झिल्ली परिपक्व आदिपोसाइट समग्र संस्कृतियों (MAAC) का उपयोग कर मानव परिपक्व Adipocytes की अलगाव और संस्कृति

Biology
 

Summary

झिल्ली परिपक्व आदिपोसाइट समग्र संस्कृति (एमएएसी) परिपक्व मानव आदिपोसाइट्स संस्कृति के लिए एक नई विधि है। यहां हम विस्तार से कैसे मानव adipose से adipocytes अलग करने के लिए और कैसे MAAC स्थापित करने के लिए ।

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Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC). J. Vis. Exp. (156), e60485, doi:10.3791/60485 (2020).

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Abstract

सफेद एडीपोज ऊतक (वाट) डिस्रेगुलेशन इंसुलिन प्रतिरोध और टाइप 2 मधुमेह (T2D) के विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। T2D के लिए नए उपचार विकसित करने के लिए, अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो आदिपोसाइट मॉडल की आवश्यकता है। यह अध्ययन परिपक्व मानव आदिलोकेट को अलग करने और संस्कृति को अलग करने के लिए एक नई तकनीक का वर्णन करता है। यह विधि एमएएसी (झिल्ली परिपक्व आदिपोसाइट समग्र संस्कृति) का हकदार है, और विट्रो मॉडल में अन्य आदिपोसाइट की तुलना में, एमएएसी के पास एक एडिपोजेनिक जीन हस्ताक्षर है जो हौसले से अलग परिपक्व आदिपोसाइट्स के निकटतम है। MAAC का उपयोग करना, adipocytes दुबला और मोटापे से ग्रस्त रोगियों से सुसंस्कृत किया जा सकता है, विभिन्न एडीपोज डिपो, विभिन्न सेल प्रकार के साथ सह-संस्कारी, और महत्वपूर्ण बात, 2 सप्ताह के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है। ग्लूकोज तेज, लिपोजेनेसिस और लिपोलिसिस सहित एमएएसी पर कार्यात्मक प्रयोग भी किए जा सकते हैं। इसके अलावा, MAAC विविध औषधीय पीड़ावाद का मजबूती से जवाब देता है और इसका उपयोग भूरे रंग की वसा कोशिकाओं में सफेद आदिपोसाइट्स के स्थानांतरण सहित आदिपोसाइट फेनोटाइपिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मोटापे और मोटापे से संबंधित सह-रुग्णताओं में दुनिया भर में वृद्धि के लिए नए चिकित्सा विज्ञान के विकास की आवश्यकता है । सफेद एडीपोज ऊतक (वाट) पूरे शरीर के चयापचय, ऊर्जा होमोस्टोसिस का एक महत्वपूर्ण नियामक है, और इंसुलिन प्रतिरोध और टाइप 2 मधुमेह (T2D)1,2के विकास में एक केंद्रीय खिलाड़ी है। पुरानी अतिरिक्त कैलोरी खपत के दौरान, आदिपोसाइट्स ऊर्जा के अधिशेष को संभालने के लिए विस्तारकरते हैं। हालांकि, आदिपोसाइट लिपिड भंडारण क्षमता पार हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप फैटी एसिड के परिसंचारी स्तर की ऊंचाई और परिधीय गैर-एडीपोज ऊतकों में भंडारण में वृद्धि हुई है और लिपोटॉक्सिकिटी3,4का नेतृत्व किया जा सकता है।

उच्च अनुवाद प्रासंगिकता के साथ विट्रो मॉडल में एडीपोसाइट की कमी मोटापे और T2D के लिए नए उपचार के विकास में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। पूर्व वीवो एक्सप्लांट मॉडल, जहां एडीपोस ऊतक के छोटे टुकड़े सुसंस्कृत हैं, हाइपोक्सिया और सूजन5,6द्वारा संचालित आदिपोजेनिक जीन अभिव्यक्ति में तेजी से परिवर्तन से जुड़ा हुआ है। छत संस्कृतियों (सीसीएस) जहां परिपक्व adipocytes नाव और मीडिया से भरे फ्लास्क के शीर्ष का पालन, तेजी से फाइब्रोब्लास्ट की तरह लिपिड7,8,9,10की कमी कोशिकाओं में विभेद । सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला मॉडल प्रतिबद्ध अग्रदूतों से विट्रो में अंतर किया जाता है। विभेदित कोशिकाएं, हालांकि, वीवो में परिपक्व आदिपोसाइट्स से रूपात्मक रूप से अलग हैं क्योंकि वे आकार में बहुत छोटे हैं और एक एक यूनीलोकुलर लिपिड बूंद की कमी है। इस मॉडल के साथ अन्य सीमाओं में भेदभाव को चलाने के लिए रासायनिक कॉकटेल की अशारीरिक आवश्यकता के साथ-साथ विभेदन दक्षता में परिवर्तनशीलता शामिल है जो11,12,13,14कारकों से प्रभावित हो सकती है।

हमने हाल ही में झिल्ली परिपक्व आदिपोसाइट समग्र संस्कृति (एमएएसी) विकसित की है, जो हौसले से अलग परिपक्व आदिपोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक विधि है, जहां आदिपोसाइट्स को प्रतिकार झिल्ली10के तहत सुसंस्कृत किया जाता है। आरएनए अनुक्रमण डेटा के निष्पक्ष विश्लेषण से पता चला है कि एडीपोज ऊतक एक्सप्लांट और इन विट्रो-विडिएटेड एडीपोसाइट्स के सापेक्ष, एमएएसी सबसे हौसले से अलग-थलग आदिपादों के समान है। MAAC का उपयोग परिपक्व आदिपोसाइट्स को चमड़े के नीचे और आंत के ऊतकों से अलग करने के साथ-साथ मोटापे से ग्रस्त और दुबला दोनों विषयों से एडीपोसाइट्स के लिए किया जा सकता है। यह पद्धति दीर्घकालिक आदिपोसाइट फेनोटाइपिक परिवर्तनों के अध्ययन की अनुमति देती है और अन्य सेल प्रकारों के साथ एडीपोसाइट्स की सह-संस्कृति की सुविधा प्रदान करती है। यहां हम मानव एडीपोस ऊतक से परिपक्व आदिपोसाइट्स के अलगाव और एमएएसी प्रणाली को स्थापित करने के तरीके के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

   

Protocol

स्वीडन के गोथेनबर्ग में साहलग्रेन्स्का विश्वविद्यालय अस्पताल में वैकल्पिक सर्जरी कराने वाली महिला रोगियों के पेट क्षेत्र से एडीपोज ऊतक के गुमनाम नमूने एकत्र किए गए । ऊतक के उपयोग के लिए लिखित सूचित सहमति देने से पहले सभी अध्ययन विषयों को लिखित और मौखिक जानकारी प्राप्त हुई। इन अध्ययनों को स्वीडन के गोथेनबर्ग में क्षेत्रीय नैतिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

नोट: विधि का अवलोकन चित्र 1में प्रदान किया जाता है ।

1. बफर, ऊतक संस्कृति मीडिया, और संस्कृति प्लेटों की तैयारी

  1. एक 5x क्रेब्स रिंगर (केआर) स्टॉक तैयार करें, जो कि एनसीएल के 35.1 ग्राम, केसीएल के 1.75 ग्राम, KH2PO4के 0.82 ग्राम और 900 मीटर पानी में एमजीएसओ4·7H2O का 1.48 ग्राम है। सीएसीएल 2 ·2एच2के 1.84 ग्राम जोड़ें और पानी जोड़कर वॉल्यूम को 1 एल में एडजस्ट करें। बाँझ फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 5x KR स्टॉक से, 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM ग्लूकोज, और 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) (धोने बफर के रूप में इसके बाद संदर्भित) युक्त बफर के 1 एल तैयार करें । पीएच को 7.4 पर समायोजित करें।
  3. कोलेजेनेज बफर के 500 मीटर तैयार करें जिसमें 1x एचबीएस + सीएसीएल2 + एमजीसीएल2,2% बीएसए, और 450 मिलीग्राम पानी (पाचन बफर के रूप में इसके बाद संदर्भित)।
    नोट: कोलेजन को पाचन बफर में तब तक नहीं जोड़ा जाना चाहिए जब तक कि एडीपोस ऊतक को चरण 2.2 में तौला न जाए।
  4. मध्यम 199 के पीएच को 7.4 से समायोजित करें।
  5. बाँझ फिल्टर दोनों बफ़र्स और मध्यम 199 एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर फ्लास्क के माध्यम से और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म.
    नोट: समय बचाने के लिए, ऊतक संस्कृति मीडिया तैयार किया जा सकता है और एडीपोज ऊतक प्रसंस्करण से पहले प्लेटों में जोड़ा जा सकता है। 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप(चित्रा 1ए)के लिए, Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम/हैम के पोषक तत्व मिश्रण F12 (DMEM/F12), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप) और 20 एनएम इंसुलिन का उपयोग करें । वांछित लेआउट में मीडिया के लिए इस समय छोटे अणुओं और अन्य स्थिर औषधीय एजेंटों को भी जोड़ा जा सकता है। प्लेटों को टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।

2. मानव चमड़े के नीचे आदिपोस ऊतक का विच्छेदन

नोट: एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर काम करते हैं और अलगाव की प्रक्रिया में बाँझ तकनीक का उपयोग करें, साथ ही साथ ऑटोक्लेव और बाँझ उपकरणों का विशेष उपयोग करें।

  1. मानव एडीपोज ऊतक को 15 सेमी पेट्री डिश में रखें और विच्छेदन के दौरान इसे मॉइस्चराइज्ड रखने के लिए मध्यम 199 की एक छोटी मात्रा जोड़ें।
  2. एक गोल्फ की गेंद के आकार को लगभग एडीपोज के टुकड़ों के साथ काम करना, चिमटी के साथ बड़े फाइब्रोटिक जहाजों को समझना और बंद कैंची के पीछे के साथ एडीपोज को स्क्रैप करके धीरे से एडीपोसाइट्स को छोड़ना। फाइब्रोटिक ऊतक के बड़े टुकड़ों को त्यागें। छंटनी की गई चर्बी का वजन करो।

3. कोलेजेनेज उपचार

  1. 1 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता पर पाचन बफर (चरण 1.3 देखें) में कोलेजेनेस जोड़ें। बाँझ एक 0.22 μm बाँझ फिल्टर का उपयोग कर समाधान फिल्टर।
    नोट: वसा के प्रति ग्राम पाचन बफर के तीन mL की सिफारिश की जाती है (यानी, 100 ग्राम वसा के लिए, 300 मिलीग्राम प्रकार 2 कोलेजेनेस के साथ पाचन बफर का 300 मिलीग्राम तैयार करें)।
    सावधानी: टाइप 2 कोलेजेनेस आंखों, त्वचा के लिए खतरनाक है और श्वसन जलन का कारण बन सकता है। दस्ताने, आंखों की सुरक्षा पहनें, और कोलेजेनेज़ को संभालते समय हवादार हुड में काम करें।
  2. लगभग 10 ग्राम एडीपोज ऊतक को 15 सेमी पेट्री डिश में ले जाएं और वसा को घुमावदार कैंची की एक जोड़ी का सावधानीपूर्वक उपयोग करते रहें जब तक कि यह एक चिकनी समरूप मिश्रण न हो जाए और एडीपोज के कोई बड़े टुकड़े नहीं बचे हैं। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी वसा को संसाधित न कर दिया जाए।
    नोट: प्रत्येक दौर में लगभग 2 मिन लेना चाहिए और एडीपोस टुकड़े काफी छोटे होने चाहिए ताकि उन्हें एक व्यापक बोर पिपेट टिप का उपयोग करके पाइप किया जा सके। यह कदम उच्च गुणवत्ता वाले आदिपादों को पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि टुकड़े बहुत बड़े हैं, पाचन समय बढ़ाया जाना होगा, सेल viabilty समझौता ।
  3. चम्मच का उपयोग करके कीमा बनाया हुआ वसा को 50 मिलीएल शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक का 10 मिलीएल और पाचन बफर का 30 मिलीएल जोड़ें। यदि कीमा बनाया हुआ वसा के 10 मिलील से कम उपलब्ध है तो उचित मात्रा में स्केल करें।
  4. 30−45 मीटर के लिए 150 आरपीएम पर लगातार आंदोलन के साथ एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक पचा। 30 मिन के बाद, अधिक पाचन से बचने के लिए हर 5 इंच प्रक्रिया पर जांच करें।
    नोट: पाचन पूरा हो जाता है जब एडीपोस समाधान किसी भी बड़े टुकड़ों के बिना समरूप होता है और एक खुबानी रंग होता है।

4. सेल निलंबन और परिपक्व Adipocytes के शुद्धिकरण का निस्पंदन

  1. एक कीप को 1 एल बाँझ फ्लास्क के शीर्ष पर रखें और कीप के अंदर बाँझ 250 माइक्रोन जाल फिल्टर रखें। पचाए गए ऊतकों को हटाने के लिए फिल्टर में पचाया हुआ वसा समाधान डालें।
  2. जब सभी एडिपोसाइट निलंबन फ़िल्टर के माध्यम से पारित हो गया है, तो धीरे-धीरे आदिपोसाइट्स की उपज को बढ़ाने के लिए जाल फिल्टर निचोड़ें। इसे कुल्ला करने और फिल्टर को फिर से निचोड़ने के लिए फिल्टर में लगभग 50−100 मीटर वॉश बफर डालें।
  3. फ्लास्क से अलग-अलग एडिपोसाइट निलंबन को पृथक्करण फ़नल में डालें और तब तक धोने के बफर जोड़ें जब तक कि कीप लगभग पूरी तरह से भरा न हो जाए। बफर के साथ एडीपोसाइट निलंबन को मिलाने के लिए कई बार कीप को धीरे से उलटना।
  4. निलंबन 2−3 मिनट के लिए खड़े होने दें जब तक कि परिपक्व आदिपोसाइट्स और मुफ्त लिपिड वाली एक शीर्ष पीली परत और बफर और एडीपोज स्ट्रोमा संवहनी अंश (एसवीएफ) युक्त एक निचली परत नहीं होती है।
  5. जुदाई कीप पर नोजल खोलें, और धीरे-धीरे नीचे के समाधान को बाँझ फ्लास्क में एकत्र करें (एसवीएफ से कोशिकाओं को 7 मिन के लिए 200 x ग्राम पर केंद्रीकरण के बाद गोली और एकत्र किया जा सकता है)। पृथक्करण कीप में परिपक्व आदिपोसाइट्स के साथ शीर्ष परत रखें।
  6. परिपक्व आदिपोसाइट्स को अच्छी तरह से धोने और कोलेजेनेस को हटाने के लिए चरण4.3−4.5 तीन बार धोने की प्रक्रिया दोहराएं।

5. परिपक्व आदिपोसाइट्स की पैकिंग

  1. नोजल खोलें और शुद्ध परिपक्व आदिपोसाइट निलंबन को 50 मीटर शंकुई ट्यूबों में इकट्ठा करें।
  2. 3 मिन के लिए 50 x ग्राम पर ट्यूबकिंग करके परिपक्व आदिपोसाइट्स को हल्के से पैक करें।
  3. एडीपोसाइट निलंबन के नीचे शेष वॉश बफर को हटाने के लिए 18 जी सुई और सिरिंज का उपयोग करें।
  4. एक पिपेट का उपयोग करके परिपक्व आदिपोसाइट्स के शीर्ष पर तैरते हुए मुफ्त लिपिड परत (आइपोसाइट्स के छोटे हिस्से से तेल जो अलगाव प्रक्रिया के दौरान टूट गया) निकालें।
    नोट: जोखिम को कम करने के लिए कि आदिपोसाइट्स चरण 6.5 में झिल्ली को ड्रिप करेंगे, यह महत्वपूर्ण है कि परिपक्व आदिपोसाइट्स को झिल्ली पर वरीयता प्राप्त होने पर लिपिड परत और सभी वॉश बफर को हटा दिया गया है। इस कारण से 3 ट्यूबों में आदिपोसाइट्स इकट्ठा होते हैं। पिछले एकत्र किए गए नमूनों में सबसे अधिक कैरीओवर लिपिड होगा और इसलिए यह सबसे कम गुणवत्ता का होगा। हालांकि, सावधानीसे पाइपिंग के साथ इन नमूनों का उपयोग किया जा सकता है।

6. परिपक्व आदिपोसाइट्स की सीडिंग

  1. प्रतिकार झिल्ली आवेषण(सामग्री की तालिका)युक्त पैकेज खोलें और झिल्ली घटक को बाहर निकालें। इसे उल्टा फ्लिप करें और बाँझ सतह पर रखें ताकि झिल्ली छत का सामना कर सके।
  2. प्रत्येक झिल्ली पर पैक परिपक्व आदिपोसाइट्स के पिपेट 30 माइक्रोन(चित्र 1सी)। टिप के साथ झिल्ली को छूने से बचें। कोशिकाओं को बीज देने के लिए चौड़े बोर पिपेट युक्तियों का उपयोग करें, या इसे व्यापक बनाने के लिए एक पिपेट टिप के एक छोटे से टुकड़े को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  3. धीरे से सीडिंग प्रक्रिया में कई बार पैक किए गए एडीपोसाइट्स के साथ 50 मिलीग्राम ट्यूबों को उलटना ताकि विभिन्न आकारों के साथ एडीपोसाइट्स का वितरण सुनिश्चित किया जा सके।
  4. इनक्यूबेटर से मीडिया युक्त तैयार मल्टीवेल प्लेट्स को बायोसेफ्टी कैबिनेट में लाएं और ढक्कन हटा दें। आदिपोसाइट्स के साथ वरीयता प्राप्त झिल्ली उठाओ और इसे नीचे से समझ लें ताकि इसे चरण 6.5 में उलटा किया जा सके।
  5. एक चिकनी आंदोलन में शीर्ष पर आदिपोसाइट्स के साथ झिल्ली उलटा ताकि वरीयता प्राप्त आदिपोसाइट्स अब नीचे का सामना कर रहे हैं(चित्रा 1डी)। मीडिया(चित्रा 1ई)युक्त कुओं में आदिपोसाइट्स के साथ थाली कम करें।
  6. थाली पर ढक्कन रखो और ध्यान से एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली हस्तांतरण । प्लेट के तेजी से आंदोलन से बचें क्योंकि एडीपोसाइट्स को आसानी से शुरू में उखाड़ फेंका जा सकता है।
    नोट: कोशिकाओं को झिल्ली का अधिक दृढ़ता से पालन करने में कुछ दिन लगते हैं।

7. विश्लेषण के लिए आदिपोसाइट्स और हार्वेस्टिंग का रखरखाव

  1. कम से कम हर 7 दिन में मीडिया बदलें। प्रत्येक झिल्ली डालने में कटआउट छेद के माध्यम से मीडिया जोड़ें और जोड़ें। मीडिया को हटाने के लिए, एक सिरिंज और एक सुई, एक aspirating छड़ी, या एक p200 टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करें । मीडिया को जोड़ने के लिए, एक पिपेट का उपयोग करें और धीरे-धीरे दीवार के किनारे कुओं में नए मीडिया को पिपेट करें ताकि आदिपोसाइट्स को परेशान करने से बचा जा सके।
    नोट: Adipocytes 7 दिनों के बाद एक मीडिया परिवर्तन के साथ 2 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया गया है । हालांकि, विभिन्न adipose मूल और प्रयोगात्मक सवालों में वृद्धि हुई मीडिया परिवर्तन से लाभ हो सकता है ।
  2. आरएनए की कटाई के लिए, चरण 7.1 में वर्णित मीडिया को हटा दें, और कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए सीधे कुओं में लिसिस बफर(सामग्री की तालिका)के 500 माइक्रोन जोड़ें। इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, 1% की अंतिम एकाग्रता पर सीधे फॉर्मलडिहाइड को अच्छी तरह से जोड़ें।
    नोट: कोशिकाओं को फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

Representative Results

एमएएसी के रूप में सुसंस्कृत परिपक्व आदिपोसाइट्स उनके कार्य, फेनोटाइप को संरक्षित करता है, और विभिन्न औषधीय उपचारों के लिए आदिपोसाइट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद MAAC चमड़े के नीचे एडीपोज ऊतक से अलग विशेषता एक्युकुलर लिपिड बूंद केवल परिपक्व आदिपोसाइट्स(चित्रा 2ए)में पाया बनाए रखने । MAAC 1 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत था, जबकि या तो PPARο agonists rosiglitazone (Rosi) और pioglitazone (Pio), या ग्लूकोकॉर्टिकोइड रिसेप्टर (जीआर) एगोनिस्ट dexamethasone (Dex) के साथ इलाज के लिए निर्धारित करने के लिए अगर अलग परमाणु हार्मोन रिसेप्टर (NHR) aAC में डाउनस्ट्रीम लक्ष्य जीन जीन में परिवर्तन की भविष्यवाणी की । रोजी और पीआईओ ने पीपीआरए उत्तरदायी जीन FABP4 और एलपीएल की अभिव्यक्ति में क्रमशः 4 और 2−3 गुना वृद्धि की, जबकि डेक्क्स्टेथेसोन का कोई प्रभाव नहीं पड़ा(चित्रा 2बी)। इसी तरह, dexamethasone मजबूती से जीआर लक्ष्य जीन APOD और FKBP5 के जीन अभिव्यक्ति क्रमशः 13-और ५५ गुना द्वारा चलाई, जबकि PPARο agonists कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था । हमने पहले यह दर्शाया है कि ताजे अलग-थलग मानव परिपक्व सफेद आदिपोसाइट्स रोजी10के साथ इलाज करते समय एमएएसी में भूरे रंग के फेनोटाइप में अंतर कर सकते हैं। रोजी या पीआईओ के साथ 7 दिन के उपचार ने ब्राउन फैट-विशिष्ट जीन यूसीपी1 की जीन अभिव्यक्ति को 44-65 गुना तक प्रेरित किया, साथ ही ब्राउन फैट मार्कर पीडीके4 12-18 गुना(चित्रा 2सी)की अभिव्यक्ति में वृद्धि की।

Figure 1
चित्र 1: MAAC सेटअप के दृश्य आरेख । (A)माध्यम की तैयारी। (ख)परिपक्व आदिपोसाइट्स का अलगाव और पैकिंग। (ग)झिल्ली पर परिपक्व आदिपोसाइट्स को बोना। (D)आदिपोसाइट्स को संलग्न रखते हुए झिल्ली को उलटना। (ई)झिल्ली को माध्यम में कम करना और माध्यम बदलना। इस आंकड़े को नुकसान पहुंचाता है एट अल10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: MAAC एक सप्ताह के माध्यम से एक्युलर उपस्थिति बनाए रखता है और विविध औषधीय पीड़ावाद का जवाब । (क)संस्कृति के एक सप्ताह के बाद MAAC के प्रतिनिधि 4x और 10x उज्ज्वल क्षेत्र छवियां । एडिपोसाइट्स जिनका औसत व्यास 100 माइक्रोन होता है जिसमें बड़े यूनिलोकुलर लिपिड की बूंदें आसानी से प्रांयक होती हैं। (B)एमआरएनए लक्ष्य जीन और ग्लूकोकॉर्टिकोइड रिसेप्टर (जीआर) का स्तर वाहन (वीएचसी), रोसिग्लिटाजोन (रोजी), पिओग्लिटाजोन (पीआईओ), या डेक्सफेथसोन (डेक्स) के साथ उपचार के 7 दिनों के बाद एमएएसी में जीआइसी में जीन को लक्षित करता है। रोजी, पीआईओ और डेक्स सभी का उपयोग 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर किया जाता था।(सी)वाहन (वेएचसी), रोसिग्लिटाजोन (रोजी), पिओग्लिटाजोन (पीआईओ), या डेक्सके साथ उपचार के 7 दिनों के बाद एमएएसी में भूरे वसा से समृद्ध जीन के एमआरएनए स्तर। रोजी, पीआईओ और डेक्स सभी का उपयोग 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर किया जाता था। सभी जीन अभिव्यक्ति डेटा के लिए, टाटा-बाइंडिंग प्रोटीन (टीबीपी) का उपयोग आंतरिक सामान्यीकरण नियंत्रण के रूप में किया गया था। आंकड़ों की गणना तुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA का उपयोग कर के लिए की गई थी । (मतलब ± एसडी, एन = 3, * पी एंड एलटी; ०.०५; * * पी एंड एलटी; ०.०१; ***पी एंड एलटी; ०.००१) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

   

Discussion

झिल्ली परिपक्व आदिपोसाइट समग्र संस्कृति (एमएएसी) हौसले से अलग परिपक्व आदिपोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक नई विधि है। MAAC की स्थापना में प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जो परिपक्व आदिपोसाइट्स की उपज, गुणवत्ता और व्यवहार्यता को बहुत प्रभावित करते हैं। बहुत प्रयास चरण 3.2 में वसा कीमा बनाने में रखा जाना चाहिए क्योंकि यह कदम सीधे कोलेजेनेज़ के संपर्क में आने वाले समय की मात्रा को प्रभावित करता है। यदि एडीपोज के टुकड़े बहुत बड़े हैं, तो पाचन समय को बढ़ाना होगा जो कोशिकाओं की व्यवहार्यता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। इसके विपरीत, यदि ऊतक कैंची के साथ बहुत पतले संसाधित किया जाता है, तो व्यवहार्यता को भी प्रभावित किया जा सकता है। MAAC के रूप में परिपक्व adipocytes की सफल संस्कृति के लिए, एक निम्नलिखित कदम ों पर विशेष ध्यान देना चाहिए: झिल्ली पर आदिपोसाइट्स के सफल बोने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि मुक्त लिपिड और कैरीओवर वॉश बफर परिपक्व आदिपोसाइट्स से हटा दिया जाता है चरण 5.3 और 5.4 में। शेष लिपिड या वॉश बफर एडीपोसाइट्स की सतह तनाव को कम करेगा और फ़्लिप होने पर झिल्ली को टपकाने वाले आदिपोसाइट्स के जोखिम को बढ़ा देगा। जब एडिपोसाइट्स को वरीयता दी जाती है और मीडिया में, कोशिकाएं मुख्य रूप से उछाल के माध्यम से झिल्ली के संपर्क में रहती हैं, इस प्रकार कोशिकाओं को खोने के लिए मीडिया को बदलते समय एक धीमी और कोमल तकनीक की सिफारिश की जाती है। कुओं के नीचे से मीडिया को हटा दें के रूप में चरण ७.१ में वर्णित है और धीरे से दीवारों के किनारों नीचे मीडिया pipetting द्वारा मीडिया जोड़ें । अंत में, एक समय की बचत सुझाव के लिए मीडिया और उपचार के साथ प्लेटों को तैयार करने के लिए adipocyte अलगाव की प्रक्रिया से पहले है । विशेष रूप से जटिल प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए, प्लेटों को पूर्व-तैयार करने से अधिक समय बचाया जा सकता है और यह सुनिश्चित करता है कि जैसे ही वे अलग-थलग होते हैं, आदिपोसाइट्स को उनके उपचार के साथ मीडिया में रखा जाता है।

अलग-अलग पेडिपोसाइट्स की तुलना में एमएएसी का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि इस्तेमाल किए गए एमएएसी मीडिया बहुत सरल है और इसके लिए अस्वास्थ्यकर हार्मोन कॉकटेल की आवश्यकता नहीं है। यहां हम ग्लूकोज से भरपूर मीडिया (DMEM/F12), 10% FBS, 1% पेन/स्ट्रीप, और 20 एनएम इंसुलिन में MAAC सुसंस्कृत है । महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने पाया है कि यूसीपी110के रोसिग्लिटाजोन/पिओग्लिटाजोन संचालित इंडक्शन के लिए इंसुलिन की बिल्कुल आवश्यकता है । हालांकि, इंसुलिन को कोशिकाओं के एडिपोजेनिक फेनोटाइप को बनाए रखने की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, इंसुलिन को शामिल या छोड़ा जा सकता है।

ऊपर विस्तृत प्रक्रिया मानव आदिपादियों के अलगाव और संस्कृति के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, माउस, और संभवतः अन्य जीव के आदिपोसाइट्स को एमएएसी के रूप में भी सुसंस्कृत किया जा सकता है। यदि माउस एडीपोसाइट्स को MAAC के रूप में सुसंस्कृत किया जाना है तो अतिरिक्त विचार और सावधानियां हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। हमने पाया है कि चूहों से परिपक्व आदिपोसाइट्स मनुष्यों की तुलना में बहुत अधिक नाजुक हैं। नतीजतन, पाचन समय को सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए एक पूर्ण न्यूनतम तक छोटा किया जाना चाहिए। हमने यह भी पाया कि युवा चूहों (8 सप्ताह पुराने और छोटे) से adipocytes सबसे मजबूत और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान की है । अंत में, माउस MAAC को एक सप्ताह तक के लिए संस्कारित किया जा सकता है, हालांकि यह देखते हुए कि उनके आदिपोजेनिक फेनोटाइप मनुष्यों की तुलना में कम स्थिर दिखाई देता है (जिसे कम से कम दो सप्ताह के माध्यम से सुसंस्कृत किया जा सकता है) हम पता करने के लिए न्यूनतम आवश्यक समय के लिए माउस एमएएसी को संजोने की सलाह देते हैं प्रायोगिक प्रश्न।

चूंकि एमएएसी मॉडल चालयोग्य झिल्ली का उपयोग करने पर आधारित है, इसलिए इस तकनीक का एक लाभ अन्य सेल प्रकारों के साथ परिपक्व आदिपोसाइट्स को सह-खेती करने की संभावना है। हमने पहले एमएएसी10के उपयोग के माध्यम से परिपक्व आदिपासाइट्स और मैक्रोफेज की क्रॉसटॉक करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है । यह मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं15,16,17के बीच संबंध का पता लगाने के अवसरों को खोलता है । भविष्य के प्रयोगों में अन्य सेल प्रकारों जैसे हेपेटोसाइट्स, पीरीडपोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं, या अग्नाशय कोशिकाओं को शामिल किया जा सकता है ताकि एमएएसी मॉडल की जटिलता और अनुवादीय प्रासंगिकता को और बढ़ाया जा सके और कई सेल प्रकारों के बीच क्रॉसटॉक की जांच की जा सके।

हालांकि MAAC को विट्रो मॉडल में अन्य आदिपोसाइट के सापेक्ष एडीपोसाइट की कार्यक्षमता और पहचान बनाए रखने में बेहतर दिखाया गया है, फिर भी इसमें सीमाएं हैं जिन पर विचार करने की आवश्यकता है। अग्रदूत कोशिकाओं से अलग-अलग आदिपोसाइट्स का उपयोग करने की तुलना में, एमएएसी एक अधिक श्रमसाध्य और समय लेने वाला मॉडल है। नियमित सेल कल्चर प्लेटों की तुलना में झिल्ली के साथ प्लेटें भी अधिक महंगी होती हैं। महत्वपूर्ण बात, परिपक्व adipocytes को सीडिंग पर हर बार हौसले से अलग-थलग करने की आवश्यकता होती है और अग्रदूत कोशिकाओं जैसे शेयरों में विस्तार या जमे हुए नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, यह ताजा सफेद एडीपोज ऊतक नमूनों के लिए उपयोग होने की आवश्यकता है, लेकिन यह भी दाता से दाता विविधताओं के लिए उपजी जटिलता का एक स्तर कहते हैं ।

यहां हमने मानव परिपक्व आदिस्थानों को अलग-थलग करने और एमएएसी की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । हमने दिखा दिया है कि MAAC के रूप में सुसंस्कृत adipocytes दो सप्ताह के माध्यम से व्यवहार्य रहता है, उनके आदिपोजेनिक जीन हस्ताक्षर संरक्षित है, और वे विविध औषधीय पीड़ावाद का जवाब । MAAC का उपयोग करके क्रॉस-टॉक बेटवीन एडीपोसाइट्स और अन्य सेल प्रकारों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, और विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में परिपक्व आदिपोसाइट्स के दीर्घकालिक फेनोटाइपिक परिवर्तनों का आकलन।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम संसाधन प्रदान करने और आदिपोसाइट अलगाव, तकनीकी सहायता के लिए मार्टिन उहर्बीएम, और मानव आदिपन प्रदान करने के लिए डैनियल ओलासन और मालिन लोन को अनुकूलित करने के लिए जिओ-रोंग पेंग और स्टीफन हल्लेन को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclaved scissors
Autoclaved spoons
Autoclaved tweezers
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A6003
Buffer RLT QIAGEN 79216 Lysis buffer
CaCl2*2H2O Sigma-Aldrich C7902
Conical tubes, 50 mL
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DMEM/F-12 Gibco 31331-028
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10270-106
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm Thermo Scientific 156-4020 500 mL
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm Thermo Scientific 158-0020 1000 mL
HBSS+CaCl2+MgCl2 Gibco 14065-49
HEPES buffer solution (1M) Gibco 15630-056
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit Applied Biosystems 4368814
Insulin (Actrapid Penfill) Novo Nordisk A/S
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 104873
Medium 199 Gibco 10012-011
Mesh filter (250 µM) Sintab AB 6111-025043
MgSO4*7H2O Sigma-Aldrich M1880
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Needles, 18 G, 1.20 mm x 40 mm Sterican 613-2948
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) Gibco 15140
Petri dishes, 150 mm x 21 mm Thermo Scientific 168381
Power SYBR Green PCR master mix Applied Biosystems 4367659
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine Applied Biosystems
RNeasy Mini kits QIAGEN 74106
Separation funnel VWR 527-0008 For large scale preparation
Separation funnel VWR 527-0005 For small scale preparation
Shaking incubator (37 °C)
Syringes, 5 mL Omnifix 612-2892 100 st
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2)
Transwells, 24-well (6.5 mm) Costar 3397 Permeable membrane inserts
TRIzol reagent Invitrogen 10296010 Lysis buffer
Type 2 Collagenase Worthington LS004177

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References

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