태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관내 빨기-위닝 전환 반복

Developmental Biology
 

Summary

이 프로토콜은 30 일 동안 배양 된 마우스 후기 태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관 내에서 빨기 - 투 - 위닝 전이를 모방하는 방법을 설명합니다.

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Garcia, T. M., Navis, M., Wildenberg, M. E., van Elburg, R. M., Muncan, V. Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (153), e60470, doi:10.3791/60470 (2019).

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Abstract

빨기 기간의 끝에서, 많은 포유류 종 고체 음식을 소화 하는 기능과 관련 된 장 상피에 큰 변화를 겪는다. 이 프로세스는 빨기-weaning 전환 이라고 하 고 신진 대사 및 형태 학적 조정과 함께 손에 가는 성인 상피와 신생아 상피의 대체 결과. 이 복잡한 발달 변경은 장 상피 세포에 내재되어 있는 유전 프로그램의 결과입니다 그러나, 어느 정도, 외인성 요인에 의해 조절될 수 있습니다. 늦은 태아 기간에서 마우스 1 차장 상피 세포의 장기간 배양, 시험관에서 빨기-weaning 전이 재범. 여기서, 우리는 시험관내에서 이 과정을 모델링하는 데 가장 적합한 마우스 태아 장 오르가노이드 배양에 대한 상세한 프로토콜을 설명한다. 우리는 시간이 지남에 따라 빨아 - 이유 전이와 관련된 장 기능의 변화를 모니터링하도록 설계된 몇 가지 유용한 검사를 설명합니다. 추가적으로, 우리는 생체외에서 빨기-weaning 전환에 영향을 미칠 수 있는 외인성 요인의 예를 포함, 시험관에서 빨기-weaning 전환의 타이밍을 변조의 표현으로. 이 시험관 내 접근법은 이 프로세스의 변조기뿐만 아니라 새끼-수유 전이의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 중요한 것은, 연구에서 동물 윤리에 관하여, 이 시험관 내 모형에 의하여 in vivo 모형을 대체하는 것은 동물 실험의 정제에 기여하고 창자 성숙 과정을 공부하기 위하여 동물의 사용에 있는 감소에 가능하게.

Introduction

마우스와 남자를 포함하여 많은 포유류 종에서, 신생아 장은 완전히 성숙한 장 상피에서 구별되는 몇몇 특징이 있습니다. 이러한 특징은 유당을 주요 탄수화물로 함유한 고지방 및 저탄수화물을 함유한 우유를 소화하고 흡수하는 신생아 장세포를 용이하게 합니다. 신생아장상피세포의 브러쉬 테두리는 이삭카리다제 락타제-플로리진 하이드로라제(Lct)를 발현하여 우유 이당류 유당을 소화한다. 빨기 기간 후에, enterocytes는 복잡한 탄수화물이 풍부하고 지방이 낮은 단단한 음식을 소화하기 위하여 적응합니다. 이는 락타아제에서 수크라제 이소말타제(Sis) 및 트레할라제(Treh)로의 브러시 테두리 이색리다아제 의 스위치에 의해 나타나며, 이는 고체 식품에 존재하는 더 복잡한 탄수화물을 소화할 수 있다2. 또 다른 신진 대사 스위치는 우유에 있는 아르기닌의 낮은 농도 관련. 아르기닌에 대한 필요성을 제공하기 위해, 신생아 장세포는 아르기닌 생합성에서 효소를 제한하는 속도를 발현, 아르기노세포신타제-1(Ass1), 아르기닌3를합성한다. 대조적으로, 성인 장세포는 아르기나제 2(Arg2)를 발현하며, 고형 식품에 풍부한 아르기닌을 이화시킬 수 있는 효소이다. 또한, 신생아 장 상피는 면역 글로불린 (FcRn)에 대한 신생아 Fc 수용체를 표현하며, 이는 우유에서 산모 IgG의 흡수를 순환 / 혈류로 중재합니다4. FcRn의 발현은 빨기에서 위닝 전환5동안 크게 감소합니다. 마우스에서, Paneth 세포의 성숙은 토굴의 형성 및 성숙과 우연히 발생하며, 항균 펩티드 리소좀 (Lyz) 및 디펜신6의발현을 특징으로한다.

이 모든 변경은 창자 상피가 성숙한 성인 상태에 도달할 때 마우스에 있는 나이의 1 달에 출생 후에 점차적으로 생기는 프로세스, 빨기-weaning 전환의 일부입니다. 빨기-위닝 전환은 본질적으로 조절되고 장 관에서 발달적으로 설정됩니다. 전사 인자 B 림프구 유도 성숙 단백질-1(Blimp-1)은 이러한 본질적인 성숙 과정7에서중요한 역할을 한다. Blimp-1은 신생아 상피에서 고도로 발현되며, 발현은 감소하고 새끼에서 위닝 전이 중에 손실되므로 신생아 장 상피의 신뢰할 수있는 마커역할을 할 수 있습니다. 본질적인 프로세스임에도 불구하고, 빨기에서 weaning 전환은 외부 요인에 의해 조절될 수 있습니다. 예를 들어, 코티솔, 덱사메타손의 합성 유사체는 생체 내 장 성숙을 가속화하는 것으로 알려져 있다8,9.

현재 시험관내 모델은 빨기-위닝 전이를 포함한 장 상피 성숙을 연구하고, 성인 상피 세포주 및/또는 성인 장 상피의 특성을 나타내는 성인 상피 세포주를 활용합니다. 우리는 최근에 1 차적인 장 상피 세포가 후반 태아 창자로부터 분리되어 유기체10으로시험관내에서 성장할 때 새끼-간 전이를 성숙하고 재입증한다는 것을 입증하였다. 우리는 또한 생체 외에서이 창 자 성숙 과정 생체 내에서 와 같은 속도로 발생 하는 것을 보여 주었다. 마지막으로, 우리는 생체 내 연구를 위해 설명된 것과 동일한 방식으로 성숙 과정을 가속화하기 위해 덱사메타손을 사용했습니다.

여기에서, 우리는 마우스 후기 태아 장 오르가노이드의 격리 그리고 문화를 위한 정확한 프로토콜을 개략적으로 설명합니다. 우리는 시험관에서 빨기-weaning 전환을 감시하는 장기간 오르가노이드 문화 및 방법을 위한 견본을 수집하는 바람직한 쪽을 기술합니다. 이 프로토콜은 이 프로세스의 장 상피 성숙 및 변조기의 시험관 내 연구에 사용될 수 있으며, 더 높은 처리량, 데이터의 품질 및 번역 값 증가 및 동물 사용의 감소를 초래합니다.

Protocol

이 연구는 암스테르담 대학의 동물 실험윤리위원회가 설립한 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 실시되었으며, 과학적 목적을 위해 동물을 사용하기 위한 유럽 지침 2010/63/EU에 따른 동물 연구에 관한 국가 법률을 완전히 준수합니다(ALC312).

1. 태아 소장 오르가노이드의 격리

  1. 승인 된 윤리 규정에 따라 외과 가위로 참수하여 E18-E20 태아를 희생하십시오.
  2. 안락사 직후, 조심스럽게 장 가위로 태아의 하복부를 열고 장 전체를 제거하십시오.
    참고: 생체외에서 적절한 빨기-이유 전이 및 성숙을 달성하기 위해서는 임신 의 E18과 E20 사이의 장에서 격리를 수행해야합니다.
  3. 두 개의 작은 집게로 내장을 스트레칭하십시오. 위장과 부록을 가이드로 사용하여 소장의 근위 및 말단 부분을 잘라냅니다.
    참고 : 해부가 신중하게 수행되면 결장도 분리 할 수 있습니다. 부록을 가이드로 사용하여 잘라냅니다(그림 1).
  4. 장이 세로로 열리게 하십시오: 세로로 놓인 면도날을 사용하여 내장을 고정하고 면도날을 따라 포셉(면도날 의 각 측면에 있는 집게의 한 팔)을 슬라이딩하여 내장을 당깁니다. 그 후, 1cm 조각으로 열린 창자를 잘라.
  5. 얼음 차가운 인산완충식염수(PBS)를 10mL로 50mL 튜브 2개를 준비합니다. 소장의 근위 및 원위 부분을 튜브에 별도로 옮기십시오 (그리고 해당되는 경우 결장). 추가 마우스의 내장을 해부하는 동안 얼음에 튜브를 유지합니다. 같은 튜브에 함께 하나의 쓰레기의 모든 장 부분을 수집합니다.
    참고 : 한 쓰레기는 일반적으로 6-10 태아가 있습니다. 모든 태아의 내장을 결합해야합니다. 이 양은 장 부당 48 웰 플레이트에 오르가노이드가있는 4-8 개의 우물을 산출하기에 충분해야합니다.
  6. 앞서 설명한 바와 같이 오르가노이드 분리를진행11. 즉, 얼음 차가운 PBS로 장 조각을 씻고, 4°C에서 30분 동안 2 mMM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)으로 배양하고, 얼음 차가운 PBS + 10% 태아 송아지 혈청(FCS)으로 조각을 가혹하게 세척하여 조직으로부터 토굴을 해리시키고, 70 μm 세포 스트레이너와 원심분리기를 사용하여 150°C에서 150°C에서 토굴을 수집한다.
  7. 펠릿 크기에 따라, 따뜻한 48 웰 플레이트에, 세포 외 매트릭스 젤에 토굴 플레이트 4 ~ 8 우물. 잘 당 세포 외 매트릭스 젤에 매달려 토굴 의 20 μL을 사용합니다. 세포외 매트릭스 젤을 37°C 인큐베이터에서 10분 동안 고화시키십시오.
    참고 : 고립 된 토굴의 40 ~ 50 %만이 오르가노이드를 형성한다는 것을 고려하면, 우물 당 250 ~ 300 개의 오르가노이드밀도를 목표로합니다. 먼저 필요 이상으로 세포외 매트릭스 젤을 적게 첨가하십시오. 먼저 잘 플랫한 후 현미경으로 살펴보면 분리된 토굴의 밀도가 이상적인지 여부를 분석한다. 필요한 경우 세포외 매트릭스 젤을 더 넣으세요.
  8. 그 동안 ENR 매체를 준비: 고급 덜베코의 수정 된 독수리 중간 / 햄의 F-12 (DMEM / F12) 1 :1 +++(4-(2-hydroxyethyl)-1-피페라진에탄에설포닉산 (HEPES) 1x, L-글루타민 0.01 M 및 0.2U/mL 페니실린/스트렙토마이신), 노긴 컨디셔닝 매체 4 mL, Rspondin 컨디셔닝 매체 2 mL, B27 보충제 400 μL 1x, N2 보충제 1x, 1.25 mM n-아세틸시스테인 50 μL, 0.05 μg/mL 표피 성장 인자 (EGF)의 20 μL.
    참고: 대장 오르가노이드를 배양할 때, 50% Wnt 컨디셔닝 된 매체로 보충하십시오.
  9. 웰당 ENR 배지 250 μL을 추가합니다.

2. 태아 오르가노이드의 배양

  1. 일주일에 3 번 문화의 매체를 변경합니다. 오르가노이드의 성숙은 1 개월 의 배양 후에 달성됩니다.
  2. 각 통로 후 3일째에 광학 현미경을 사용하여 스페로이드 및 오르가노이드의 수를 계산합니다. 조건당 적어도 3개의 웰과 각 웰에 존재하는 모든 오르가노이드를 정량화합니다.
    참고 : 스페로이드의 수는 시간이 지남에 따라 감소하고 오르가노이드의 수는 증가합니다(그림 2).
  3. 아래에 설명된 바와 같이 기계적 해리에 의해 일주일에 한 번 오르가노이드를 통과한다.
    1. 중간 을 제거하고 얼음 차가운 고급 DMEM / F12 1 : 1 +++1의 1 mL을 추가하십시오. 15 mL 튜브에 오르가노이드가있는 모든 세포 외 매트릭스 젤을 수집하십시오. 1000 μL 필터 팁 위에 200 μL 팁을 사용하고 파이펫을 위아래로 20회 사용하여 오르가노이드를 방해합니다.
    2. 4 °C에서 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기. 상급체를 버리고 잘 당 세포 외 매트릭스 젤의 20 μL에 펠렛을 다시 중단. 일반적으로 태아 오르가노이드는 1:2 비율로 확장 될 수 있습니다.
    3. 세포외 매트릭스 젤을 5-10 분 동안 고형화시키십시오.

3. RNA 및 단백질 수준에서의 성숙 분석

  1. 각 구절 후 3일마다 배양을 분석하고, 1개월 동안(즉, 완전한 성숙이 달성되는 시간)(도 3).
    참고 : 태아 오르가노이드 배양은 동적입니다 (영화 1) 기계적 중단 후 오르가노이드의 정상적인 재생에서 변화를 피하기 위해, 항상 통과 후 같은 날에 샘플을 수집 할 필요가있다.
  2. RNA 격리
    1. β-메르카포에탄올 2 μL로 보충된 각 RNA 용해 완충액200 μL을 사용하여 3개의 오르가노이드 우물을 수집합니다. RNA 용해 완충제 +β-메르카프토에탄올을 웰에 첨가한 후, 오가노이드가 있는 모든 세포외 매트릭스 젤이 RNase-free 1.5mL 튜브로 옮겨지도록 하십시오.
    2. 소용돌이를 힘차게 1 개월 이상 -80 °C에서 유지하십시오. 시판시 판시적으로 이용 가능한 실리카 스핀 컬럼 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다.
    3. RNA 품질을 높이기 위해 세척 단계 후 80% EtOH의 500 μL을 추가하고 컬럼을 반전시켜 부드럽게 혼합합니다. 11,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 사용하여 컬럼을 완전히 건조시십시오.
      참고 : 구니딘 티오야네이트의 모든 흔적을 제거하기 위해 튜브를 거꾸로 3 ~ 5 번 쓸어 넘기면 80 % EtOH로 튜브 뚜껑의 내부를 씻어해야합니다.
    4. RNA 수율을 높이려면 원심분리기 전에 RNase 가루를 바른 후 1-2분 간 기다립니다. 제1 유동용루를 컬럼에 두 번째로 적용하여 RNA를 재용해 한다.
      참고: 분리된 RNA 품질은 게놈 전체 발현 분석에 사용하기에 충분합니다. RNA 무결성 번호가 8보다 높은지 확인합니다.
  3. 단백질 분리
    1. 250 μL의 얼음 차가운 세포 회수 용액을 사용하여 15 mL 튜브에 5 개의 오르가노이드 우물을 수집합니다. 세포외 매트릭스 젤을 용해시키기 위해 얼음에 적어도 30 분 동안 배양하십시오 (이것은 세포 외 매트릭스 겔에서 단백질 기여도를 감소시것입니다).
    2. 차가운 PBS로 씻으시다. 250 μL의 세포 용해 버퍼를 추가하고 -80 °C에 보관하십시오.
      참고 : 초음파 처리 후 샘플을 사용하여 효소 활성을 감지하거나 웨스턴 블롯을 사용할 수 있습니다.
  4. 면역 염색
    1. 250 μL의 얼음 차가운 세포 회수 용액을 사용하여 15 mL 튜브에 오르가노이드 2 개의 우물을 수집합니다. 세포외 매트릭스 젤을 용해시키기 위해 얼음에 적어도 30 분 동안 배양하십시오 (이것은 염색 배경을 감소시것입니다). 차가운 PBS로 씻으시다.
    2. 4°C에서 1시간 동안 500 μL의 파라포름데이드(PFA)를 사용하여 오르가노이드를 고정시. 차가운 PBS로 씻으시다. 출판된 프로토콜12에따르면 전체 오르가노이드 면역형광 또는 파라핀 임베딩을 진행한다.
      참고 : 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 오르가노이드를 처리하십시오. 이렇게 하면 구조의 중단을 방지할 수 있습니다.

4. 외인성 (예시로 덱사메타손)의 유기성 성숙 과정에 미치는 영향

  1. 배양 첫날, 오르가노이드에 0.01M 덱사메타손을 추가합니다. 배지가 변경될 때마다 새로운 덱사메타손을 추가하여 배양 한 달 내내 덱사메타손으로 오르가노이드를 배양합니다.
  2. 유전자 발현 분석
    1. 전술한 바와 같이 RNA를 분리한다. 합성, 동시에, 모든 샘플의 cDNA를 비교할 수 (처리 및 처리되지 않은). 기본 qRTPCR 방법을 사용해 보시고.
    2. GeNorm을 사용하여 태아 오르가노이드에 새로운 치료법이 사용될 때마다 가장 안정적인 두 가지 기준 유전자를 식별합니다. 상대발식 계산에 선택된 두 참조 유전자의 기하학적 평균을 사용합니다.
      참고 : 마우스 태아 오르가노이드를 테스트하는 참조 유전자의 제안 : 사이클로 필린, Gapdh, βactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib 및 Tbp.
    3. 특정 외인성 인자가 출생 후 마우스 태아 성숙에 미치는 영향을 조사하기 위해 다음 의 모든 유전자를 평가해야합니다.
      1. 태아 마커락타아제(Lct),아르기노시크산 신타오스 1(Ass1), B 림프구 유도 성숙 단백질 1(Blimp-1) 및 신생아 Fc수용체(FcRn)가배양 첫 2주 동안 발현이 감소하는지 확인하고 나머지 배양 시간 동안 결석한다(도4C). 이 패턴이 변경되었는지 여부를 분석합니다.
      2. 성인 마커수크라제-이소말타제(Sis),아르기나제2(아르그2),트레할라제(Treh) 및 리소자임(Lyz)이 2주 배양 후 발현이 증가하는지 확인한다(도4D). 이 패턴이 외부 요인에 의해 변경되었는지 여부를 분석합니다.
        참고: 덱사메타손은 태아 오르가노이드의 성숙을 가속화할 수 있는 외부 인자이며 다른 외인성 인자를 테스트하기 위한 모든 실험에서 양성 대조군으로 사용될 수 있습니다.
  3. 효소 활성 분석
    1. 전술한 바와 같이 단백질을 분리한다. Dahlqvist와 Messer13,14에의해 출판 된 프로토콜에 따라 장 이의 부리 다증 활동을 감지합니다.
    2. 0.625 M 남성 완충제 pH 6.0을 준비하십시오 (4 °C에서 3 개월 동안 유지). 이 완충액을 사용하여 0.05 M 유당 (리소좀 p-갈락토시다아제 활성을 억제하는 안정제로 p-하이드록시머수리벤조에이트 나트륨을 첨가); 0.05 M 말토오스; 0.05 M 수크로오스 와 0.05 M 트레할로스.
      참고: 이러한 모든 용액은 4 °C에서 5 일 동안 보관 할 수 있습니다. 분석을 준비하는 동안 얼음에 보관하십시오.
    3. 0.125 M: 다음과 같은 농도로 용액을 얻기 위해 초순수로 5.56 M 포도당 용액을 희석시킴으로써 분석 표준을 준비하십시오. 0.1 M; 0.075 M; 0.05 M 및 0.025 M.
      참고: 용액은 4°C에서 3개월 이상 안정되어 있습니다.
    4. 37°C에서 60분 동안 96웰 플레이트에 배양:
      - 유당 30μL로 유기성 용해30 μL
      - 30 μL의 자당으로 유기성 용해액의 30 μL
      - 말토오스 30 μL로 희석된 오르가노이드 용해액의 30 μL
      - 트레할라제 30 μL로 희석된 오르가노이드 용해액의 30 μL
      - 30 μL의 희석되지 않은 오르가노이드 용해액의 30 μL 의 말산, 샘플 배경으로
      - 각 포도당 표준 30 μL
      - 30 μL의 초순수, 공백
      - 30 μL의 양성 대조군 (희석을 최적화; 용해된 태아 장 조직은 락타아제 활성을 위한 대조군으로 사용될 수 있는 반면, 용해된 성인 장 조직은 수크라제, 몰타제 및 트레할라제에 대한 대조군으로 사용될 수 있음)
      참고 : 샘플의 희석은 세포 용해 버퍼로 이루어져야합니다. 분석을 준비하는 동안 얼음에 샘플과 접시를 유지합니다.
    5. 각 기판으로 배양 후 오르가노이드 용해액에 존재하는 효소에 의해 생성되는 포도당의 양을 결정하려면 PGO 색 용액의 200 μL을 신속하게 추가하고 37 °C에서 30 분 동안 5 분마다 450 nm에서 흡광도를 측정하십시오.
      참고 : PGO 색상 솔루션을 신선하게 만드십시오. pH 7.0에서 0.5mol/L 트리스-HCl 버퍼에 10 U/mL 포도당 산화제, 2 U/mL 퍼옥시다아제 및 7.88 mmol/L 오-디아니시딘을 사용하십시오. 용액은 플레이트에 첨가 할 때 실온에 있어야합니다.
    6. 포도당 표준에 따라 활성을 계산하고 단백질의 총량에 대해 정확합니다 (bicinchoninic 산 분석 (BCA)에 의해 결정). 효소 활성은 μM 포도당/μg단백질·분-1(도 5B)으로발현되어야 한다.
      참고: 시판되는 아르기나제 활성 분석 키트를 사용하여 아르기나제 활성을 측정한다.

Representative Results

태아 장 상피 세포의 장기간 배양
시험관에서 빨기-weaning 전환을 모방하기 위한 프로토콜은 장기간 배양 도중 태아 오르가노이드의 정확한 취급에 달려 있습니다. E18-E20 마우스 태아로부터 분리된 근위 및 원위장은(도 1)에제시된 바와 같이 분리된다. 격리 시, 상피 세포는 세포외 매트릭스 젤 돔에서 시드된다(그림 2). 그것은 전형적으로 성인 상태로 성숙하기 위하여 태아 오르가노이드를 위한 4개의 통로 및 대략 28-30 일 의 문화가 걸립니다. 이 시간 동안, 성숙의 다양한 단계에서 세포를 수집 할 수있다(그림 3).

시험관 내 빨기-위닝 전환의 대표적인 하류 분석
분리된 태아 오르가노이드가 명백하게 근치 또는 말단인지 확인하기 위해, 근위 마커의 발현 수준을 비교한 원컷 도메인 패밀리 패밀리2(Onecut2)및 GATA 결합 단백질 4(Gata4) 및 말단 마커 지방산 결합 단백질 6(Fabp6) 및 Guanylate Cyclase 활성제 2A(Guca2a) 둘 다 근위 및 원위 소노노이드 배양체(도4A,B)를비교한다. 시험관내 빨기-위닝 전이유전자의 두 세트에 의해 모니터링될 수 있다:태아(도 4C)및 성인 마커(도4D). 태아 마커는 배양 과정에서 점차적으로 감소해야하며 성인 마커의 발현은 점차 증가해야합니다(도 4C,D).

시험관내 절제전을 빠는 수정자로 외인성인자를 사용
이러한 프로토콜에서 덱사메타손은 합성 글루코코르티코이드, 시험관내에서 빨기-젖질 전이를 수정할 수 있는 외인성 인자의 예로 사용되었다. 그림 5의 대표적인 데이터는 외인성 요인의 영향이 반드시 게놈이어야 하는 것은 아니기 때문에 다중 분석에 의해 결정되는 것이 최상이라는 것을 건의합니다. 예를 들어, 수크라제-이소말타아제의 경우 RNA와 단백질 발현 모두 덱사메타손(도5A)으로유도되는 반면 트레할라제 발현은 단백질 수준에서만 변화된다. (그림5B)를참조하십시오.

Figure 1
그림 1: 마우스 태아 소장의 격리. (A)위, 근위 및 원위 소장, 부록 및 결장 등 해부 되고 늘어난 태아 장의 사진. 검은 선은 근위와 말단 소장을 나누기 위해 용기를 절단해야하는 곳을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 배양의 3일째, 17일째 및 28일째에 근위 및 원위 태아 오르가노이드 배양의 대표적인 현미경 이미지. 모든 이미지는 통과 후 3일째에 얻어졌으며, 초과 스페로이드의 수의 감소를 보여주었다. 배율 표시줄: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1: 태아 오르가노이드 배양 역학을 보여주는 대표적인 비디오, 문화의 4 일에서 6. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

Figure 3
그림 3: 시간이 지남에 따라 장 성숙의 분석을 위한 오르가노이드 수집의 개략적 표현. 근위 및 원위 태아 오르가노이드 배양은 한 달 동안 배양되어야 하고 매주 통과되어야 합니다. 성숙 분석을 위한 샘플은 격리 후 3일, 각 구절 후 3일마다 수집되어야합니다.

Figure 4
그림 4: 근위 및 말단 태아 오르가노이드에서 장 성숙 마커의 대표적인 qRTPCRs. (a)근위 마커 Onecut2Gata4는 주로 근위 오르가노이드 배양에서 발현되는 반면(B)말단 마커 Fabp6Guca2a는 주로 원스코르노이드 배양에서 발현된다. (C)태아 마커 Lct, Ass1, Blimp-1FcRn 감소 및(D)성인 마커 Sis, Arg2, TrehLyz는 근위 및 원위 오르가노이드 배양물 모두에서 시간이 지남에 따라 증가한다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 외부 인자 덱사메타손은 태아 오르가노이드의 성숙을 조절할 수 있습니다. (a)태아 마커 Blimp-1의 유전자 발현은 대조군 오르가노이드에 비해 덱사메타손 치료 오르가노이드에서 배양일째12일째에 감소하며, 성인 마커 수크라세 이소말타제(Sis)의 유전자 발현(B)과 효소 활성(C)이 모두 증가한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 시험관에서 빨기-weaning 전환을 모방하기 위하여 연장된 시간 동안 늦은 태아 창자 오르가노이드의 배양을 기술합니다. 성숙 과정은 생체 내 속도와 같으며 문화에서 한 달 후에 완료됩니다. 정량적 RNA 및 단백질 기술을 사용하여 이 배양의 하류 분석은 상세히 설명되어 있습니다.

이 프로토콜에서는 E18-E20 마우스 배아로부터의 1차 장 세포가 사용된다. 이 프로토콜에 대한 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 1 차 마우스 세포의 발달 단계는 특히 중요합니다. 초기 발달 단계를 사용하면 성인 오르가노이드15,16으로의제한된 전이와 함께 장기간에 걸쳐 특정 태아 유전자 발현을 유지하는 장 스페로이드의 생성을 초래할 것이다. 만 늦은 태아 단계 스페로이드는 시험관 내 성인 오르가노이드로 통과 할 수있다10. 장 성숙에 외인성 요인의 영향에 관하여 기회의 창을 최대화하기 위하여는, 늦은 태아 단계에서 창자는 세균과 어머니 우유에 드러낸 태어난 새끼에게서 창이 아니라 추천됩니다. 특정 세균 대사 산물 및 우유 성분이 성숙 과정의 수정자 역할을 할 수있다고보고된다 17.

하류 분석을 위한 견본을 수집하는 동안, 출생에서 성년까지 전체 성숙을 공부하기 위하여 1 달 동안 배양을 유지하기 위하여 충분한 양의 세포를 장악하기 위하여는, 6-8 배아에서 내장은 시작 물자로 이용되어야 합니다. 배양을 생성하기 위한 동일한 발달 단계에서 배아를 사용하는 것이 바람직하다. 우리는 발달 단계에 있는 경미한 다름이 성숙 유전자의 표현에 영향을 미칠 수 있기 때문에 다른 쓰레기를 풀링하는 것을 추천하지 않습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 장의 다른 세그먼트의 발달 특징을 유지하기 위해 근위 및 말단 소장에서 오르가노이드 생성을 차지합니다. 대안으로, 전체 창 자 특정 마커의 증가/감소 발현에 대 한 전반적인 성숙을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 후자의 경우에, 더 적은 태아는 문화를 시작하기 위한 장 세포를 격리하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

이 프로토콜은 3차원 오르가노이드 배양을 사용하여 개발됩니다. 오르가노이드가 배양에서 역동적인 성장을 겪을 때, 통과 후 동시에 다운스트림 분석을 위한 샘플을 수집하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 유기노이드가 강력한 싹을 포함하고 거의 또는 전혀 세포 사멸을 포함하는 두 개의 분할 사이의 중간 시간을 나타내기 때문에, 통과 후 3 일을 선택했습니다. 패서드 후의 대체 타임포인트를 사용할 수 있지만 전체 실험 중에 일관성이 있어야 합니다. 우리는 유기체 루멘의 사망 세포의 증가가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 통로 후 7 일 이상 오르가노이드를 재배하지 않는 것이 좋습니다.

우리의 실험에서, 우리는 생체 내 성숙을 가속화하기 위해 문헌에서 가장 잘 연구되고 있는 외인성 인자의 예로 덱사메타손을 사용했습니다9,18. 덱사메타손은 게놈 경로와 비게놈 경로를 통해 그 효과를 발휘합니다. 예를 들어, 게놈 조절 수준에서, Sis mRNA 수준의 조숙한 증가가 관찰될 수 있다. 비 게놈 수준에서, 우리는 trehalase와 같은 소화 효소의 활동에 있는 변경을 관찰합니다. 둘 다 생체 내 에서 관찰되는 장내 브러쉬 경계 효소에 대한 수크라세 유전자 활성화 및 비게놈 활성화 효과에 대한 덱사메타손의 특이적 양상에 따라19. 합성 글루코코르티코이드와 같은 외인성 요인이 생체 내에서 설명된 것과 유사하게 오르가노이드 배양에서 젖을 짜는 전이의 특정 측면을 조절할 수 있다는 사실은 마우스 태아 장 내 오르가노이드를 장 성숙의 다른 종류의 변조기 조사를 위한 모델로 확립합니다.

인간의 장 상피의 형태학적 성숙은 22 주 임신 단계에서 자궁에서 완료되더라도, 장 장벽 기능은 먹이의 모형과 가까운 관계에서 유년기까지 성숙합니다, microbiota의 발달 및 면역 반응. 이러한 발달 단계에서 인간 조직의 제한된 가용성으로 인해, 시험관 내 뮤린 모델의 번역 값은 장 성숙을 조절 할 수있는 요인의 높은 처리량 스크린의 가능성에 있다, 프로세스 중 보존 포유류를 빨아.

중요한 것은, 연구에서 동물 윤리와 관련하여, 이 모델은 동물실험에 대한 개입을 포함하지 않기 때문에 동물 실험의 개선에 기여할 수 있다. 한 배양 내에서 여러 구성 요소를 테스트할 수 있는 하나 또는 두 개의 문화 적 시점으로 연구 질문을 재설계하여 동물의 수를 더 줄일 수 있습니다.

Disclosures

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저자는 공개할 것을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

없음.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 1:1 Invitrogen 12634-028
Arginase Activity Assay Kit Sigma-Aldrich MAK112-1KT
B27 supplement Invitrogen 17504-044 100x
BCA protein assay Kit Fisher 10741395
Cell lysis buffer Cell Signaling Technology 9803S
Cell Recovery Solution Corning B.V. 354253
Cell strainer 70µM BD/VWR 734-0003
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EDTA Merck 10,84,18,250 EDTA Titriplex III
EGF Invitrogen PMG8045
Ethanol Merck 1,00,98,31,000
Glucose solution Sigma-Aldrich G6918
Glutamax Invitrogen 35050-038 100x
Hepes Invitrogen 15630-056 1M
Isolate II RNA Mini Kit Bioline BIO-52073
Lactose Sigma-Aldrich L3625 a-Lactose monohydrate
Maleic Buffer Sigma-Aldrich M0375 Maleic acid
Maltose Sigma-Aldrich M5885 D-(+)-Maltose monohydrate >99%
Matrigel Corning B.V. 356231 Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix
Millipore water N.A.
N2 supplement Invitrogen 17502-048 100x
n-Acetylcystein Sigma-Aldrich A9165
Noggin-conditioned media Homemade
o-dianisidine Sigma-Aldrich 191248
PBS Homemade
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 0,2 U/mL
PGO-enzyme preparation Sigma-Aldrich P-7119-10CAP capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase
p-hydroxymercuribenzoate sodium Sigma-Aldrich 55540
Rspondin-conditioned media Homemade
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Trehalose Sigma-Aldrich T5251 D-Trehalose dihydrate
Tris-HCl Buffer Homemade
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

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References

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