Recapitulating patte-til-avvenning overgang in vitro bruker fosterets intestinal Organoids

Developmental Biology
 

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan å etterligne patte-til-avvenning overgang in vitro ved hjelp av mus sent fosterets intestinal organoids kultivert for 30 dager.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Garcia, T. M., Navis, M., Wildenberg, M. E., van Elburg, R. M., Muncan, V. Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (153), e60470, doi:10.3791/60470 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

På slutten av patte perioden, mange pattedyrarter gjennomgår store endringer i intestinal epitel som er forbundet med evnen til å fordøye fast føde. Denne prosessen er betegnet patte-til-avvenning overgang og resulterer i utskifting av nyfødt epitel med voksen epitel som går hånd i hånd med metabolske og morfologiske justeringer. Disse komplekse utviklingsmessige endringene er et resultat av et genetisk program som er iboende til tarm epitelceller, men kan til en viss grad være modulert av ytre faktorer. Langvarig kultur av mus primære intestinal epitelceller fra slutten av fosterets periode, viser patte-til-avvenning overgang in vitro. Her beskriver vi en detaljert protokoll for mus fosterets intestinal organoid kultur best egnet til å modellere denne prosessen in vitro. Vi beskriver flere nyttige analyser designet for å overvåke endringen av intestinal funksjoner knyttet til patte-til-avvenning overgang over tid. I tillegg inkluderer vi et eksempel på en ytre faktor som er i stand til å påvirke patte-til-avvenning overgang in vivo, som en representasjon av modulerende tidspunktet for patte-til-avvenning overgangen in vitro. Dette in vitro tilnærming kan brukes til å studere molekylære mekanismer av patte-til-avvenning overgangen samt modulatorer av denne prosessen. Viktigere, med hensyn til dyreetikk i forskning, erstatter jegn vivo modeller av denne in vitro-modellen bidrar til foredling av dyreforsøk og muligens til en reduksjon i bruken av dyr for å studere gut modningsprosesser.

Introduction

I mange pattedyrarter, inkludert mus og menn, har nyfødt tarmen flere funksjoner som er forskjellig fra det fullt modne tarm epitel. Disse funksjonene Letter nyfødt enterocytes til å fordøye og absorbere melk, som inneholder høyt fett og lite karbohydrater, med laktose som det store karbohydrat. Pensel kanten av nyfødte tarm epitelceller uttrykker disaccharidase laktase-phlorizin Hydrolase (LCT)1 for å fordøye melken disakkarid laktose. Etter at patte perioden, enterocytes tilpasse å fordøye fast føde som er rik på komplekse karbohydrater og lite fett. Dette er manifestert ved en bryter i pensel grensen disaccharidase uttrykk fra laktase til sucrase-isomaltase (SIS) og trehalase (Treh), som kan fordøye mer komplekse karbohydrater til stede i fast føde2. En annen metabolske bryteren er knyttet til den lave konsentrasjonen av arginin i melk. Å sørge for behovet for arginin, nyfødt enterocytes uttrykke hastigheten begrense enzymet i Arginine biosyntesen, argininosuccinate syntase-1 (Ass1), til synthetize Arginine3. I kontrast, voksen enterocytes uttrykke arginase 2 (Arg2), et enzym som kan catabolizing arginin som er rikelig i solid mat. I tillegg uttrykker nyfødt tarm epitel nyfødte FC reseptoren for immunglobuliner (FcRn), som formidler absorpsjon av mors IgG fra melken inn i blodsirkulasjonen/blodbanen4. Uttrykket av FcRn avtar betydelig under patte-til-avvenning overgang5. I mus, modning av Paneth celler oppstår fødselen, sammentreffet med dannelse og modning av Krypter, og er preget av uttrykk for antimikrobielle peptider lysosome (Lyz) og defensins6.

Alle disse endringene er en del av patte-til-avvenning overgangen, en prosess som skjer gradvis etter fødselen til en måned av alder i mus, når intestinal epitel når sin eldre voksen tilstand. Patte-til-avvenning overgangen er egentlig regulert og developmentally satt i tarmen røret. Transkripsjon faktor B lymfocytter-indusert modning protein-1 (blimp-1) spiller en nøkkelrolle i denne iboende modningsprosess7. Blimp-1 er svært uttrykt i nyfødt epitel, mens uttrykket synker og er tapt under patte-til-avvenning overgang og derfor kan tjene som en pålitelig markør for nyfødte intestinal epitel. Til tross for tilværelse en iboende forarbeide, det patte-å-venne overgang kan modulert av ekstern faktorene. For eksempel er syntetisk analog av kortisol, deksametason, kjent for å akselerere tarm modning i vivo8,9.

Current in vitro-modeller som brukes til å studere intestinal epitel modning inkludert patte-til-avvenning overgangen, utnytte voksen epitel cellelinjer og/eller voksen organoids som bærer egenskapene til voksen intestinal epitel. Vi har nylig demonstrert at primære intestinal epitelceller isolert fra slutten av fosterets tarmen modne og recapitulate den patte-til-avvenning overgangen når vokser in vitro som organoids10. Vi viste videre at denne tarmen modningsprosess in vitro skjer i samme takt som i vivo. Til slutt brukte vi deksametason til å akselerere modningsprosessen på samme måte som beskrevet for in vivo Studies.

Her skisserer vi en presis protokoll for isolasjon og kultur av mus sent fosterets intestinal organoids. Vi beskriver den foretrukne måten å samle prøver for langvarig organoid kultur og metoder for å overvåke patte-til-avvenning overgang in vitro. Denne protokollen kan brukes for in vitro studier av intestinal epitel modning og modulatorer av denne prosessen og resulterer i høyere gjennomstrømning, økt kvalitet og translational verdi av data og en reduksjon av dyr bruk.

Protocol

Denne studien ble gjennomført i samsvar med institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr etablert av ethic Committee for Animal eksperimentering ved Universitetet i Amsterdam i full overensstemmelse med nasjonal lovgivning om dyr forskning etter EU-direktiv 2010/63/EU for bruk av dyr for vitenskapelige formål (ALC312).

1. isolering av Foster små intestinal organoids

  1. Ofre E18-E20 fostre ved halshogging med kirurgisk saks, i henhold til godkjente etiske forskrifter.
  2. Umiddelbart etter dødshjelp, forsiktig kuttet åpne nedre mage av fosteret med intestinal saks og fjerne hele tarmen.
    Merk: isolasjon må utføres med tarmen mellom E18 og E20 av svangerskapet for å oppnå riktig patte-til-avvenning overgang og modning in vitro.
  3. Med to små tang, strekke tarmen. Bruke magesekken og vedlegget som guider, skjære fra hverandre proksimale og hånd i del av tynntarmen.
    Merk: Hvis disseksjon er gjort forsiktig, er det mulig å isolere kolon også. Skjær den fra hverandre med vedlegg som guide (figur 1).
  4. Gjør tarmen åpen lengderetningen: fikse tarmen ved hjelp av et barberblad plassert på langs og trekke tarmen ved å skyve tang (en arm av Tang på hver side av barberbladet) langs barberbladet. Deretter kuttet åpnet tarmen i 1 cm stykker.
  5. Klargjør 2 50 mL rør med 10 mL iskald fosfat-bufret saltvann (PBS). Overfør proksimale og den lave delen av tynntarmen (og kolon hvis aktuelt) separat til rørene. Hold rørene på isen mens dissekere tarmen av ekstra mus. Samle alle intestinal deler av ett kull sammen i samme tube.
    Merk: ett kull har vanligvis 6-10 fostre. Tarmen av alle fostre må kombineres. Dette beløpet bør være nok til å gi 4-8 brønner med organoids, i en 48-brønn plate, per intestinal del.
  6. Fortsett med organoid isolasjon som beskrevet tidligere11. Kort sagt, vaske intestinal stykker med iskald PBS, ruge med 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i 30 minutter ved 4 ° c, distansere den Krypter fra vevet ved hardt å vaske bitene med iskald PBS + 10% fosterets kalv serum (FCS), filter ved hjelp av en 70 μm celle sil og sentrifuger for å samle Krypter på 150 x g i 5 min ved 4 ° c.
  7. Plate 4 til 8 brønner med Krypter i ekstracellulære matrise gel, avhengig av pellet størrelse, i en varm 48-brønn plate. Bruk 20 μL av Krypter suspendert i ekstracellulære matrise gel per brønn. La ekstracellulære Matrix gel stivne i en 37 ° c inkubator i 10 min.
    Merk: med tanke på at bare 40% til 50% av isolerte Krypter form organoids, mål for en tetthet på 250 til 300 organoids per brønn. Først legger mindre ekstracellulære matrise gel enn nødvendig. Se under mikroskopet etter platting den første brønnen for å analysere om tettheten av den isolerte Krypter er ideell. Om nødvendig, tilsett mer ekstracellulære matrise gel.
  8. I mellomtiden forbereder ENR medium: 14 mL av avansert Dulbecco ' s modifisert Eagle medium/ham ' s F-12 (DMEM/F12) 1:1 + + + (supplert med 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 1x, L-glutamin 0,01 M og 0,2 U/mL penicillin/Streptomycin), 4 mL noggin medier, 2 mL Rspondin medier, 400 μL av B27 tilskudd 1x, 200 μL av N2-tillegg 1x, 50 μL av 1,25 mM n-Acetylcysteine, 20 μL av 0,05 μg/mL epidermal vekstfaktor (EGF).
    Merk: Når dyrking Colon organoids, supplere med 50% wnt conditioned Media.
  9. Tilsett 250 μL av ENR medium per brønn.

2. dyrking av Foster organoids

  1. Endre medium for kulturer 3 ganger per uke. Modning av organoids oppnås etter 1 måned med kultur.
  2. På dag 3 etter hver passering, telle antall spheroids og organoids ved hjelp av en optisk mikroskop. Kvantifisere minst 3 brønner per tilstand og alle organoids tilstede i hver brønn.
    Merk: antall spheroids reduseres med tiden, mens antallet organoids øker (figur 2).
  3. Passage organoids en gang i uken ved mekaniske dissosiasjon som beskrevet nedenfor.
    1. Fjern medium og tilsett 1 mL iskald avansert DMEM/F12 1:1 + + +. Samle alle ekstracellulære matrise gel med organoids i en 15 mL tube. Bruk en 200 μL spiss oppå et 1000 μL filter spiss og Pipetter opp og ned 20 ganger for å forstyrre organoids.
    2. Sentrifuger ved 150 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend pellet i 20 μL av ekstracellulære matrise gel per brønn. Vanligvis kan fosterets organoids utvides i en 1:2 ratio.
    3. La ekstracellulære matrise gel stivne i 5-10 min. Tilsett 250 μL av ENR medium per brønn.

3. modnings analyse på RNA og protein nivå

  1. Analysere kultur hver 3 dager etter hvert passasje, for en periode på 1 måned (dvs. tid der fullstendig modning er oppnådd) (Figur 3).
    Merk: fosterets organoid kultur er dynamisk (film 1) og for å unngå variasjon fra den normale regenerering av organoids etter mekaniske forstyrrelser, er det nødvendig å alltid samle prøver på samme dag etter passering.
  2. RNA-isolasjon
    1. Samle tre brønner med organoids med 200 μL av RNA lyse buffer for hver brønn supplert med 2 μL β-mercaptoethanol. Etter at du har lagt RNA lyse buffer + β-mercaptoethanol til brønnen, må du kontrollere at alle ekstracellulære Matrix gel med organoids er overført til et RNase-Free 1.5 mL rør.
    2. Vortex kraftig og holde på-80 ° c i ikke lenger enn 1 måned. Isoler RNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kolonnesett for silika-spinn.
    3. For å øke RNA kvalitet, etter vask trinn tilsett 500 μL av 80% EtOH og bland forsiktig ved invertere kolonnen. Sentrifuger for 2 min ved 11 000 x g for å tørke kolonnen helt.
      Merk: Sørg for å vaske innsiden av lokket på røret med 80% EtOH ved å sveipe røret opp ned tre til fem ganger for å kvitte seg med alle spor av guaniniumtiocyanat ammoniumthiocyanat.
    4. For å øke RNA-utbyttet, vent 1-2 min etter påføring av RNase-fritt vann før sentrifuger. Re-eluere RNA ved å bruke den første gjennomstrømnings eluatet til kolonnen en gang til.
      Merk: isolert RNA-kvalitet er tilstrekkelig for bruk i uttrykks analyse i hele Genova. Kontroller om RNA-nummeret er over 8.
  3. Protein isolasjon
    1. Samle 5 brønner av organoids ved hjelp av 250 μL av iskald celle gjenvinnings løsning i 1 15 mL rør. Ruge i minst 30 min på isen for å oppløse den ekstracellulære Matrix gel (dette vil redusere protein bidrag fra ekstracellulære Matrix gel).
    2. Vask med iskald PBS. Tilsett 250 μL av cellelyse Rings buffer og lagre ved-80 ° c.
      Merk: etter sonikering kan prøvene brukes til å oppdage enzym aktivitet eller for vestlig blots.
  4. Immunostaining
    1. Samle 2 brønner av organoids ved hjelp av 250 μL av iskald celle gjenvinnings løsning i et 15 mL rør. Ruge i minst 30 min på isen for å oppløse den ekstracellulære Matrix gel (dette vil redusere flekker bakgrunn). Vask med iskald PBS.
    2. Fest organoids ved hjelp av 500 μL av 4% paraformaldegyde (PFA) i 1 time ved 4 ° c. Vask med iskald PBS. Fortsett til hel-organoid immunofluorescence eller parafin innebygging, i henhold til publiserte protokoller12.
      Merk: Bruk en plast Pasteur pipette å håndtere organoids. Dette vil unngå avbrudd i sin struktur.

4. effekten av ytre faktor (deksametason som et eksempel) på organoid modningsprosess

  1. På dag en av kultur, tilsett 0,01 M deksametason til organoids. Ruge organoids med deksametason i løpet av hele måneden av kultur ved å legge til nye deksametason hver gang medium er endret.
  2. Analyse av genuttrykk
    1. Isoler RNA som beskrevet ovenfor. Syntetisere, på samme tid, cDNA av alle prøvene skal sammenlignes (behandlet og ubehandlet). Fortsett med foretrukket qRTPCR-metode.
    2. Bruk GeNorm å identifisere de to mest stabile referanse genet hver gang en ny behandling brukes på fosterets organoids. Bruk den geometriske gjennomsnittet av de to valgte referanse gener for relative uttrykks beregninger.
      Merk: forslag til referanse gener å teste for musen fosterets organoids: cyclophilin, Gapdh, βactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib og Tbp.
    3. For å undersøke hvordan en viss ytre faktor påvirker postnatal mus Foster modning, bør alle de følgende genene evalueres.
      1. Kontroller om fosterets markører laktase (LCT), argininosuccinate syntase 1 (Ass1), B lymfocytter-indusert Modnings protein 1 (blimp-1) og nyfødt FC reseptor (FcRn) nedgang i uttrykket i løpet av de to første ukene av kultur og er fraværende for gjenværende kultur tid (figur 4c). Analyser om dette mønsteret er endret.
      2. Sjekk om voksen markører sucrase-isomaltase (SIS), arginase 2 (Arg2), trehalase (Treh) og lysozyme (Lyz) økning i uttrykket etter to ukers kultur (figur 4d). Analyser om dette mønsteret endres av den eksterne faktoren.
        Merk: deksametason er en ekstern faktor som kan akselerere modning av fosterets organoids og kan brukes som en positiv kontroll i alle eksperimenter som tar sikte på å teste andre ytre faktorer.
  3. Analyse av enzym aktivitet
    1. Isoler proteinet som beskrevet ovenfor. Merker intestinal disaccharidases aktivitet alt etter protokoller offentliggjort av nordlund og messer13,14.
    2. Forbered 0,625 pH 6,0 i M maleinsyreanhydrid (oppbevares i 3 måneder ved 4 ° c). Ved hjelp av denne bufferen, Forbered 0,05 M laktose (tilsett p-hydroxymercuribenzoate natrium som stabilisator for å hemme lysosomal p-galaktosidase aktivitet); 0,05 M maltose; 0,05 m sukrose og 0,05 M trehalose.
      Merk: alle disse løsningene kan oppbevares i 5 dager ved 4 ° c. Hold på isen mens forbereder analysen.
    3. Forbered analysen standarder ved å fortynne 5,56 M glukoseoppløsning med ultrarent vann for å oppnå løsninger med følgende konsentrasjoner: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 m og 0,025 M.
      Merk: løsning stabilt i minst 3 måneder ved 4 ° c.
    4. Ruge i en 96 brønn plate for 60 min ved 37 ° c:
      -30 μL av organoid lysat med 30μL av laktose
      -30 μL av organoid lysat med 30μL av sukrose
      -30 μL av ti ganger fortynnet organoid lysat med 30 μL av maltose
      -30 μL av fem ganger fortynnet organoid lysat med 30 μL av trehalase
      -30 μL av ufortynnet organoid lysat med 30 μL av maleinsyreanhydrid syre, som prøve bakgrunn
      -30 μL av hver glukose standard
      -30 μL av ultrarent vann, som blank
      -30 μL av positiv kontroll (optimalisere fortynning; lysert fosterets tarm vev kan brukes som kontroll for laktase aktivitet mens lysert voksen tarm vev kan bli brukt som kontroll for sucrase, maltase og trehalase)
      Merk: fortynning av prøver bør gjøres med cellelyse Rings buffer. Hold prøvene og plate på isen mens du forbereder analysen.
    5. For å bestemme mengden av glukose produsert av enzymer som finnes i organoid lysat etter inkubasjons med sine respektive underlag, tilsett raskt 200 μL av PGO-Color løsning og måle absorbansen ved 450 nm hver 5 min i 30 min ved 37 ° c.
      Merk: gjør PGO-Color løsning frisk. Bruk 10 U/mL glukose-oksidase, 2 U/mL peroksidase og 7,88 mmol/L o-dianisidine i 0,5 mol/L Tris-HCl buffer ved pH 7,0. Løsningen skal være ved romtemperatur når den legges til platen.
    6. Beregn aktivitet i henhold til glukose standard og korrekt for total mengde protein (bestemmes av bicinchoninic acid-analysen (BCA)). Enzym aktivitet skal uttrykkes som μM glukose/mikrogram protein · min-1 (figur 5B).
      Merk: mål arginase aktivitet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig arginase.

Representative Results

Langvarig kultur av fosterets intestinal epitelceller
Protokollen for å etterligne patte-til-avvenning overgang in vitro avhenger av riktig håndtering av fosterets organoids under langvarig kultur. Proksimale og den som er isolert fra E18-E20 mus fostre skilles som presentert i (figur 1). Ved isolasjon er epitelceller sådd i ekstracellulære Matrix gel kupler (figur 2). Det tar vanligvis fire passasjer og ca 28-30 dager med kultur for Foster organoids å modnes til den voksne staten. I løpet av denne tiden, kan celler på ulike stadier av modning samles (Figur 3).

Representative nedstrøms analyse av patte-til-avvenning overgang in vitro
For å bekrefte at isolerte Foster organoids er utpreget proksimale eller klart, sammenlign uttrykks nivået for proksimale markører ett kutt domene familiemedlem 2 (Onecut2) og gata bindende protein 4 (Gata4) og flate markører fatty acid bindende protein 6 (Fabp6) og dinatriuminosinat cyclase Activator 2a (Guca2a) mellom både proksimale og klart organoid kulturer (Figur 4A, B). Patte-til-avvenning overgangen in vitro kan overvåkes av to sett med gener: fosterets (figur 4c) og voksen markører (figur 4d). Fosterets markører bør gradvis avta i løpet av kulturen, mens uttrykk for voksen markører bør gradvis øke (Figur 4C, D).

Bruke ytre faktor som en endring av suge-til avvenning overgangen in vitro
I denne protokollen deksametason en syntetisk glukokortikoid, ble brukt som et eksempel på ytre faktor i stand til å endre patte-til-avvenning overgangen in vitro. Representative data i figur 5 tyder på at effekter av ytre faktorer er best å bli bestemt av flere analyser, som de ikke nødvendigvis burde være genomisk. For eksempel, i tilfelle av sucrase-isomaltase både RNA og protein uttrykk er indusert med deksametason (figur 5a) mens trehalase uttrykk er bare endret på protein nivå. (Figur 5B).

Figure 1
Figur 1: isolering av mus fosterets tynntarmen. (A) fotografi av dissekert og strukket fosterets gut, inkludert mage, proksimale og hånd i tynntarmen, vedlegg og kolon. Svart linje indikerer hvor gut bør kuttes for å dele proksimale og den som kan fjernes tynntarmen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative mikroskopiske bilder av proksimale og organoid kulturen på dag 3, dag 17 og dag 28 i kulturen. Alle bilder ble innhentet på dag 3 etter passering og viser nedgangen i antall spheroids over tid. Scale bar: 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Film 1: representative video som viser fosterets organoid kultur dynamikk, fra dag 4 til 6 av kulturen. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Figure 3
Figur 3: skjematisk fremstilling av organoid samling for analyse av tarm modning over tid. Proksimale og organoid kulturer bør være kultivert i en måned og passert hver uke. Prøver for modnings analyse bør samles 3 dager etter isolasjon og hver 3 dager etter hvert passasje. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representative qRTPCRs av tarm modning markører i proksimale og den organoids. (A) proksimale markører Onecut2 og Gata4 er i hovedsak uttrykt i proksimale organoid kulturen, mens (B) den er i ferd med å Fabp6 og Guca2a er stort sett uttrykt i den organoid kulturen. (C) fosterets markører LCT, Ass1, blimp-1 og FcRn nedgang og (D) voksen markører SIS, Arg2, Treh og Lyz øke over tid i både proksimale og organoid kulturer. Feilfelt representerer SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: ekstern faktor deksametason kan modulere modning av Foster organoids. (A) genuttrykk for fosterets markør blimp-1 er redusert på dag 12 av kulturen i deksametason behandlet organoids sammenlignet med kontroll organoids, mens både genuttrykk (B) og enzym aktivitet (C) av voksen markør Sucrase-isomaltase (SIS) er økt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver dyrking av sen fosterets intestinal organoids for lengre tid å etterligne patte-til-avvenning overgangen in vitro. Modningsprosessen er lik tempoet i vivo og fullføres etter en måned i kulturen. Nedstrøms analyse av denne kulturen ved hjelp av kvantitative RNA og protein teknikker er detaljert.

I denne protokollen brukes primære tarm celler fra E18-E20 mus embryo. Den utviklingsmessige stadiet av primær mus celler brukes til å generere organoids for denne protokollen er spesielt viktig. Bruke tidligere utviklingsmessige scenen vil resultere i generering av intestinal spheroids som opprettholder deres spesifikke fosterets genuttrykk over en lengre periode med begrenset overgang tilvoksen organoids. Bare sent Foster scenen spheroids er i stand til transitt til voksen organoids in vitro10. For å maksimere vinduet av muligheter med hensyn til virkningen av ytre faktorer på Gut modning, tarmen fra slutten av Foster scenen er anbefalt og ikke tarmen fra født valper som har vært utsatt for mikrober og morsmelk. Det er rapportert at visse bakterielle metabolitter og melke komponenter kan fungere som bestemmelsesord av modningsprosessen17.

For å oppnå tilstrekkelige mengder celler for å opprettholde kulturen i en måned for å studere hele modning fra fødsel opp til voksen, mens samle prøvene for nedstrøms analyser, tarmen fra 6-8 embryo bør brukes som utgangsmateriale. Det foretrekkes å bruke embryo fra samme utviklingstrinn for å generere kulturen. Vi anbefaler ikke pooling forskjellige kull som små forskjeller i utviklingstrinn kan påvirke uttrykk for modning gener.

Protokollen som er beskrevet her står for organoid generasjon fra proksimale og hånd i tynntarmen for å opprettholde utviklingsmessige funksjoner i ulike segmenter av tarmen. Som et alternativ, kan hele tarmen brukes til å undersøke den generelle modning med hensyn til økningen/nedgang uttrykk for de spesifikke markører. I sistnevnte tilfelle kan færre embryo brukes til å isolere tarm celler for å starte kultur.

Denne protokollen er utviklet ved hjelp av tredimensjonale organoid kulturer. Som organoids gjennomgår dynamisk vekst i kulturen, er det viktig å samle prøver for nedstrøms analyser på samme tidspunkt etter passaging. I denne protokollen, har vi valgt dag 3 etter passering, som det representerer middels tid mellom to deler der organoids inneholder robuste knopper og liten eller ingen celle død. Et alternativt tids punkt etter passaging kan brukes, men det bør være konsistent under hele eksperimentet. Vi anbefaler ikke økende organoids i mer enn 7 dager etter en passasje, som økning av dødsceller i organoid lumen kan påvirke resultatene.

I våre eksperimenter har vi brukt deksametason som et eksempel på en ytre faktor som er vist og best studert i litteraturen for å akselerere tarm modning i vivo9,18. Deksametason utøver sin virkning via både genomisk og ikke-genomisk ruter. For eksempel, på nivået av genomisk regulering, en veslevoksne økning på SIS mRNA nivåer kan observeres. På et ikke-genomisk nivå, observerer vi endringer i aktiviteten av fordøyelsesenzymer som trehalase. Begge er i samsvar med beskrevne spesifikke aspekter ved deksametason på sucrase gen aktivering og ikke-genomisk aktiverings effekt på grense enzymer i tarm penselen observert i vivo19. Det faktum at ytre faktorer, som syntetisk glukokortikoider, kan modulere visse aspekter av patte-til-avvenning overgang i organoid kulturen, på samme måte som beskrevet i Vivo, etablerer videre musen fosterets intestinal organoids som en modell for etterforskning av ulike type modulatorer av gut modning.

Selv om morfologiske modning av humant intestinal epitel er fullført i Utero på svangerskaps nivå av 22 uker, intestinal barriere funksjonen modnes till barndommen i et nært forhold til den type fôring, utvikling av bakterieflora og immunrespons. På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av menneskelig vev på disse utviklingsmessige stadier, ligger den translational verdien av in vitro murine modell i muligheten for høy gjennomstrømming skjermer av faktorer i stand til modulerende intestinal modning, en prosess bevart blant pattedyr.

Viktigere, med hensyn til dyr etikk i forskning, kan denne modellen bidra til foredling av dyreforsøk som det ikke inkluderer intervensjoner utført på dyr. Antallet dyr kan reduseres ytterligere ved å omstrukturere forskningsspørsmål til en eller to tids punkter kultur som vil tillate testing av flere komponenter i en kultur.

Disclosures

="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.

-->

Forfattere erklærer ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 1:1 Invitrogen 12634-028
Arginase Activity Assay Kit Sigma-Aldrich MAK112-1KT
B27 supplement Invitrogen 17504-044 100x
BCA protein assay Kit Fisher 10741395
Cell lysis buffer Cell Signaling Technology 9803S
Cell Recovery Solution Corning B.V. 354253
Cell strainer 70µM BD/VWR 734-0003
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EDTA Merck 10,84,18,250 EDTA Titriplex III
EGF Invitrogen PMG8045
Ethanol Merck 1,00,98,31,000
Glucose solution Sigma-Aldrich G6918
Glutamax Invitrogen 35050-038 100x
Hepes Invitrogen 15630-056 1M
Isolate II RNA Mini Kit Bioline BIO-52073
Lactose Sigma-Aldrich L3625 a-Lactose monohydrate
Maleic Buffer Sigma-Aldrich M0375 Maleic acid
Maltose Sigma-Aldrich M5885 D-(+)-Maltose monohydrate >99%
Matrigel Corning B.V. 356231 Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix
Millipore water N.A.
N2 supplement Invitrogen 17502-048 100x
n-Acetylcystein Sigma-Aldrich A9165
Noggin-conditioned media Homemade
o-dianisidine Sigma-Aldrich 191248
PBS Homemade
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 0,2 U/mL
PGO-enzyme preparation Sigma-Aldrich P-7119-10CAP capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase
p-hydroxymercuribenzoate sodium Sigma-Aldrich 55540
Rspondin-conditioned media Homemade
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Trehalose Sigma-Aldrich T5251 D-Trehalose dihydrate
Tris-HCl Buffer Homemade
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241, (3), 199-214 (1981).
  2. Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267, (4), 584-594 (1994).
  3. Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251, (1), 103-110 (1986).
  4. Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
  5. Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42, (5), 1062-1069 (1997).
  6. Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (22), 10335-10339 (1994).
  7. Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
  8. Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82, (1), 91-95 (1985).
  9. Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264, (2), 306-311 (1993).
  10. Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20, (2), (2019).
  11. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  12. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
  13. Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44, (2), 169-172 (1984).
  14. Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14, (3), 376-392 (1966).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13, (6), 734-744 (2013).
  16. Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5, (2), 421-432 (2013).
  17. Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64, (2), 296-301 (2017).
  18. Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49, (6), 782-788 (2001).
  19. Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74, (1), 9-21 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics