह्य मैट्रिक्स जेल गुंबदों(चित्र 2)में वरीयता प्राप्त की जाती है। यह आम तौर पर भ्रूण ऑर्गेनॉइड के लिए चार मार्ग और लगभग 28-30 दिनों की संस्कृति लेता है वयस्क राज्य के लिए परिपक्व करने के लिए । इस समय के दौरान, परिपक्वता के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है(चित्रा 3)।

विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण का प्रतिनिधि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण
इस बात की पुष्टि करने के लिए कि अलग-थलग भ्रूण ऑर्गेनॉइड स्पष्ट रूप से समीपस्थ या डिस्टल होते हैं, समीपस्थ मार्कर के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना एक कट डोमेन परिवार के सदस्य 2(वनकट2)और गाटा बाध्यकारी प्रोटीन 4(Gata4)और डिस्टल मार्कर फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन 6(Fabp6)और गुएनलेट साइक्लासे एक्टिवेटर 2A(Guca2a)दोनों समीपस्थ और डिस्टल ऑर्नोइड संस्कृतिओंकेबीच विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण जीन के दो सेटों द्वारा निगरानी की जा सकती है: भ्रूण(चित्रा 4C)और वयस्क मार्कर(चित्रा 4D)। संस्कृति के दौरान भ्रूण मार्कर धीरे-धीरे कम होने चाहिए, जबकि वयस्क मार्कर की अभिव्यक्ति धीरे-धीरे बढ़नी चाहिए(चित्र4सी, डी)।

विट्रो में चूसने-से-छुड़ाने वाले संक्रमण के संशोधक के रूप में बाह्य कारक का उपयोग करना
इस प्रोटोकॉल में एक सिंथेटिक ग्लूकोकॉर्टिकोइड का उपयोग विशिष्ट कारक के उदाहरण के रूप में किया जाता था जो विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को संशोधित करने में सक्षम था। चित्रा 5 में प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है कि बाह्य कारकों के प्रभाव के लिए सबसे अच्छा कर रहे है कई परख द्वारा निर्धारित किया जाना है, क्योंकि वे जरूरी जीनोमिक होना चाहिए नहीं है । उदाहरण के लिए, सूक्रेस-आइसोमाल्टेस के मामले में आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों को डेक्सेथेसोन(चित्रा 5A)के साथ प्रेरित किया जाता है जबकि ट्रेहलसे अभिव्यक्ति केवल प्रोटीन स्तर पर बदल जाती है। (चित्रा 5B)

Figure 1
चित्रा 1: माउस भ्रूण छोटी आंत का अलगाव। (A)पेट, समीपस्थ और डिस्टल छोटी आंत, परिशिष्ट और पेट सहित विच्छेदित और फैला भ्रूण आंत की तस्वीर। काली रेखा इंगित करती है कि समीपस्थ और डिस्टल छोटी आंत को विभाजित करने के लिए आंत को कहां काटा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 3 दिन, दिन 17 और संस्कृति के 28 दिन में समीपस्थ और डिस्टल भ्रूण ऑर्गेनॉइड संस्कृति के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां । सभी छवियों को पारित होने के बाद 3 दिन में प्राप्त किया गया था और स्फेरॉइड ओवरटाइम की संख्या में कमी दिखाते हैं। स्केल बार: 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1: प्रतिनिधि वीडियो दिखा भ्रूण ऑर्गेनोइड संस्कृति गतिशीलता, संस्कृति के 4 से 6 दिन तक । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Figure 3
चित्रा 3: समय के साथ आंत परिपक्वता के विश्लेषण के लिए ऑर्गनॉइड संग्रह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। समीपस्थ और डिस्टल भ्रूण ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को एक महीने के लिए संस्कारित किया जाना चाहिए और हर हफ्ते मार्गित किया जाना चाहिए। परिपक्वता विश्लेषण के लिए नमूने अलगाव के 3 दिन बाद और प्रत्येक मार्ग के बाद हर 3 दिन एकत्र किए जाने चाहिए कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: समीपस्थ और डिस्टल भ्रूण ऑर्गेनॉइड में आंत परिपक्वता मार्कर के प्रतिनिधि qRTPCRs। (A)समीपस्थ मार्कर Onecut2 और Gata4 मुख्य रूप से समीपस्थ ऑर्गेनोइड संस्कृति में व्यक्त किए जाते हैं जबकि(बी)डिस्टल मार्कर फैब6 और गुका2ए ज्यादातर डिस्टल ऑर्गेनॉइड संस्कृति में व्यक्त किए जाते हैं । (ग)भ्रूण मार्कर एलसीटी, Ass1, ब्लींप-1 और एफसीआरएन कमी और(डी)वयस्क मार्कर सिस, Arg2, ट्रेह और Lyz दोनों समीपस्थ और डिस्टल ऑर्गनॉइड संस्कृतियों में समय के साथ वृद्धि । त्रुटि बार एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: बाहरी कारक dexamethasone भ्रूण ऑर्गेनॉइड की परिपक्वता को मिला सकता है। (A)भ्रूण मार्कर ब्लींप-1 की जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण ऑर्गेनॉइड की तुलना में डेक्सेथेसोन इलाज ऑर्गेनॉइड में संस्कृति के 12 दिन में कम हो जाती है, जबकि वयस्क मार्कर सुक्रैसे-आइसोमालटाज (एसआईएस) की जीन अभिव्यक्ति(बी)और एंजाइम गतिविधि (सी) दोनों में वृद्धि हुई है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण की नकल करने के लिए लंबे समय तक देर से भ्रूण आंतों के ऑर्गेनॉइड की बागवानी का वर्णन करता है। परिपक्वता की प्रक्रिया वीवो में गति के बराबर होती है और संस्कृति में एक महीने के बाद पूरी होती है। मात्रात्मक आरएनए और प्रोटीन तकनीकों का उपयोग करके इस संस्कृति के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण विस्तृत हैं।

इस प्रोटोकॉल में, E18-E20 माउस भ्रूण से प्राथमिक आंतों की कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्राथमिक माउस कोशिकाओं का विकासात्मक चरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। पहले के विकास के चरण का उपयोग करने से आंतों के गोलाकार का उत्पादन होगा जो लंबे समय तक अपनी विशिष्ट भ्रूण जीन अभिव्यक्ति को बनाए रखते हैं , जिसमें वयस्क ऑर्गेनॉइड15,16में सीमित संक्रमण होता है । केवल देर से भ्रूण चरण स्फेरॉइड ही विट्रो10में वयस्क ऑर्गेनोइड में जाने में सक्षम हैं । आंत परिपक्वता पर बाह्य कारकों के प्रभाव के संबंध में अवसर की खिड़की को अधिकतम करने के लिए, देर से भ्रूण चरण से आंतों की सिफारिश की जाती है और जन्म के पिल्ले से आंतों की सिफारिश की जाती है जो रोगाणुओं और मां के दूध के संपर्क में आते हैं। बताया गया है कि कुछ जीवाणु मेटाबोलाइट्स और दूध के घटक परिपक्वता प्रक्रिया17के संशोधक के रूप में कार्य कर सकते हैं ।

जन्म से वयस्कता तक पूरी परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए एक महीने तक संस्कृति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, जबकि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण ों के लिए नमूनों का संग्रह, 6-8 भ्रूण से आंतों को शुरू सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। संस्कृति पैदा करने के लिए उसी विकासके चरण से भ्रूण का इस्तेमाल करना पसंद किया जाता है। हम विभिन्न कूड़े को पूल करने की सिफारिश नहीं करते हैं क्योंकि विकासात्मक चरण में मामूली अंतर परिपक्वता जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल आंत के विभिन्न क्षेत्रों की विकासात्मक विशेषताओं को बनाए रखने के लिए समीपस्थ और डिस्टल छोटी आंत से ऑर्गेनोइड उत्पादन के लिए जिम्मेदार है। एक विकल्प के रूप में, पूरी आंत को विशिष्ट मार्कर की वृद्धि/कमी अभिव्यक्ति के संबंध में समग्र परिपक्वता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बाद के मामले में, कम भ्रूण संस्कृति शुरू करने के लिए आंतों की कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यह प्रोटोकॉल त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग करके विकसित किया गया है। चूंकि ऑर्गेनॉइड संस्कृति में गतिशील विकास से गुजरते हैं, इसलिए पासिंग के बाद एक ही समय बिंदु पर डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए नमूने एकत्र करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, हमने पारित होने के बाद 3 दिन का चयन किया है, क्योंकि यह दो विभाजनों के बीच मध्यम समय का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर ऑर्गेनॉइड में मजबूत कलियां होती हैं और कोई कोशिका मृत्यु नहीं होती है। पासिंग के बाद एक वैकल्पिक समय बिंदु का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह पूरे प्रयोग के दौरान सुसंगत होना चाहिए। हम एक मार्ग के बाद 7 दिनों से अधिक समय तक ऑर्गेनॉइड बढ़ने की सिफारिश नहीं करते हैं, क्योंकि ऑर्गेनोइड ल्यूमेन में मृत्यु कोशिकाओं की वृद्धि परिणामों को प्रभावित कर सकती है।

अपने प्रयोगों में, हमने एक बाह्य कारक के उदाहरण के रूप में डेक्सेथासोन का उपयोग किया है जिसे वीवो9,18में आंतों की परिपक्वता में तेजी लाने के लिए साहित्य में दिखाया गया हैऔरसबसे अच्छा अध्ययन किया गया है। डेक्सेथासोन जीनोमिक और नॉन-जीनोमिक दोनों मार्गों के माध्यम से इसके प्रभाव डालती है। उदाहरण के लिए, जीनोमिक विनियमन के स्तर पर, एसआईएस एमआरएनए स्तरों की असामयिक वृद्धि देखी जा सकती है। गैर-जीनोमिक स्तर पर, हम ट्रेहल्स जैसे पाचन एंजाइमों की गतिविधि में परिवर्तन का निरीक्षण करते हैं। दोनों ही वीवो19में देखे गए आंतों के ब्रश सीमा एंजाइमों पर सुक्रैज जीन सक्रियण और गैर-जीनोमिक सक्रिय प्रभाव पर डैक्सेथासोन के वर्णित विशिष्ट पहलुओं के अनुसार हैं । तथ्य यह है कि सिंथेटिक ग्लूकोकॉर्टिकोइड जैसे बाह्य कारक, ऑर्गेनोइड संस्कृति में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के कुछ पहलुओं को मिला सकते हैं, इसी तरह विवो में वर्णित है, आगे आंत परिपक्वता के विभिन्न प्रकार के मॉड्यूलर की जांच के लिए माउस भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड को एक मॉडल के रूप में स्थापित करता है।

भले ही मानव आंतों के एपिथेलियम की रूपात्मक परिपक्वता 22 सप्ताह के गर्भावधि चरण में गर्भाशय में पूरी हो जाती है, आंतों की बाधा कार्य बचपन तक खिलाने के प्रकार, माइक्रोबायोटा के विकास और के साथ घनिष्ठ संबंध में परिपक्व होता है प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। इन विकासात्मक चरणों में मानव ऊतकों की सीमित उपलब्धता के कारण, इन विट्रो मूत्र मॉडल का ट्रांसलेशनल मूल्य आंतों की परिपक्वता को कम करने में सक्षम कारकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीन की संभावना में निहित है, एक प्रक्रिया के बीच संरक्षित स्तनपायी चूसने।

महत्वपूर्ण बात, अनुसंधान में पशु नैतिकता के संबंध में, यह मॉडल पशु प्रयोगों को परिष्कृत करने में योगदान दे सकता है क्योंकि इसमें जानवरों पर किए गए हस्तक्षेप शामिल नहीं हैं । संस्कृति के एक या दो समय के बिंदुओं पर अनुसंधान प्रश्नों को नया स्वरूप देकर पशुओं की संख्या को और कम किया जा सकता है जो एक संस्कृति के भीतर कई घटकों के परीक्षण की अनुमति देगा ।

Disclosures

="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

कोई नहीं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 1:1 Invitrogen 12634-028
Arginase Activity Assay Kit Sigma-Aldrich MAK112-1KT
B27 supplement Invitrogen 17504-044 100x
BCA protein assay Kit Fisher 10741395
Cell lysis buffer Cell Signaling Technology 9803S
Cell Recovery Solution Corning B.V. 354253
Cell strainer 70µM BD/VWR 734-0003
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EDTA Merck 10,84,18,250 EDTA Titriplex III
EGF Invitrogen PMG8045
Ethanol Merck 1,00,98,31,000
Glucose solution Sigma-Aldrich G6918
Glutamax Invitrogen 35050-038 100x
Hepes Invitrogen 15630-056 1M
Isolate II RNA Mini Kit Bioline BIO-52073
Lactose Sigma-Aldrich L3625 a-Lactose monohydrate
Maleic Buffer Sigma-Aldrich M0375 Maleic acid
Maltose Sigma-Aldrich M5885 D-(+)-Maltose monohydrate >99%
Matrigel Corning B.V. 356231 Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix
Millipore water N.A.
N2 supplement Invitrogen 17502-048 100x
n-Acetylcystein Sigma-Aldrich A9165
Noggin-conditioned media Homemade
o-dianisidine Sigma-Aldrich 191248
PBS Homemade
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 0,2 U/mL
PGO-enzyme preparation Sigma-Aldrich P-7119-10CAP capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase
p-hydroxymercuribenzoate sodium Sigma-Aldrich 55540
Rspondin-conditioned media Homemade
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Trehalose Sigma-Aldrich T5251 D-Trehalose dihydrate
Tris-HCl Buffer Homemade
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

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References

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