Recapitulating Suckling till avvänjning övergång in vitro med fetala intestinala Organoider

Developmental Biology
 

Summary

Detta protokoll beskriver hur man imiterar Suckling till avvänjning övergång in vitro med hjälp av mus sena foster tarm organoider odlade i 30 dagar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Garcia, T. M., Navis, M., Wildenberg, M. E., van Elburg, R. M., Muncan, V. Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (153), e60470, doi:10.3791/60470 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I slutet av amningsperioden genomgår många däggdjursarter stora förändringar i tarmens epitel som är förknippade med förmågan att smälta fast föda. Denna process kallas Suckling till avvänjning övergång och resulterar i utbyte av neonatal epitel med vuxet epitel som går hand i hand med metabola och morfologiska justeringar. Dessa komplexa utvecklingsmässiga förändringar är resultatet av ett genetiskt program som är inneboende i tarmen epitelceller men kan, i viss mån, moduleras av extrinsic faktorer. Långvarig kultur av mus primära intestinala epitelceller från sena foster perioden, recapitulates Suckling till avvänjning övergång in vitro-. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för mus fetalt intestinal Organoid kultur bäst lämpad att modellera denna process in vitro-. Vi beskriver flera användbara analyser som utformats för att övervaka förändringen av tarm funktioner i samband med diande-till-avvänjning över tiden. Dessutom, vi inkluderar ett exempel på en extrinsic faktor som kan påverka Suckling till avvänjning övergång in vivo, som en representation av modulerande tidpunkten för diande-till-avvänjning övergång in vitro-. Denna in vitro-metod kan användas för att studera molekylära mekanismer för diande-till-avvänjning övergång samt modulatorer av denna process. Viktigare, när det gäller djur etik i forskning , ersätter in vivo modeller av denna in vitro-modell bidrar till förfining av djurförsök och möjligen till en minskning av användningen av djur för att studera Gut mogningen processer.

Introduction

I många däggdjursarter, inklusive möss och män, har neonatal tarmen flera funktioner som skiljer sig från den fullt mogna intestinal epitelet. Dessa funktioner underlättar neonatal enterocyter att smälta och absorbera mjölk, som innehåller hög fetthalt och låga kolhydrater, med laktos som den stora kolhydrat. Borsten gränsen av neonatal intestinal epitelceller uttrycker disackaridas lactase-phlorizin hydrolas (LCT)1 att smälta mjölken disackarid laktos. Efter diande perioden, enterocyter anpassa sig till smälta fast mat som är rik på komplexa kolhydrater och låg fetthalt. Detta manifesteras genom en switch i pensel gränsen disackaridase uttryck från laktasbrist till sucrase-isomaltase (SIS) och trehalase (Treh), som kan smälta mer komplexa kolhydrater som finns i fast food2. En annan metabolisk Switch är relaterad till den låga koncentrationen av arginin i mjölk. Att föreskriva behovet av arginin, neonatal enterocyter uttrycka den hastighetsbegränsande enzym i arginin biosyntes, argininsuccinatsyntetas syntas-1 (ass1), att syntetisera arginin3. I kontrast, vuxna enterocyter Express arginas 2 (Arg2), ett enzym som kan kataboliserande arginin som är rikligt förekommande i fasta livsmedel. Dessutom uttrycker neonatal intestinal epitel den neonatala FC-receptorn för immunglobuliner (FcRn), som förmedlar absorption av moderns IgG från mjölken i cirkulationen/blodomloppet4. Uttrycket för FcRn minskar markant under den diande-till-avvänjning övergången5. Hos möss, mognad av Paneth celler uppstår postnatally, tillfällighet med bildandet och mogningen av kryptor, och kännetecknas av uttryck av antimikrobiella peptider Lysosomen (LyZ) och defensins6.

Alla dessa förändringar är en del av Suckling till avvänjning övergången, en process som sker gradvis efter födseln till en månads ålder hos möss, när tarmens epitel når sin mogna vuxna staten. Diande-till-avvänjning övergången är i sig reglerad och developmentalt in i tarmen röret. Transkription faktor B lymfocytinducerad mognad protein-1 (Blimp-1) spelar en viktig roll i denna inneboende mogning process7. Blimp-1 är starkt uttryckt i neonatal epitel, medan dess uttryck minskar och går förlorad under diande-till-avvänjning övergången och kan därför fungera som en pålitlig markör för neonatal intestinal epitel. Trots att en inneboende process, den Suckling till avvänjning övergången kan moduleras av externa faktorer. Till exempel, den syntetiska analoga kortisol, dexametason, är känt för att påskynda Gut mogningen in vivo8,9.

Aktuella in vitro-modeller som används för att studera intestinal epitelial mognad inklusive Suckling till avvänjning övergången, utnyttja vuxna epitelial cellinjer och/eller vuxna organoider som bäregenskaper hos vuxna intestinal epitel. Vi har nyligen visat att primära intestinala epitelceller isolerade från sena foster tarmen mogna och recapitulate den Suckling till avvänjning övergången när de växer in vitro-som organoider10. Vi visade vidare att denna Gut mogning process in vitro sker i samma takt som in vivo. Slutligen använde vi dexametason för att påskynda mogningen på samma sätt som beskrivs för in vivo studier.

Här skisserar vi ett exakt protokoll för isolering och kultur av mus sena foster tarm organoider. Vi beskriver det föredragna sättet att samla prover för långvarig Organoid kultur och metoder för att övervaka Suckling till avvänjning övergång in vitro-. Detta protokoll kan användas för in vitro-studier av intestinal epitelial mognad och modulatorer av denna process och resulterar i högre genomströmning, ökad kvalitet och translationell värde av data och en minskning av djurens användning.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med institutionella riktlinjer för vård och användning av försöksdjur som inrättats av etikkommittén för djurförsök vid Amsterdams universitet i full överensstämmelse med den nationella lagstiftningen om djurförsök enligt EU-direktivet 2010/63/EU för användning av djur för vetenskapliga ändamål (ALC312).

1. isolering av foster små intestinala organoider

  1. Offra E18-E20 foster av halshuggning med kirurgisk sax, enligt godkända etiska regler.
  2. Omedelbart efter dödshjälp, försiktigt skära öppna nedre delen av fostret med intestinal sax och ta bort hela tarmen.
    Anmärkning: isolering måste utföras med tarmar mellan E18 och E20 av dräktigning för att uppnå rätt Suckling till avvänjning övergång och mognad in vitro-.
  3. Med två små pinps, sträck tarmen. Använda magen och appendix som guider, skära isär den proximala och distala delen av tunntarmen.
    ANMÄRKNINGAR: om dissektion görs noggrant, är det möjligt att isolera tjocktarmen också. Klipp isär med hjälp av appendix som guide (figur 1).
  4. Gör tarmen öppen longitudinellt: fixera tarmen med hjälp av ett rakblad placeras på längden och dra tarmen genom att skjuta tång (en arm av pinps på varje sida av rakbladet) längs rakbladet. Därefter skär den öppnade tarmen i 1 cm bitar.
  5. Förbered 2 50 mL-rören med 10 mL ikallfosfat-buffrad saltlösning (PBS). Överför den proximala och distala delen av tunntarmen (och tjocktarmen om tillämpligt) separat till rören. Håll rören på isen medan dissekera tarmen av ytterligare möss. Samla alla tarm delar av en kull tillsammans i samma tub.
    Obs: en kull har vanligtvis 6-10 foster. Alla foster tarmar måste kombineras. Detta belopp bör vara tillräckligt för att ge 4-8 brunnar med organoider, i en 48-brunn tallrik, per intestinal del.
  6. Fortsätt med Organoid isolation som tidigare beskrivits11. Kort sagt, tvätta tarm bitarna med iskall PBS, inkubera med 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 30 minuter vid 4 ° c, separera kryptor från vävnaden genom hårt tvätta bitarna med iskalla PBS + 10% fetalt kalv serum (FCS), filter med en 70 μm cell sil och centrifugera för att samla in kryptor på 150 x g för 5 min vid 4 ° c.
  7. Platta 4 till 8 brunnar med kryptor i extracellulära matrix gel, beroende på pelleten storlek, i en varm 48-bra tallrik. Använd 20 μl kryptor suspenderade i extracellulär matrix gel per brunn. Låt extracellulära matrix gel stelna i en inkubator på 37 ° c i 10 min.
    Obs: med tanke på att endast 40% till 50% av isolerade kryptor bildar organoider, sikta på en densitet på 250 till 300 organoider per brunn. Lägg först till mindre extracellulär matrix gel än vad som behövs. Titta under mikroskopet efter platting den första brunnen för att analysera om tätheten av isolerade kryptor är idealisk. Om det behövs, tillsätt mer extracellulär matrix gel.
  8. Under tiden förbereda ENR medium: 14 mL av avancerade Dulbecco modifierade Eagle medium/Ham ' s F-12 (DMEM/F12) 1:1 + + + (kompletteras med 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) 1x, L-glutamin 0,01 M och 0,2 e/mL penicillin/streptomycin), 4 mL noggin-betingat medium, 2 mL Rspondin-konditionerade medier, 400 μL av B27 tillägg 1x, 200 μL av N2 tillägg 1x, 50 μL av 1,25 mM n-acetylcystein, 20 μL av 0,05 μg/mL Epidermal tillväxtfaktor (EGF).
    Obs: när odling kolon organoider, komplettera med 50% WNT betingat media.
  9. Tillsätt 250 μL ENR-medel per brunn.

2. odling av fetala organoider

  1. Ändra medel av kulturerna 3 tider per vecka. Mogningen av organoider uppnås efter 1 månad av kultur.
  2. Vid dag 3 efter varje passage, räkna antalet spheroids och organoider med hjälp av ett optiskt mikroskop. Kvantifiera minst 3 brunnar per skick och alla organoider som finns i varje brunn.
    Anm.: antalet spheroids minskar med tiden, medan antalet organoider ökar (figur 2).
  3. Passage av organoider en gång i veckan genom mekanisk dissociation enligt beskrivningen nedan.
    1. Ta bort mediet och tillsätt 1 mL iskall Advanced DMEM/F12 1:1 + + +. Samla alla extracellulära matrix gel med organoider i en 15 mL tub. Använd en 200 μL-spets ovanpå en 1000 μL filter spets och Pipettera uppåt och nedåt 20 gånger för att störa organoiderna.
    2. Centrifugera vid 150 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 20 μL extracellulär matrix gel per brunn. Vanligtvis, fetala organoider kan utökas i en 1:2 förhållande.
    3. Låt extracellulära matrix gel stelna för 5-10 min. Tillsätt 250 μL ENR-medium per brunn.

3. mogning analys på RNA och proteinnivå

  1. Analysera kulturen var tredje dag efter varje passage, under en period av 1 månad (dvs. tid då fullständig mognad uppnås) (figur 3).
    Obs: fetalt Organoid kultur är dynamisk (film 1) och för att undvika variation från den normala regenerering av organoider efter mekaniska störningar, är det nödvändigt att alltid samla prover på samma dag efter passage.
  2. RNA-isolering
    1. Samla 3 brunnar av organoider med 200 μL RNA-lysis buffert för varje brunn kompletterad med 2 μL β-merkaptoetanol. Efter tillsats av RNA lysis buffert + β-merkaptoetanol till brunnen, se till att alla extracellulära matrix gel med organoider överförs till en RNase-fri 1,5 mL tub.
    2. Vortex kraftigt och håll vid-80 ° c i högst 1 månad. Isolera RNA med hjälp av kommersiellt tillgängliga kvarts spinn kolonnsatser.
    3. För att öka RNA-kvalitet, efter tvättsteg tillsätt 500 μL av 80% EtOH och försiktigt blanda genom att invertera kolonnen. Centrifugera i 2 min vid 11 000 x g för att torka kolonnen helt.
      Obs: se till att tvätta insidan av locket på röret med 80% EtOH genom att snärta röret upp och ner tre till fem gånger för att bli av med alla spår av guanidin tiocyanat.
    4. För att öka RNA-avkastningen, vänta 1-2 min efter applicering av RNase-fritt vatten innan Centrifugera. Re-eluera RNA genom att tillämpa den första genomflödeseluatet till kolonnen en andra gång.
      Anmärkning: isolerad RNA-kvalitet är tillräcklig för användning i genomomfattande uttrycks analys. Kontrollera om RNA-integritettalet är över 8.
  3. Protein isolering
    1. Samla 5 brunnar av organoider med 250 μL av iskall cell återhämtning lösning i 1 15 mL rör. Inkubera i minst 30 min på is för att lösa upp den extracellulära matrix gel (detta kommer att minska protein bidrag från extracellulär matrix gel).
    2. Tvätta med iskall PBS. Tillsätt 250 μL celllysbuffert och förvara vid-80 ° c.
      Anmärkning: efter ultraljudsbehandling, prover kan användas för att upptäcka enzymaktivitet eller för västerländska blots.
  4. Immun
    1. Samla 2 brunnar av organoider med 250 μL av iskall cell återhämtning lösning i en 15 mL tub. Inkubera i minst 30 min på is för att lösa upp den extracellulära matrix gelen (detta kommer att minska färgning bakgrund). Tvätta med iskall PBS.
    2. Fixera organoider med 500 μL av 4% paraformaldegyde (PFA) under 1 h vid 4 ° c. Tvätta med iskall PBS. Fortsätt till hela-Organoid immunofluorescens eller till paraffin inbäddning, enligt publicerade protokoll12.
      Anmärkning: Använd en plast pastej pipett för att hantera organoider. Detta kommer att undvika störningar i dess struktur.

4. effekten av extrinsic Factor (dexametason som ett exempel) på Organoid mogning process

  1. På dag ett av kulturen, tillsätt 0,01 M dexametason till organoider. Inkubera organoiderna med dexametason under hela kultur månaden genom att tillsätta nya dexametason varje gång mediet ändras.
  2. Analys av genuttryck
    1. Isolera RNA enligt beskrivningen ovan. Syntetisera, samtidigt, cDNA av alla prover som skall jämföras (behandlade och obehandlade). Fortsätt med önskad qRTPCR-metod.
    2. Använd GeNorm för att identifiera de två mest stabila referens gen varje gång en ny behandling används på fetala organoider. Använd det geometriska medelvärdet av de två valda referengenerna för beräkning av relativa uttryck.
      Anmärkning: förslag på referengener för att testa för mus fetala organoider: Cyklophilin, GAPDH, βactin, 36b4, HPRT, Rpl4, Rpl32, Ppib och TBP.
    3. För att undersöka hur en viss extrinsic faktor påverkar postnatal mus fetal mognad, alla följande gener bör utvärderas.
      1. Kontrollera om foster markörer laktas (LCT), argininosuccinat syntas 1 (ass1), B lymfocytinducerad mognad protein 1 (Blimp-1) och neonatal FC-receptorn (fcrn) minskning i uttryck under de första två veckorna av kulturen och är frånvarande för den återstående kulturen tid (figur 4c). Analysera om det här mönstret ändras.
      2. Kontrollera om vuxna markörer sukras-isomaltase (SIS), arginas 2 (Arg2), trehalase (Treh) och lysozym (LyZ) ökning uttryckt efter två veckors kultur (figur 4D). Analysera om det här mönstret ändras av den externa faktorn.
        Notera: dexametason är en extern faktor som kan påskynda mogningen av fetala organoider och kan användas som en positiv kontroll i alla experiment som syftar till att testa andra extrinsic faktorer.
  3. Analys av enzymaktivitet
    1. Isolera protein enligt beskrivningen ovan. Upptäcka intestinal disackaridaser verksamhet enligt protokoll som publicerats av Dahlqvist och Messer13,14.
    2. Förbered 0,625 M maleic-buffert pH 6,0 (håll i 3 månader vid 4 ° c). Med hjälp av denna buffert, förbereda 0,05 M laktos (tillsätt p-hydroxymercuribenzoate natrium som stabilisator att hämma lysosomalt p-galaktosidas aktivitet); 0,05 M maltos; 0,05 m sackaros och 0,05 M Trehalose.
      Obs: alla dessa lösningar kan förvaras i 5 dagar vid 4 ° c. Håll på is när du förbereder analysen.
    3. Förbered Analysstandarder genom att späda 5,56 m glukoslösning med ultrarent vatten för att få lösningar med följande koncentrationer: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 m och 0,025 M.
      Obs: lösning stabil i minst 3 månader vid 4 ° c.
    4. Inkubera i en 96-brunn platta för 60 min vid 37 ° c:
      -30 μL Organoid lysat med 30μL laktos
      -30 μL Organoid lysat med 30μL sackaros
      -30 μL av tio gånger utspädd Organoid lysat med 30 μL maltos
      -30 μL fem gånger utspädd Organoid lysat med 30 μL trehalase
      -30 μL outspädd Organoid lysat med 30 μL maleinsyra, som prov bakgrund
      -30 μL av varje glukos standard
      -30 μl ultrarent vatten, som blank
      -30 μl positiv kontroll (optimera utspädning; lyserat foster tarm vävnad kan användas som kontroll för laktasaktivitet medan lyserat vuxen tarm vävnad kan användas som kontroll för sucrase, lipas Maltas och trehalase)
      Anmärkning: spädning av proverna skall göras med celllysbuffert. Förvara proverna och plattan på isen medan du förbereder analysen.
    5. För att bestämma mängden glukos som produceras av enzymerna som finns i Organoid lysat efter inkubering med sina respektive substrat, tillsätt snabbt 200 μL PGO-färglösning och mät absorbans vid 450 nm var 5 min under 30 min vid 37 ° c.
      Obs: gör PGO-Color lösning fräsch. Använd 10 U/mL glukos-oxidas, 2 U/mL peroxidas och 7,88 mmol/L o-dianisidine i 0,5 mol/L Tris-HCl buffert vid pH 7,0. Lösningen ska vara i rumstemperatur när den tillsätts på plattan.
    6. Beräkna aktivitet enligt glukos standard och korrekt för total mängd protein (bestäms av och Acid assay (BCA)). Enzymaktiviteten ska uttryckas som μM glukos/μg protein · min-1 (Figur 5b).
      Obs: Mät arginas aktivitet med hjälp av en kommersiellt tillgänglig arginas aktivitet assay kit.

Representative Results

Långvarig odling av fostrets intestinala epitelceller
Protokollet för härma Suckling till avvänjning övergång in vitro beror på korrekt hantering av fetala organoider under långvarig kultur. Proximal och distala inälvor som isolerats från E18-E20 musens foster separeras enligt beskrivningen i (figur 1). Vid isolering, epitelceller är seedade i extracellulära matrix gel kupoler (figur 2). Det tar vanligtvis fyra passager och cirka 28-30 dagar av kultur för fetala organoider att mogna till den vuxna staten. Under denna tid, celler i olika stadier av mognad kan samlas (figur 3).

Representativ nedströms analys av diande-till-avvänjning övergång in vitro
För att bekräfta att isolerade fosterorganoider är tydligt proximala eller distala, jämför uttrycksnivån för proximala markörer en cut domän familjemedlem 2 (Onecut2) och gata bindande protein 4 (Gata4) och distala markörer fettsyra bindande protein 6 (Fabp6) och Guanylate cyclase Activator 2a (Guca2a) mellan både proximala och distala Organoid kulturer (figur 4A, B). Diande-till-avvänjning övergång in vitro kan övervakas av två uppsättningar av gener: foster (figur 4c) och vuxna markörer (figur 4D). Foster markörer bör gradvis minska under loppet av kulturen, medan uttrycket av vuxna markörer bör gradvis öka (figur 4C, D).

Använda extrinsic faktor som en modifierare av sugande-till avvänjning övergång in vitro
I detta protokoll dexametason en syntetisk glukokortikoid, användes som ett exempel på extrinsic faktor som kan ändra Suckling till avvänjning övergång in vitro-. Representativa data i figur 5 tyder på att effekterna av extrinsic faktorer är bäst att bestämmas av flera analyser, eftersom de inte nödvändigtvis borde vara Genomic. I fallet med sukras-isomaltase induceras till exempel både RNA och proteinuttryck med dexametason (figur 5a) medan trehalasuttrycket endast ändras på proteinnivå. (Figur 5b).

Figure 1
Figur 1: isolering av mus fetalt tunntarm. (A) fotografi av dissekerat och sträckt foster tarmen, inklusive mage, proximala och distala tunntarm, tillägg och kolon. Svart linje indikerar var tarmen ska skäras för att dela den proximala och distala tunntarmen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa mikroskopiska bilder av proximala och distala fetalt Organoid kultur på dag 3, dag 17 och dag 28 i kulturen. Alla bilder erhölls på dag 3 efter passage och visar minskningen av antalet spheroids övertid. Skalstapel: 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Film 1: representativ video som visar fetalt Organoid kultur dynamik, från dag 4 till 6 av kulturen. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Figure 3
Figur 3: schematisk representation av Organoid Collection för analys av mag mogningen över tid. Proximala och distala fostrets Organoid kulturer bör odlas för en månad och blint varje vecka. Prover för mognad analys bör samlas in 3 dagar efter isolering och var 3 dagar efter varje passage. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: representativa qRTPCRs för mag mogning markörer i proximala och distala fostrets organoider. (A) proximala markörer Onecut2 och Gata4 uttrycks huvudsakligen i den proximala Organoid kulturen medan (B) distala markörer Fabp6 och Guca2a är mestadels uttrycks i den distala Organoid kulturen. (C) foster markörer LCT, ass1, Blimp-1 och Fcrn minskning och (D) vuxna markörer SIS, Arg2, Treh och LyZ öka över tiden i både proximala och distala Organoid kulturer. Felstaplar representerar SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: extern faktor dexametason kan modulera mogningen av fetala organoider. (A) genuttryck för foster markör Blimp-1 minskar på dag 12 av kulturen i dexametason behandlade organoider jämfört med kontroll organoider, medan både genuttryck (B) och enzymaktivitet (C) av vuxna markör sukras-Isomaltase (SIS) ökas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll beskriver odling av sena foster tarm organoider för långvarig tid att efterlikna Suckling till avvänjning övergång in vitro-. Mognaprocessen är lika med tempot in vivo och avslutas efter en månad i kulturen. Nedströms analys av denna kultur med hjälp av kvantitativa RNA och protein tekniker är detaljerade.

I detta protokoll används primära tarmceller från E18-E20 mus embryon. Den utvecklingsstadium av primära musceller som används för att generera organoider för detta protokoll är särskilt viktigt. Använda tidigare utvecklingsstadiet kommer att resultera i generering av intestinal spheroids som upprätthåller deras specifika foster genuttryck under en längre tid med begränsad övergång till vuxna organoider15,16. Endast sena fosterstadiet spheroids är kapabla att transitera till vuxna organoider in vitro-10. För att maximera fönstret av möjligheter med avseende på effekterna av extrinsic faktorer på Gut mognad, tarmar från sena fosterstadiet rekommenderas och inte tarmarna från födda ungar som har utsatts för mikrober och modersmjölk. Det rapporteras att vissa bakteriella metaboliter och mjölk komponenter kan fungera som modifierare av mogningen processen17.

För att få tillräckliga mängder av celler för att bibehålla kulturen i en månad för att studera hela mogningen från födseln upp till vuxen ålder, medan insamling av proverna för nedströms analyser, tarmarna från 6-8 embryon bör användas som utgångsmaterial. Det är att föredra att använda embryon från samma utvecklingsstadiet för att skapa kulturen. Vi rekommenderar inte att samla olika kullar som små skillnader i utvecklingsstadiet kan påverka uttrycket av mognads gener.

Det protokoll som beskrivs här står för Organoid generation från proximala och distala tunntarmen för att bibehålla utvecklingsfunktioner i olika segment av tarmen. Som ett alternativ, hela tarmen kan användas för att undersöka övergripande mognad med avseende på öka/minska uttrycket av de specifika markörer. I det senare fallet skulle färre embryon kunna användas för att isolera tarmceller för att starta kulturen.

Detta protokoll är utvecklat med hjälp av tredimensionell Organoid kulturer. Som organoider genomgår dynamisk tillväxt i kulturen, är det viktigt att samla in prover för nedströms analyser på samma gång punkt efter passaging. I detta protokoll har vi valt dag 3 efter passage, eftersom det representerar medellång tid mellan två splittringar där organoider innehåller robusta knoppar och lite eller ingen celldöd. En alternativ tidspunkt efter passaging kan användas, men det bör vara konsekvent under hela experimentet. Vi rekommenderar inte växande organoider i mer än 7 dagar efter en passage, som ökning av död celler i Organoid lumen kan påverka resultaten.

I våra experiment har vi använt dexametason som ett exempel på en extrinsic faktor som visas och bäst studeras i litteraturen för att påskynda intestinal mognad in vivo9,18. Dexametason utövar sina effekter via både genomiska och icke-genomiska vägar. Till exempel, på nivån för genomisk reglering, en brådmogen ökning av SIS mRNA nivåer kan observeras. På en icke-genomisk nivå, vi Observera förändringar i aktiviteten av matsmältningsenzymer såsom trehalase. Båda är i enlighet med beskrivna specifika aspekter av dexametason på eller sukras genaktivering och icke-genomisk aktiverande effekt på intestinal borste gräns enzymer observerade in vivo19. Det faktum att extrinsic faktorer, som syntetiska glukokortikoider, kan modulera vissa aspekter av Suckling till avvänjning övergång i Organoid kulturen, på samma sätt som beskrivs i vivo, ytterligare etablerar mus fetala tarm organoider som en modell för utredning av olika typer av modulatorer av Gut mognad.

Även om den morfologiska mogningen av mänskligt intestinal epitel är avslutad i livmodern vid graviditetsdiabetes skede av 22 veckor, den tarmbarriären funktionen mognar till barndomen i en nära relation med vilken typ av utfodring, utveckling av bakterieflora och Immunsvar. På grund av den begränsade tillgången på mänskliga vävnader i dessa utvecklingsstadier, det translationella värdet av in vitro murina modell ligger i möjligheten att hög genomströmning skärmar av faktorer som kan modulera intestinal mognad, en process bevarad bland diande däggdjur.

Viktigast av allt, när det gäller djur etik inom forskningen, kan denna modell bidra till förfining av djurförsök eftersom det inte omfattar interventioner som utförs på djur. Antalet djur kan minskas ytterligare genom att omdesigna forskningsfrågor till en eller två tidspunkter av kultur som gör det möjligt att testa flera komponenter inom en kultur.

Disclosures

="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.

-->

Författarna förklarar ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 1:1 Invitrogen 12634-028
Arginase Activity Assay Kit Sigma-Aldrich MAK112-1KT
B27 supplement Invitrogen 17504-044 100x
BCA protein assay Kit Fisher 10741395
Cell lysis buffer Cell Signaling Technology 9803S
Cell Recovery Solution Corning B.V. 354253
Cell strainer 70µM BD/VWR 734-0003
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
EDTA Merck 10,84,18,250 EDTA Titriplex III
EGF Invitrogen PMG8045
Ethanol Merck 1,00,98,31,000
Glucose solution Sigma-Aldrich G6918
Glutamax Invitrogen 35050-038 100x
Hepes Invitrogen 15630-056 1M
Isolate II RNA Mini Kit Bioline BIO-52073
Lactose Sigma-Aldrich L3625 a-Lactose monohydrate
Maleic Buffer Sigma-Aldrich M0375 Maleic acid
Maltose Sigma-Aldrich M5885 D-(+)-Maltose monohydrate >99%
Matrigel Corning B.V. 356231 Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix
Millipore water N.A.
N2 supplement Invitrogen 17502-048 100x
n-Acetylcystein Sigma-Aldrich A9165
Noggin-conditioned media Homemade
o-dianisidine Sigma-Aldrich 191248
PBS Homemade
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 0,2 U/mL
PGO-enzyme preparation Sigma-Aldrich P-7119-10CAP capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase
p-hydroxymercuribenzoate sodium Sigma-Aldrich 55540
Rspondin-conditioned media Homemade
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
Trehalose Sigma-Aldrich T5251 D-Trehalose dihydrate
Tris-HCl Buffer Homemade
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241, (3), 199-214 (1981).
  2. Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267, (4), 584-594 (1994).
  3. Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251, (1), 103-110 (1986).
  4. Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
  5. Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42, (5), 1062-1069 (1997).
  6. Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (22), 10335-10339 (1994).
  7. Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
  8. Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82, (1), 91-95 (1985).
  9. Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264, (2), 306-311 (1993).
  10. Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20, (2), (2019).
  11. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  12. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
  13. Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44, (2), 169-172 (1984).
  14. Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14, (3), 376-392 (1966).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13, (6), 734-744 (2013).
  16. Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5, (2), 421-432 (2013).
  17. Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64, (2), 296-301 (2017).
  18. Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49, (6), 782-788 (2001).
  19. Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74, (1), 9-21 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics