Anvendelse af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer til levende celle billeder af filamentøse svampe

Biology
 

Summary

Vitale fluorescerende farvestoffer er essentielle værktøjer til analyser af levende celler i moderne svampe cellebiologi. Dette papir beskriver anvendelsen af etablerede og mindre kendte fluorescerende farvestoffer til sporing af plasma membran dynamik, endo-/exocytose og cellevæg morfogenesis i filamentøse svampe.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. J. Vis. Exp. (153), e60613, doi:10.3791/60613 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anvendelsen af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer til levende celle billeddannelse analyser af organelle dynamik i svampeceller startede for to årtier siden, og siden da fortsætter med at bidrage meget til vores forståelse af de filamentøse svampe Livsstil. Dette papir giver en praktisk vejledning til udnyttelse af de to membran farvestoffer FM 1-43 og FM 4-64 og de fire cellevæg pletter Calcofluor hvid M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine hurtig Scarlet 48 og Congo rød. Fokus er på deres lavdosis applikation til at konstatere artefakt-fri farvning, deres Co-Imaging egenskaber, og deres kvantitative evaluering. De præsenterede metoder gælder for alle filamentøse svampe prøver, der kan tilberedes i de beskrevne måder. De grundlæggende farvnings tilgange kan tjene som udgangspunkt for tilpasninger af arter, der kan kræve forskellige dyrkningsbetingelser. Første, biofysiske og biokemiske egenskaber gennemgås som deres forståelse er afgørende for at bruge disse farvestoffer som virkelig vitale fluorescerende pletter. For det andet, trin-for-trin protokoller præsenteres, at detaljerne i forberedelsen af forskellige svampe prøvetyper for fluorescerende Live-Cell Imaging. Endelig illustrerer eksempler på eksperimenter forskellige tilgange til: (1) identificere defekter i den spatio-temporale organisering af endokytose i genetiske mutanter, (2) relativt karakterisere delt og distinkt samlokalisering af GFP-mærkede målproteiner i endocytic pathway, (3) identificere morfogenetiske cellevæg defekter i en genetisk mutant, og (4) overvåge cellevæg Biogenese i realtid.

Introduction

For tyve år siden blev den måde, hvorpå hyphal morfogenese og den underliggende molekylære cellebiologi kunne visualiseres i filamentøse svampe, revolutioneret ved anvendelse af membranen selektiv fluorescerende Fei Mao Dye FM 4-641. Senere, fordelen ved chitin-bindende farvestof Calcofluor hvid som vital fluorescerende markør for svampe cellevæg dynamik blev realiseret2. Siden da er både farvestoffer og varianter heraf blevet en iboende del af analyser af organisk dynamik i levende celle billeder i svampe og fortsætter med at give hidtil uset indsigt i den filamentøse svampe livsstil. Dette papir beskriver anvendelsen af etablerede og mindre kendte fluorescerende farvestoffer til sporing af plasma membran dynamik, endo-og exocytose og cellevæg morfogenesis i filamentøse svampe. Endocytose tracking assays tillade forskellige celle biologiske spørgsmål i forbindelse med den generelle undersøgelse af endokytose, der skal behandles3. Til dette, lokalisering, hastighed og rækkefølge af farvede rum ved FM farve tilsætning registreres ved timelapse mikroskopi og kvantitativt sammenlignet mellem de testede svampe stammer4. Cellevæg farvestoffer afgrænse den ydre grænse af cellen og tillade sporing af morfogenetiske hændelser, herunder polariseret hyphal tip vækst2, hyphal forgrening5, hyphal fusion6,7 og septum formation8. Endvidere, de letter kvantificeringen af lokaliserede cellevæg deposition og identifikation af defekter under cellevæg Biogenese9. Fordi detaljeret viden om de biokemiske og biofysiske egenskaber af enhver fluorescerende markør er en grundlæggende forudsætning for sin vellykkede in vivo ansøgning, disse egenskaber er først opsummeret for de seks farvestoffer featured i denne artikel.

Membran selektive farvestoffer
FM (Fei Mao) styryl farvestoffer er små amfifilic molekyler, der ikke kan passere igennem, men reversibelt associere med den ydre folder af lipid-lænden af biologiske membraner10. De er næsten ikke-fluorescerende i vandig opløsning, men bliver intenst fluorescerende ved plasma membran integration, genererer fremragende signal-til-støj (S/N)-nøgletal11. Disse egenskaber gør dem ideelle til visualisering af plasma membranen og intracellulær organelle dynamik, herunder sporing af endo-og exocytose12. Den grønne fluorescerende FM 1-43 og den røde fluorescerende FM 4-64 er de to mest udbredte fluorescerende membran markører til disse formål. SynaptoGreen C4 og SynaptoRed C2 er generiske molekyler fra alternative leverandører, der kan bruges synonymt i stedet for FM 1-43 og FM 4-64 hhv.

Styryl farvestoffer består af tre centrale strukturelle regioner: (1) den lipofile hale, der letter indsættelse af farvestoffet i lipid-billaget, (2) fluoroforet kernen, der bestemmer farvestoffets spektrale egenskaber og udgøres af to aromatiske ringe forbundet med en til tre dobbeltbindinger, og (3) det positivt ladede hydrofile hoved, der forhindrer fuldstændig indsættelse og gennemtrængning af farvestoffet via membranen (figur 1a).

Jo længere den lipofile hale, jo højere er farvestoffet hydrofobicitet og dermed bindende affinitet til membranen, men den nedre er dens vandopløselighed og membran de-farvning sats. Som følge heraf producerer forskellige FM-farvevarianter forskellige farvnings dynamik og mønstre. Den højere hydrofobiby af den C4-tailed FM 1-43 giver et stærkere og mere stabilt fluorescens signal ved plasma membraner og interne organeller hurtigere end den kortere C2-tailed FM 4-64, når det anvendes ved ækvimolære koncentrationer (figur 2).

Vigtigere, den konstante og høje Association/dissociation satser for begge FM-farvestoffer11 med gennemsnitlige retentionstider på 1 – 6 s pr individuelle farvestof molekyle13 reducere chancerne for lokaliseret forstyrrelse af membran funktion, for eksempel gennem ændring af membran fluiditet eller tvungen permanent interaktion af membran proteiner. Dette er formentlig den vigtigste grund til, at disse molekyler kan bruges som vitale farvestoffer. Ikke desto mindre er FM-farve koncentrationer over 50 μM giftige for svampe-og planteceller2,14, og evidens fra af-2-tobaks protoplaster indikerer, at mere end 20 μm FM-farvestof fører til plasma membran mætning14. Derfor er det tilrådeligt ikke at overskride denne grænse, især i betragtning af, at fremragende billeddannelse er opnået med så lidt som 2 – 5 μM15,16.

Især de spektral egenskaber af FM-farvestoffer varierer meget afhængigt af den særlige membran mikromiljø (anmeldt14). Generelt adskiller excitation og emissions spektre af FM-farvestoffer i rene opløsningsmidler (som normalt er angivet i produktinformationen) sig markant fra det i cellulære miljøer og kan i de fleste tilfælde ikke høres direkte ved valg af indstillinger for billedbehandling med levende celler. Excitation/emission Maxima af FM 1-43 og FM 4-64, for eksempel, bliver blå-forskudt med 37/46 nm og 43/64 nm, henholdsvis når de bindes til svampe membraner i forhold til deres opløsninger i methanol (tabel 1).

De banebrydende fundamentale for brugen af FM 4-64 og FM 1-43 til sporing af plasma membran, endo-/exocytose og organelle dynamik, herunder spitzenkörper og mitokondrier, er allerede blevet udførligt dokumenteret for en bred vifte af filamentøse svampearter tidligere2,4,17,18,19. Anbefalede billedbehandlings indstillinger for begge FM-farvestoffer, der virker i forskellige filamentøse svampearter, er afbildet i figur 1b. Tekniske begrænsninger af det tilgængelige udstyr eller særlige cellulære og eksperimentelle betingelser, såsom kulturmedium, pH eller temperatur, kan dog kræve nogle tilpasninger. Heldigvis opererer FM-farvestoffer over et bredt spektralområde, og meget gode billedbehandlings resultater opnås ved spændende FM 1-43 med 514 nm eller FM 4-64 med 488 nm. Derfor skal de optimale billedbehandlings indstillinger bestemmes individuelt for hver prøvetype og påtænkt anvendelse.

Den betydelige Stoke skift på mere end 135 nm FM 4-64 giver fremragende, samtidige Co-Imaging med fluorophores udsender grønt lys; Dette er ofte udnyttes til at evaluere intracellulære lokalisering dynamik af grønne fluorescerende protein (gfp)-mærket fusions proteiner i forhold til plasma membranen og endocytic pathway9,20.

Cellevæg-selektive farvestoffer
Calcofluor White M2R (CFW), også markedsført som fluorescerende Brightener 28, er formentlig den bedst kendte fluorescerende farvestof, der anvendes til at plette cellevæggene af bakterier, svampe, alger, højere planter og insekter. Oprindeligt brugt som optisk blegning agent i papir, tekstil og vaskemiddel industri, dens fordele for den kliniske diagnose af svampeinfektioner blev realiseret tidligt på21,22. Fordi CFW intercalates uigenkaldeligt ind i den spirende chitin kæde det forstyrrer normal chitin microfibril forsamling under cellevæg Biogenese derved generere cellevæg stress23. Dette udløser igen en cellevæg skade reparation mekanisme, der fører til lokalt forhøjet cellevæg deposition som følge af glucan og chitin syntase aktivering24,25. Dette fænomen kan forekomme med ethvert farvestof, der opererer ved stabilt binding til cellevæg polymerer, er koncentrationsafhængig og er mest mærkbar på hyphal tips, der repræsenterer den mest produktive voksende og dermed mest følsomme dele af mycelium (figur 3). En omfattende oversigt over de molekylære maskiner, der reagerer på cellevæg skader er for nylig blevet givet26.

Overdoseret farvestof i kombination med fototoksicitet kan føre til hurtig cellelyse af hyphal rum (film 1). Ikke desto mindre, øget følsomhed over for farvestoffer koncentrationer, der er "Vital" i den vilde type kan udnyttes til at identificere defekter i cellevæg biosyntese af gentab-af-funktion mutanter9. For CFW og Congo Red (CR), en anden tekstil farvestof også kendt som Direct Red 28 og ansat som α-og β-chitin-specifik cellevægbejdsen for svampe og insekter27,28, tærskelkoncentrationer, der stærkt inducerer chitin synthaser er blevet bestemt med > 60 μm CFW og > 70 μM CR, mens koncentrationer <15 μM af begge farvestof ikke ændre eller hæmme svampevækst29,30,31. Hickey et al. placerede denne tærskelkoncentration for CFW ved 25 μM2. Derfor er det tilrådeligt at bruge farvestoffer koncentrationer ≤ 5 μM at udelukke stress-relaterede artefakter og sikre at bruge disse molekyler som virkelig "vitale fluorescerende farvestoffer"2,32. Dette gælder også for Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) og Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkte gul 86 og direkte rød 23, henholdsvis to andre nyttige cellevæg farvestoffer, hvis ansøgning om svampe er blevet rapporteret for første gang mere end et årti siden33. Men på trods af deres bemærkelsesværdige spektral egenskaber34,35, har brugen af begge farvestoffer siden da været meget begrænset36,37. Som tidligere vist for 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF er tilstrækkelige til at løse cellevæg dynamik under indfødte forhold med meget høj tidsmæssig opløsning (film 2). De samme resultater kan opnås med 2 μM CR eller PFS.

Sammen, disse fire farvestoffer, CFW, SPF, PFS og CR, omfatter et sæt af cellevæg-selektive fluorescerende markører, der dækker næsten den komplette synlige emission lys spektrum (400 – 700 nm) udnyttes på moderne fluorescerende mikroskoper (figur 4). Den betydelige stigning i fluorescens intensitet ved binding til cellevæg polymerer er iboende til alle fire og genererer fremragende S/N-nøgletal. Dette igen tillader at holde farvestof koncentrationer og excitation lysintensitet meget lav og gør det muligt at udføre cellevæg farvning som "lav dosis" Live-Cell Imaging teknik2. Fordi disse cellevæg farvestoffer er plasma membran uigennemtrængelige, de samtidig fungerer som levende/døde pletter. Især på grund af deres ekstremt brede emissionslysspektre skal visse begrænsninger med hensyn til co-Imaging egenskaber af CFW og SPF med andre fluorophorer nøje overvejes.

Protocol

1. fremstilling af svampe prøver

  1. Svampe-præ-kulturer
    1. Inokulere den ønskede stamme på et passende solidt agar medium, såsom kartoffeldextrose agar (PDA) for Trichoderma atrovirid eller Vogels minimale medium (VMM) for neurospora crassa. Tilføj et passende markerings mærke, når du arbejder med transformant-stammer.
    2. Inkuber forkulturen ved organismens optimale temperatur. For eksempel, T. atrovirid ved 25 °C og N. crassa ved 30 °c og 12 timer/12 timer lys/mørke cyklusser, indtil en sporulerende mycelium har udviklet sig, men endnu ikke nået kanten af pladen. På en standard størrelse Petri skål (9,2 cm Ø), dette tager Wild-type T. atrovirid på 4 – 6 dage gennemsnit, mens N. crassa Wild type når dette stadie efter 3 – 4 dage i gennemsnit.
  2. Dyrkning af svampe kolonier
    1. Ved hjælp af en steril skalpel skæres en lille 3 mm x 3 mm agar blok transporterer ikke-sporulerende mycelium fra koloni kanten af præ-kultur.
    2. Agar blokken placeres i midten af en frisk solid medium plade for at inokulere forsøgs kulturen.
    3. Forsøgs kulturen skal inkubateres efter den udviklingsfase, der skal undersøges. For eksempel, den vild-type T. atrovirid kræver 20 – 22 timer ved 25 °c i mørket til at udvikle kolonier på omkring 2 cm diameter på PDA, mens den vilde-type N. crassa når koloni diametre på omkring 4 cm efter 14 – 16 h inkubation ved 30 °C i mørke på VMM.
      Bemærk: inkubation i mørket forhindrer dannelsen af pigmenter, der kan indføre Auto luorescens. For at eliminere medium baggrunds fluorescens fra den eksperimentelle kultur, Udskift agar med 1,5% w/v af en transparent solidifying agent (Se tabellen over materialer), og ethvert komplekst medium med en defineret minimal medium.
  3. Dyrkning af solide spire kulturer
    1. Brug 5 mL steril fysiologisk saltopløsning (0,9% w/v NaCl) til at høste nålens sporer fra præ-kultur pladen og Saml den resulterende spore suspension i en 15 mL skruelåg.
    2. Bland sporesuspensionen godt ved kraftig vortexning og derefter filtrere den over en 1 cm x 5 cm strimmel af sterilt filter stof (Se tabellen af materialer) let fyldt ind i en 1 ml pipettespids (både samlet og autoklave på forhånd) i et frisk sterilt rør.
    3. Find spore tætheden med et celle tælle kammer og Forbered en 1 x 107 celler/ml spore suspension med fysiologisk saltopløsning.
      Bemærk: spore affjedringen kan opbevares ved 4 °C i op til to uger.
    4. Forbered en Petri skål i standard størrelse (9,2 cm Ø) med 20 mL fast medium, og tilsæt 15 – 20 sterile glasperler (3 mm Ø) på toppen.
    5. Pipetten 200 μL af spore ophænget på medium pladen, og Distribuer cellerne jævnt over hele pladen ved at ryste forsigtigt. Saml glasperler i et bæger med 70% ethanol til genbrug.
    6. Forsøgs kulturen skal inkubateres efter den udviklingsfase, der skal undersøges. For eksempel, T. atroviride vildtype kræver 5 – 6 h ved 25 ° c i mørket for at udvikle nåle-urskive GERMLINGS på PDA, mens N. crassa Wild type udvikler nåle dial germlings efter 3 – 4 h inkubation ved 30 °C i mørke på VMM.
      Bemærk: for at eliminere medium baggrunds fluorescens fra forsøgs kulturen erstattes agar med 1,5% w/v af et gennemsigtigt solidifying middel og ethvert komplekst medium med et defineret minimalt medium.
  4. Dyrkning af flydende spirings kulturer
    1. Fyld 190 μL flydende kulturmedium ind i hver brønd af en 8-brønd Chambered mikro-slide.
    2. Der tilsættes 10 μL af en 1 x 107 celler/ml spore opløsning (tilberedt i trin 1.4.1 – 1.4.3) og blandes ved forsigtigt at pipettere op og ned et par gange. Det resulterende samlede antal celler er 1 x 105 pr. brønd.
    3. Forsøgs kulturen skal inkubateres efter den udviklingsfase, der skal undersøges. For eksempel, den vilde type T. atrovirid kræver 5 – 6 h ved 25 ° c i mørket for at udvikle nåldial germlings i kartoffel dextrose BOUILLON (FBF), mens Wild type N. crassa udvikler nåle-og kimplanter efter 3 – 4 h inkubation ved 30 °c i mørke i flydende VMM.

2. klargøring af farvestof arbejdsløsninger

  1. For at sikre fuld Opløselighed af hvert farvestof, Forbered 2 mM stamopløsninger i dimethylsulfoxid (DMSO) ved at tilføje det passende beløb (Se nøjagtige vægte i tabel 1) til 1 ml 100% DMSO og bland godt ved vortexing.
    Forsigtig: Sørg for at tage DMSO fra en septum-forseglet flaske; Det bør være en klar transparent væske. Ved kontakt med luft bliver DMSO brun – sandsynligvis på grund af oxidering af spor urenheder – og kan påvirke cellevæksten eller farve farvning negativt.
  2. Filter Steriliser stamopløsningen gennem et 0,2 μm sprøjte membranfilter i et frisk, sterilt 1,5 mL reaktions slange. For at minimere farvestof blegning, wrap røret i aluminiumsfolie.
    Bemærk: farvestof stamopløsningen kan aliciteres i mindre volumener for at undgå optønings-/fryse cyklusser og opbevares ved 4 °C i flere måneder.
  3. Tilbered en 20 μM vandig farvningsopløsning ved at opløse 2 μL Dye stamopløsning i 198 μL sterilt destilleret vand i et frisk, sterilt 1,5 mL reaktions slange. For at minimere farvestof blegning, wrap røret i aluminiumsfolie.
    Bemærk: farveprøve opløsningen skal tilberedes frisk på forsøgs dagen.
  4. Under prøve montering (se punkt 3), vil den farverige arbejdsopløsning være standardligt fortyndet 1:10, hvilket resulterer i en endelig farve koncentration på 2 μM og 0,1% w/v endelig DMSO-koncentration.
    Bemærk: valg af forskellige fortyndingsfaktorer ved blot at ændre volumen forholdet mellem farvestof arbejdsopløsning og monterings væske, gør det nemt at tilpasse den ønskede endelige farvestof koncentration.
    Forsigtig: for at undgå uønskede virkninger som følge af farve-eller DMSO-toksicitet bør fortyndingsfaktoren ikke falde til under 1:4 for at resultere i maksimale endelige koncentrationer af 5 μM farvestof og 0,4% w/v DMSO. Højere farvestof koncentrationer vil hurtigt mægle systemet og forhindre pålidelig signal kvantificering, hvorimod mere end 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO kan forringe celle udviklingen38.

3. prøveforberedelse til mikroskopi

  1. Stikprøver fra svampe kolonier (trin 1,2) eller fast germling kulturer (trin 1,3) ved den inverterede agar blok metode.
    1. Hold en ren 24 mm x 60 mm glas Cover slip (#1 = 0,13 – 0,16 mm tykkelse) klar og tilsæt 18 μL flydende minimal medium (VMM eller M9) eller fysiologisk saltopløsning på midten.
    2. Tilsæt 2 μL af 20 μM-arbejdsopløsningen til 18 μL væske, og bland godt ved pipettering op og ned flere gange, samtidig med at produktionen af luftbobler undgås.
      Bemærk: når man arbejder med flere prøver, er det tilrådeligt at tilberede en masterblanding af væske-farvestof opløsning for alle for at sikre lige farve koncentration i hele eksperimentet.
    3. Med en ren skalpel skæres en 15 mm x 15 mm prøve fra periferien af kolonien eller fast germling kultur og placerer den lodret ved siden af medium drop på Cover sedlen.
    4. Ved hjælp af skalpel til at understøtte den øverste kant af blokken og en finger til at holde bagsiden af blokken på plads, langsomt sænke siden transporterer mycelium eller germlings på væsken. Prøven er nu klar til overførsel til mikroskop stadiet.
      Forsigtig: det er vigtigt at gøre dette langsomt og meget omhyggeligt for at minimere mekanisk belastning af cellerne og for at undgå luftbobler, der er fanget mellem prøve og følgeseddel.
  2. Monter de flydende germling kulturer fra trin 1,4.
    Bemærk: de fleste bekvemt, flydende germling kulturer i Chambered mikro-brønd slides kan direkte overføres og yderligere manipuleret på mikroskop scenen.
    1. Tilsæt 22 μL farvestof-arbejdsopløsning til 200 μL flydende medium for at resultere i standard endelige koncentrationer af 2 μM farvestof og 0,1% w/v DMSO.
      Bemærk: flydende germling kulturer har den store fordel, at fluorescerende farvestoffer (eller andre kemikalier, såsom hæmmere) kan tilsættes på ethvert ønsket tidspunkt af eksperimentet, også under optagelsen. I så fald skal der udvises særlig omhu for at administrere væskedråber meget langsomt for ikke at forstyrre cellerne. System vibrationer og brownian motion måske allerede indføre nogle celle bevægelse.

4. mikroskopi af levende celler

  1. Juster de grundlæggende indstillinger for billed anskaffelse. Følgende indstillinger for billed anskaffelse gør det muligt at fange farvnings dynamik i individuelle hyphaer og gælder for begge af følgende assays
    1. Anvend 5 – 10% laser effekt på 20% af enhedens fulde udgangseffekt.
    2. Brug en plan APO 60x – 63x glycerol eller vand nedsænkning mål med en høj numerisk blænde ≥ 1,2.
    3. Begræns billedområdet til omridset af hyfer ved at angive en billedstørrelse på 1024 x 256 pixels og ved hjælp af en optisk zoomfaktor på 2 – 3.
    4. Brug tovejs scanning med 400 Hz. Juster størrelsen på pinhullet til 1 luftig enhed.
    5. Indstil Gain af den mest følsomme detektor til 100%.
    6. For time omgange optagelse, start billed erhvervelse med en ramme hver 15 s for at tillade en rimelig tidsmæssig opløsning uden at producere farve blegning eller fotostress.
    7. For 3D-optagelse skal du indstille den øvre og nedre rumgrænse til kanten af hyfer-og Space Optical-afsnittene 1 μm for at tillade en fornuftig rumlig opløsning.
      Bemærk: på grund af den hurtige vækst af hyphae, høj rumlig opløsning i Z-aksen er ofte blevet ofret for høj tidsmæssig opløsning i X/Y-aksen eller den anden vej rundt. Kun meget moderne confokal Laserscanning mikroskoper er hurtig nok til at opfylde begge krav.
  2. Endocytosis optagelses assays
    1. Se figur 1 og tabel 1 for at finde de bedste indstillinger for excitation/emission for FM 1-43 og/eller FM 4-64, der er tilgængelige på mikroskopi systemet, og Juster i overensstemmelse hermed.
      Bemærk: med den anbefalede 2 μM-koncentration er inkorporering af FM-farvestof i plasma membranen øjeblikkelig i normale raske celler. Hele processen fra indledende plasma membranfarvning til farvestof udseende i rørformede vakuoler er normalt afsluttet inden for 30-45 minutter ved stuetemperatur. Forøgelse af FM-farve koncentrationen øger S/N-forholdet og giver dermed højere kontrast billeder hurtigere. Men det fremskynder også mærkningsprocessen, hvilket gør det vanskeligere at differentiere den kronologiske rækkefølge af organelle farvning.
    2. Start billede optagelse ved hjælp af ovenstående anbefalede grundlæggende billede erhvervelse indstillinger og evaluere resultaterne.
    3. Optimer billed erhvervelse indstillinger til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af plasma membran eller endokytose dynamik eksperimentet er fokuseret på.
    4. For eksempel, for at fange meget hurtig dynamik i X/Y, formindske den samlede billedstørrelse, billede kun et brændfly og øge scanningshastigheden til 1 fps. Hvis du ønsker en højere opløsning i Z-aksen, skal du formindske opløsningen i X/Y, formindske billedstørrelsen og formindske afstanden mellem optiske sektioner og 0,5 μm.
  3. Cellevæg dynamik
    1. Se figur 4 og tabel 1 for at identificere de bedste excitation/emission indstillinger for den anvendte cellevæg farvestof til rådighed på mikroskopi system og justere i overensstemmelse hermed.
      Bemærk: på grund af deres brede emissions spektre er CFW og SPF ikke velegnede til samtidige Co-Imaging med andre fluorophorer, overvejende GFP. Nogle restriktioner gælder endda for sekventielle Imaging tilgange med disse farvestoffer, og derfor skal optimeres individuelt.
    2. Start billede optagelse ved hjælp af ovenstående anbefalede grundlæggende billede erhvervelse indstillinger og evaluere resultaterne.
      Bemærk: med den anbefalede 2 μM koncentration, inkorporering af farvestof i cellen væggen er ikke nødvendigvis instant, men rimeligt hurtigt. Hele processen med septum dannelse, for eksempel, tager i gennemsnit omkring 5 – 7 min ved stuetemperatur20. Forøgelse af cellevæggen farvestof koncentration øger S/N-forholdet og dermed producerer højere kontrast billeder hurtigere. Men, det også hurtigt introducerer artefakter på grund af induceret cellevæg skade reparation.
    3. Optimer indstillinger for billed anskaffelse til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af cellevæg morfogenesis eksperimentet er fokuseret på, som skitseret i afsnit 4.2.3.

Representative Results

Kvantitativ billedanalyse
Ud over at "bare" visualisere cellulære processer, Live-Cell Imaging gør det muligt at udtrække kvantitative oplysninger fra de registrerede data. Generelt er kvantitativ billedanalyse et komplekst emne, hvis egentlige diskussion er langt ud over anvendelsesområdet for denne artikel, derfor er læseren henvist til dedikerede lærebøger og artikler39,40,41. Der gives dog nogle grundlæggende retningslinjer, som er knyttet til følgende eksempeldata. Flere afgørende forudsætninger skal være opfyldt for at muliggøre billed kvantificering, herunder: (1) definerede molariteter af fluorescerende farvestoffer skal anvendes på alle prøver for at muliggøre nøjagtig relativ sammenligning; (2) indstillingerne for billed anskaffelse skal justeres på en sådan måde, at lysdetektorerne aldrig bliver mættede, ellers er maksimal intensiteter afskåret; (3) indstillinger for billed anskaffelse skal forblive faste i løbet af et sammenhængende eksperimentelt sæt, ellers indføres der ændringer i kunstig intensitet. (4) billeddata skal gemmes i en informations-Lossless filformat sammen med metaoplysninger, der indeholder alle instrument indstillinger; og (5) billedanalyse bør begrænses til det minimale antal efter behandlingstrin, der kræves for at udtrække de ønskede kvantitative oplysninger.

Normalt, definerede standarder, der ville tillade absolut kvantificering af indspillede signaler er ikke tilgængelige i den levende celle. I sin enkleste form er kvantitativ billedanalyse således afhængig af den relative sammenligning af pixel intensiteter inden for det samme billede eller mellem forskellige billeder, som er optaget med identiske indstillinger. Producentens mikroskop kontrol software normalt omfatter grundlæggende værktøjer til billede efter behandling og kvantitativ analyse, eller kan opgraderes med yderligere funktioner til billedsegmentering, tærskel, ratio Imaging, etc. Flere open source-billedbehandlings platforme, der er forskelligt egnede til forskellige typer billeddata, er tilgængelige, herunder ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS BioImage Informatics (http://cme.msu.edu/cmeias/) og Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).

De præsenterede eksempeldata blev behandlet og analyseret ved hjælp af ImageJ platform. Kort, specifikke områder i cellen, såsom hyphal spids Apex eller septa, er markeret med betydelige område udvælgelse værktøjer, og intensiteten af alle indeholdte pixels er udlæser med softwaren implementeret "måleværktøj". Intensiteten data fra kontrol og eksperimentelle prøver overføres til en regnearksfil, matematisk analyseret og forberedt som graf. Yderligere oplysninger kan findes i de citerede oprindelige publikationer.

Eksempeldata 1: FM 4-64 optagelses assays
Svampe prøver blev dyrket som kolonier (trin 1,2) og monteret ved den inverterede agar blok metode (trin 3,1). Den endelige koncentration af FM 4-64 var 1,67 μM. Imaging indstillinger: HCx pl APO 63x/1.3 na glycerol Immersion mål på en omvendt konfokale Laserscanning mikroskop (Se tabellen over materialer); FM 4-64 excitation ved 488 nm og emission ved 600 – 700 nm; en ramme hvert minut i op til 150 min. FM 4-64 optagelses analyser identificerede defekter i den spatio-temporale organisering af endokytose i gensletning og gen overekspression af mutanter i det svampe specifikke Sur7-familie protein 2 (Sfp2) af T. atrovirid9 (figur 5).

Eksempeldata 2: FM 4-64 samtidig farvning af fluorescerende fusions proteiner målrettet mod endokytiske rum
Svampe prøver blev dyrket som kolonier (trin 1,2) og monteret ved den inverterede agar blok metode (trin 3,1). Den endelige koncentration af FM 4-64 var 2 μM. Imaging indstillinger: CFI plan APO VC 60x/1.2 na XC vand nedsænkning mål på en omvendt konfokale Laserscanning mikroskop (Se tabellen over materialer); GFP excitation ved 488 nm og emission ved 500 – 530 nm, FM 4-64 excitation ved 488 nm og emission ved 600 – 700 nm, og lyse-felt med transmitterede lysdetektor, alle samtidigt; en ramme hver 15 s for op til 15 min. FM4-64 Co-farvning blev anvendt til at relatere den subcellulære fordeling af de to forbedrede grønne fluorescerende protein (egfp)-mærkede transmembran proteiner Sfp2 og Gpr1 til endocytic pathway i T. atrovirid (figur 6, film 3, film 4).

Eksempeldata 3: FM 4-64 medfarvning til identifikation af morfogenetiske forskelle
Svampe prøver blev dyrket som kolonier (trin 1,2) og monteret ved den inverterede agar blok metode (trin 3,1). Den endelige koncentration af FM 4-64 var 2 μM. billeddannelses indstillinger: Planlæg apochromat 63x/1.4 na olie nedsænkning mål på en omvendt konfokale Laserscanning mikroskop (Se tabellen over materialer); GFP excitation ved 488 nm og emission ved 505-550 nm, FM 4-62 excitation ved 488 nm og emission på 574-691 nm, og lyse-felt med transmitterede lysdetektor, alle samtidigt; en ramme hver 8,5 s for op til 15 min. FM4-64 Co-farvning lov til at relatere den subcellulære lokalisering dynamik af fluorescently mærket BUD-6 polarisome komplekse protein til endosome menneskehandel-afhængige processer, såsom dannelsen af septa og polariseret hyphal spids vækst, og karakteriseret forskelle i den subcellulære organisation og hyphal arkitektur mellem vilde type og mutant stammer af N. crassa (figur 7, film 5).

Eksempeldata 4: cellevæg farvning afslører morfogenetiske forskelle
Svampe prøver blev dyrket som kolonier (trin 1,2) og monteret ved den inverterede agar blok metode (trin 3,1). Der blev anvendt endelige koncentrationer på 2 μM CFW, 20 μM SPF og 100 μM CR. Indstillinger for billedbehandling: CFI-planen APO VC 60x/1.2 NA XC-vandnedsænknings målsætning på et inverteret confokal laser scannings mikroskop (Se tabellen over materialer); CFW og SPF excitation ved 405 nm og emission ved 430-470 nm, CR excitation ved 543 nm og emission ved 580-620 nm. De forskellige interaktions egenskaber af CFW, SPF og CR med cellevægpolymerer fremhæver morfogenetiske forskelle mellem Δsfp2 mutant og Wild type stammen af T. atrovirid9. Stigende cellevæg stress påført af forhøjede farvestof koncentrationer sker hurtigere og mere udtalt i mutant sammenlignet med den vilde type. Desuden gør de samme billeder det muligt at kvantificere morfogenetiske forskelle med hensyn til hyphal diameter og septal afstand mellem begge stammer (figur 8).

Eksempeldata 5: realtidsovervågning af cellevæggens biosyntese
Germlings blev dyrket som flydende kultur (trin 1,4) i 8-brønd Chambered mikro-slides (trin 3,2). Den endelige CFW-koncentration var 0,12 μM. indstillinger for Imaging: CFI plan APO VC 60x/1.2 na XC vand nedsænkning mål på en omvendt konfokale Laserscanning mikroskop; CFW excitation ved 405 nm og emission ved 420 – 470 nm; en ramme hver 20 s for op til 35 min. Den meget lave CFW-koncentration forhindrer mætning af cellens væg med farve molekyler og giver mulighed for kvantitativ realtidsovervågning af cellevæggens biosyntese. Dette afslører, at aflejringen af nye cellelvæg materiale ikke er ensartet, men reagerer meget hurtigt på lokaliserede fysiske belastninger som følge af den relative forskydning af en celle på celle-celle vedhæftet fil før germling fusion i N. crassa (figur 9, Movie 6).

Figure 1
Figur 1: biokemiske og biofysiske egenskaber af FM-farvestoffer. (A) kemiske strukturer af FM 1-43/SynaptoGreen C4 og FM 4-64/SynaptoRed C2. B) absorptions-og emissions spektre for begge FM-farvestoffer, overlagt med de optimale billedbehandlings indstillinger for membranbundne farvestoffer i filamentøse svampe: 445 – 495 nm blåt lys vil BEGEJSTRE FM 1-43 med 100 – 80% effektivitet, mens 488 nm af en argon laser vil begejstre farvestoffet med 91% effektivitet. På grund af det blå Skift ved membran binding (*) er det optimale detektionsområde for FM 1-43 emission mellem 520 – 590 nm. På samme måde er de optimale billedbehandlings indstillinger for FM 4-64 i svampe 471 – 541 nm (100 – 80% effektivitet) ved brug af en polykromatisk excitation-lyskilde eller 514 nm (99% effektivitet) ved brug af en argon-laser og 650 – 750 nm til detektering af lysemission. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: samtidige Co-Imaging af fm 1-43 og fm 4-64. En ækvimolære blanding af begge farvestoffer blev føjet til en flydende spire kultur af N. crassa , der gav en endelig koncentration på 10 μM. Ved 25 min efter farve tilsætning har FM 1-43 plettet plasma membranen og allerede akkumuleret i indre membraner, herunder stærkt farvede mitokondrier (m), men i vid udstrækning udelukke vakuolære membraner (v), og er mere end otte gange stærkere i forhold til FM 4-64 (gennemsnitlige fluorescens intensiteter 176 til 21, henholdsvis), hvis lavere hydrofobiby/højere hydrophilicity bremser sin internalisering sats fører til en langvarig bolig i plasma membranen Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: cellevæg stress-induceret deposition af cellevæg polymerer på spidsen Apex ofte indebærer celle autolyse. Hyphae af T. atrovirid udtrykker cytoplasmisk gfp blev plettet med 10 μM Solophenyl flavine 7gfe 500 (SPF) og afbildet umiddelbart efter montering. Ikke-stresset hyfer (a), stresset hyfer med en let forøget glucan/chitin aflejring ved spidsen og progression af autolyse (b), og stærkt stresset hyfer med udtalt apikale glucan/chitin Cap (Asterisk) og Terminal autolyse (c) tydelig ved det totale tab af gfp fluorescens og omfattende vakuolisering. Skala bjælke = 10 μm. Se film 1 for fuldtids kursus sekvens. Bemærk, at de tre hyfer var faktisk placeret ved siden af hinanden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: biokemiske og biofysiske egenskaber af cellevæg selektive farvestoffer. De givne kemiske egenskaber er natriumsalte af hvert farvestof. Absorption og emission spektre svarer til dem i cellulære miljøer. Indikerede monokromatiske laser excitation linjer (skrevet i farve), polykromatiske excitation intervaller gælder for epifluorescens mikroskoper, og emission lys detekterings intervaller er dem, der anbefales til billeddannelse i filamentøse svampe. To laser excitation linjer er angivet, når begge arbejder lige godt. (*) Emissionsspektret af cellelvæg-bundet PFS er betydeligt mere rød-forskudt end tidligere bemærket33, dog, resulterer i meget gode S/N-ratio med lavere farvestof koncentrationer end brugt før. Den komplette spektrum af CR er i øjeblikket utilgængelig, derfor, at af Nile Red (CAS-nr: 7385-67-3) er vist som den tætteste match. Detaljerede oplysninger om de spektral egenskaber af CR kan findes andetsteds42. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Sfp2 indflydelse på den endokytiske optagelse af FM4-64. Tre på hinanden følgende vigtige stadier af optagelsen af FM-farvestof er let synlige i vildtype (WT). Etape i: eksklusiv farvning af plasma membranen, trin II: første forekomst af FM-farvestof i endocytiske vesikler og fase III: eksklusiv farvning af endokytiske vesikler og endomembraner. Tilsvarende farvning mønstre er vist på det tidligste tidspunkt af deres udseende. I sammenligning med T. atrovirid vildtype, endokytose er lidt accelereret i sfp2 over-udtrykker mutant (OEsfp2), hvorimod farve optagelsen er dramatisk forsinket i sfp2 sletning mutant (Δsfp2). For eksempel opstår Dye optagelse i plasma membranen øjeblikkeligt i OEsfp2 men tager 2 min i vildtype; og komplet internalisering af FM-farvestof fra plasma membranen opstår 10x hurtigere i OEsfp2 sammenlignet med Δsfp2. Skala stænger = 5 μm. Figuren er gengivet fra Atanasova et al.9 efter aftale med Creative Commons License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: samtidig farvning af EGFP-mærkede membran proteiner med FM 4-64 letter differentieringen af distinkte subcellulære lokaliserings dynamik i T. atroviridA) det firetransmembrane domæne protein Sfp2 Co-LOKALISERER med FM4-64 mærkede organeller, herunder plasma membranen og septa, Spitzenkörper (SPK; Arrow) og antagelige rørformede vakuoler. (B) GPCR-lignende Seven-transmembrane protein Gpr1 Co-lokaliserer med FM4-64 til de samme organeller som Sfp2, undtagen SPK. skala stænger, 10 μm. Se film 3 og film 4 for fuldtids forløb. Figuren er blevet modificeret fra Atanasova et al.9 efter aftale med Creative Commons-licensen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: FM 4-64 farvning differentierer Δbud-6 mutant fra vildtype og LOKALISERER bud-6 ved septalringen. A) FM 4-64 farvning af hyfer af vildtypen N. crassa (pile indikerer septa; pilespidser angiver SPK). B) septa og SPK er fraværende i ∆bud-6. Skala stænger, 50 μm.c og D) nærbillede af hyphal Apex og subapex af vildtype (c) og ∆bud-6 (d). SPK (Arrowhead) differentierer i vildtype, men ikke ∆bud-6. Parentes angiver den nukleare udelukkelseszone, der ikke er etableret i ∆bud-6. Skala stænger = 5 μm.E) bud-6-gfp-rekruttering til det begyndende septation-sted forud for indkrængning af plasma membranen (arrowheads) og ledsagende septalkonstriktion. Skala stænger = 5 μm. Se Movie 5a og Movie 5b for at få komplette tidskursus sekvenser. Figur er blevet gengivet med modifikationer fra Lichius et al.16 efter aftale med Creative Commons License. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: sletning af sfp2 ændrer deposition mønster af cellevæg materiale og påvirker hyphal morfogenese af T. atrovirid. (A) CFW og SPF-farvning afslører øget cellevægaflejring i Δsfp2 (pile) sammenlignet med Wild typen (WT). CR farvning inducerer omfattende spids hævelse kun i Δsfp2 (arrowheads). Skala stænger = 10 μm.B) morfogenetiske defekter i Δsfp2 omfatter signifikant reducerede Septalafstande (Δsfp2 = 26,0 μm, vildtype = 85 μm; n = 60; ANOVA pr < 2 − 16) og mindre hyphal diametre (∆sfp2 = 5,6 μm, vildtype = 12,6 μm; n = 100; ANOVA pr < 2 − 16). C) forhøjet farvestof fluorescens i spidsen Apex sammenlignet med subapex. Skala bjælke = 5 μm. (D) intensitet-kodet 3D-overflade plot af (C). E) kvantificering af relative fluorescens intensiteter i Δsfp2 og vildtype (n = 55). Figuren er blevet gengivet fra Atanasova et al.9 efter aftale med Creative Commons-licensen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: realtidsovervågning af cellevæggens biosyntese. A) fusion af conidial anastomose tube (Cat) mellem germlings af N. crassa. Fysisk kontakt bliver tydelig ved germling moment respons (21 – 28 min). Intensitet farvekodet CFW fluorescens indikerer områder med lidt (mørkeblå) og intens (gul) cellevæg deposition. Den oprindeligt uplettet homing tip (Arrowhead), indskud nye cellevæg materiale ved spids kontakt og i området oplever den største fysiske stress (pil). Skala bjælke = 5 μm. Se Movie 6 for at få en fuldtids forløb. Figur gengivet fra38 med tilladelse. B) projektion af a) med angivelse af fire cirkulære regioner, hvor fluorescens intensiteter blev målt. Skala bjælke = 5 μm. (C) plot af de angivne regioner viser den hurtige stigning i lokaliseret cellevæg biosyntese som reaktion på fysisk stress (cat 1, Arrow). I kimrøret (GT) og spore legemet (conidium) øges cellevæggens biosyntese støt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Film 1: Dye-induceret cellevæg stress. 10 μM SPF (cyan) blev føjet til T. atrovirid hyfer, der udtrykker cytoplasmisk gfp (magenta). Omfattende spids farvning sker straks, efterfulgt af den hurtige lyse af hyphal rum inden for 2 min; tydeligt ved, at GFP-fluorescensen forsvinder. Venligst klik her for at downloade denne film.

Movie 2
Movie 2: vital SPF farvning. 2 μM SPF (cyan) gør det muligt at spore spids vækst af T. atrovirid hyfer med høj rumlig og tidsmæssig opløsning uden at inducere cellevæg stress artefakter på spidsen Apex. Venligst klik her for at downloade denne film.

Movie 3
Movie 3: FM 4-64 Co-farvning af Sfp2-GFP. Samtidig farvning af T. atrovirid , som udtrykker Sfp2-megfp (grøn) med 1,67 μM FM 4-64 (rød), afslører den overlappende og distinkte lokalisering af membran proteinet med den endokytiske vej. Venligst klik her for at downloade denne film.

Movie 4
Movie 4: FM 4-64 Co-farvning af Gpr1-GFP. Samtidig farvning af T. atrovirid , som udtrykker Gpr1-megfp (grøn) med 1,67 μM FM 4-64 (rød), afslører den overlappende og distinkte lokalisering af membran proteinet med den endokytiske vej. Venligst klik her for at downloade denne film.

Movie 5
Film 5: FM 4-64 samtidig farvning af bud-6-GFP. (5a) samtidig farvning af N. crassa , der udtrykker bud-6-gfp (grøn) med 2 μM FM 4-64 (rød), gør det muligt at spore bud-6-dynamikken under dannelsen af septum i forhold til den associerede plasma membran-invagination. (5b) beskåret og fusionere billede af (5a). Venligst klik her for at downloade Movie 5a
Klik her for at downloade Movie 5b.

Movie 6
Movie 6: overvågning af cellevæggens biosyntese i realtid. N. crassa germlings udtrykker Mak-1-gfp (grøn) blev co-plettet med 0,12 μM CFW (blå) for at afsløre lokaliseret cellevæg Biogenese under Cat-medieret germling fusion. Bemærk, at der er nogle blødning gennem CFW-signalet i GFP-kanalerne, hvilket illustrerer, at SPF eller CR er bedre valg som sekventielle og samtidige Co-Imaging farvestoffer til GFP hhv. Venligst klik her for at downloade denne film.

Tabel 1: egenskaber af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer. * = mg/mL værdier korrigeret for reduceret renhed/farvestof indhold for at resultere equimolaritet i alle opløsninger; n.i.a. = ingen tilgængelige oplysninger. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Denne artikel fortsætter det banebrydende arbejde, der etablerede brugen af forskellige fluorescerende farvestoffer som vitale organelle markører for filamentøse svampe i begyndelsen af 2000 ' erne2,4,43, og forsøg på at diskutere de fotopysiske og celle biologiske egenskaber af FM-farvestoffer og udvalgte cellevæg farvestoffer i større detaljer end før. Især med hensyn til uønskede cellulære virkninger, såsom membran mætning eller cellevæg skader, der forekommer over visse farvestof koncentrationer. Hvad der tidligere er blevet betragtet som ikke-giftige på cellulært niveau er nu betragtes giftige på det molekylære niveau. Selv om disse virkninger kan være meget subtile og ikke direkte indlysende ved indlysende ændringer i organelle eller celle adfærd, enhver mulig interferens af farvestof ansøgning andet end visualisering skal minimeres for undersøgelsen af indfødte molekylære funktion. Heldigvis, forbedret følsomhed og Quantum effektivitet af moderne detektorer, såsom silicium lavine fotodiode detektorer (si-apd'er)44 eller airyscan område detektor45, lette brugen af endnu lavere farvestof mængder end før. Et andet centralt mål i artiklen er at eksemplificere Co-Imaging egenskaber af disse farvestoffer med andre fluorophorer, vigtigst af alt, de af GFP som den hyppigst anvendte fluorescerende protein i biologi. Dette bør støtte udformningen af billeddiagnostiske eksperimenter, der har til formål at korrelere den subcellulære lokalisering dynamik af fluorescerende fusions proteiner til dem af svampe cellevæggen, plasma membranen eller endo-og exocytose pathway osv.

Billeddannelse under naturlige og stressfri forhold er nøglen til erhvervelse af pålidelige data. Nogle praktiske overvejelser vedrørende kulturmedium og prøveforberedelse har til formål at give et udgangspunkt for at finde de optimale betingelser, der muliggør artefakt-fri, lang tids observation af sunde, ustressede celler med det højeste S/N-forhold muligt for en given prøve. Der er ingen universel måde at opnå pålidelige og meningsfulde Imaging resultater. Det er uløseligt forbundet med den tilgang, at biologisk variation af prøven, subjektivitet og forventninger i mikroskopist, samt billede efter behandling har betydelig indflydelse på data erhvervelse og tolkning, hhv. Derfor er den praktiske oplevelse af microscopist, hendes/hans intime viden om cellebiologi af svampen under undersøgelse, samt dygtige prøveforberedelse til at skabe betingelser som ' naturlig ' og uforstyrret som muligt i en lab indstilling, er altafgørende for at erhverve og evaluere billeddata, der sandfærdigt afspejler de undersøgte cellulære fænomener. Som en tommelfingerregel, forekomsten af uønskede bivirkninger af fluorescerende farvestoffer, der spænder fra den subtile og dermed ikke åbenbart synlig aktivering af plasma membran eller cellevæg re-modellering stress respons veje til den ligetil cytotoksiske induktion af celle autolyse, kan kun forebygges sikkert ved at anvende lave farvestoffer koncentrationer ≤ 2 μM.

Anvendelsen af fluorescerende farvestoffer er enkel, men deres særpræg er dårligt karakteriseret. En vigtig styrke ved at bruge fluorescerende farvestoffer er den forberedende enkelhed af forsøgsprotokoller. Dyrkning og prøveudtagning af svampen, tilsætning af farvestof (r), og montering på mikroskop scenen er (med praksis) ligetil. Justering af de grundlæggende billedbehandlings indstillinger, herunder excitation og emission bølgelængder, eksponeringstider, tidsforløb indstillinger osv., Følg simple biofysiske regler af mikroskopet og biologiske regler af de anvendte fluorescerende farvestoffer inde i cellerne. Tabel 1 har til formål at støtte identifikationen af den mest egnede farvestof eller farvekombination til forsøg. Desuden er fluorescerende farvestoffer rimeligt prissat, let tilgængelige med pålidelig høj kvalitet og dermed sikre meget reproducerbar anvendelse.

To store begrænsninger ved brug af membran eller cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer er (ofte) begrænset kendskab til deres præcise farvnings egenskaber, som i de fleste tilfælde er ikke-specifikke på organelle og molekylært niveau, og deres koncentrationsafhængige uønskede bivirkninger. FM-farvestoffer er specifikke for lipidbilayers, der deltager i endo-og exocytose. Men netop hvilke subcellulære organeller bliver successivt mærket under de testede betingelser er ikke umiddelbart indlysende og kræver sammenligning af forskellige FM farvevarianter, og co-mærkning med yderligere organelle-specifikke markører. Præference for FM 1-43 for mitokondrie membraner, i forhold til FM 4-64, er et eksempel. Cell Wall selektive farvestoffer viser varierende specificitet for de tre store polymerer af svampe cellevæggen. CFW menes at være en ikke-specifik plet for β-glucaner og chitin, SPF menes at være mest selektive for β-1, 4-glucaner, og CR menes at være yderst selektiv for α-og β-chitiner. Oplysninger om den bindende specificitet af PFS til svampe cellevæg polysaccharider er i øjeblikket ikke tilgængelig. Det forhold, som svampe celle vægpolymer mest effektivt mærkes med i en given farve koncentration hos de svampearter, der undersøges, er ikke let at besvare, og anvendelsen af detaljerede målinger, som er erhvervet in vitro eller in vivo i andre organismer eller andre svampearter, skal overvejes meget nøje. Desværre, disse oplysninger er sparsomme og meget spredt i litteraturen35,42,46. Nyere optegnelser, der ville følge på tidligere undersøgelser33 for at give ny indsigt i de præcise farvning egenskaber af featured farvestoffer specifikt i svampe er i øjeblikket ikke tilgængelige.

Billedbehandlings kontrol er afgørende for at evaluere farvnings mønstre og cellulær respons nøjagtigt. Sandsynligvis den mest udfordrende del, dog, er at kende cellebiologi af svampen så godt, at de registrerede ændringer i den subcellulære lokalisering af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer, ændringer i cellulære arkitektur eller hyphal vækstmønster kan udelukkende og trygt være relateret til de tilsigtede virkninger af den eksperimentelle behandling. Til dette er det afgørende at have gode Kontroller sammen med alle nye Live-Cell Imaging eksperiment. Disse omfatter ubehandlet vildtype som negativ billedbehandlings kontrol for at udelukke baggrunds autofluorescens og detektor støj fra det erhvervede billede og for at have en morfologisk Komparator, når du arbejder med mutanter. Endvidere, en positiv billeddannelse kontrol, for eksempel en stamme, der udtrykker GFP eller RFP i cytoplasmaet eller et andet velkendt fluorescerende markør protein, er afgørende for at indstille excitation lysintensiteten til det krævede minimum og har en celle vitalitet kontrol. Når disse kontroller er indstillet, er brugen af fluorescerende farvestoffer ikke begrænset til visualiseringsopgaver, men deres koncentrationsafhængige farvnings dynamik samt koncentrationsafhængige bivirkninger kan udnyttes analytisk; for eksempel, for kvantitativt overvågning cellevæg biosyntese i realtid eller for identifikation af mutant-specifikke fænotyper i modtagelighed assays47.

Forbedrede fremtidige applikationer afhænger af en detaljeret funktionel analyse af farvestof farvnings egenskaber. En stor vedvarende udfordring er at forbedre og automatisere kvantitative billedanalyser for at fremme funktionel evaluering af den subcellulære dynamik i membran-og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer i filamentøse svampe. Til dette, omfattende, kvantitative samlokaliserings undersøgelser af disse farvestoffer med kendte organelle og cellevæg polymer markører i kombination med mutant stammer mangelfuld i bestemte transportveje eller der mangler specifikke strukturelle komponenter er først påkrævet. Flere endokytose markører til komparative analyser med FM-farvestoffer er tilgængelige48,49, og med hensyn til de stadig dårligt karakteriseret bindende karakteristika af cellevæg farvestoffer i svampe, anvendelse af fluorescently-mærkede glucan-specifikke antistoffer50 kan give en mulighed for at løse dette problem.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser og intet at afsløre.

Acknowledgments

Der er grund til at takke den tyrolske videnskabs fond (TWF) for at yde Grant #256524 til AL, til Wiens videnskabs-og teknologi fond (WWTF) for at yde Grant #LS13-086 til SZ, og til publikations fonden på universitetet i Innsbruck for at understøtte åben adgang publikation. Forfatterne takker også Department of Zoology of The University of Innsbruck for at levere Leica TCS SP5 II confokal laser scannings mikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRAND cell counting chamber Merck BR718005 Thoma format
Calcofluor White M2R Merck/Sigma-Aldrich F3543 cell wall dye
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
Congo Red Merck/Sigma-Aldrich C6277 cell wall dye
Dimethyl sulfoxide VWR 8,36,73,230 organic solvent
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5
FM 1-43 Merck/Sigma-Aldrich S6814 membrane dye
FM 4-64 Merck/Sigma-Aldrich S6689 membrane dye
Glass beads Rettberg 1340691030 3 mm glass beads
Glass cover slips Thermo Fisher Scientific BB02400600A113MNT0 24 x 60 # 1 glass cover slips
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc Leica 15506353 glycerol immersion objective
LSM 510 Meta Zeiss custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3
M9 Minimal Medium Merck/Sigma-Aldrich M6030 generic fungal growth medium
Micro-slide 8-well ibidi 80826 ibiTreat #1.5 polymer coverslip
Miracloth Merck/Millipore 475855-1R polyester filtration material
Petri dish Sarstedt 8,21,472 92 x 16 mm culture dish w/o cams
Phytagel Merck/Sigma-Aldrich P8169 transparent gelling agent
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC Zeiss 440762-9904-000 oil immersion objective
Pontamine Fast Scarlet 4B Merck/Sigma-Aldrich 212490 cell wall dye
Potato Dextrose Agar (PDA) BD Difco 213400 fungal growth medium for T. atroviride
Potato Dextrose Broth (PDB) BD Difco 254920 fungal growth medium for T. atroviride
Reaction tube Sarstedt 72,706 1.5 mL SafeSeal tube
Scalpel B.Braun 5518016 Cutfix sterile scalpel #23
Screw cap tube Sarstedt 6,25,54,502 15 mL polypropylene tube
Solophenyl Flavine 7GFE 500 CIBA 1485385V6 cell wall dye
SynaptoGreen C4 Biotum 70020 membrane dye
SynaptoRed C2 Biotum 70021 membrane dye
Syringe membrane filter Thermo Fisher Scientific 723-9945 0.45 µm SFCA syringe filter
TCS SP5 II Leica custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1
Vogel's Minimal Medium (VMM) FGSC Fungal Genetics Stock Centre fungal growth medium for N. crassa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54, (2), 179-181 (1998).
  2. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. Elsevier. 63-87 (2004).
  3. Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61, (5), 883-892 (2010).
  4. Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198, (3), 246-259 (2000).
  5. Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100, (6), 823-832 (2008).
  6. Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4, (5), 911-919 (2005).
  7. Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28, (1), 69-85 (2015).
  8. Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76, (1), 220-235 (2010).
  9. Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8, (1), 12064 (2018).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12, (2), 363-375 (1992).
  11. Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97, (1), 101-109 (2009).
  12. Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
  13. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (1), 77-83 (2012).
  14. Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
  15. Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6, (10), 1853-1864 (2007).
  16. Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7, (1), 30372 (2012).
  17. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42, (12), 963-975 (2005).
  18. Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103, (4), 921-931 (2013).
  19. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
  20. Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9, (5), 96744 (2014).
  21. Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15, (2), 109-112 (1984).
  22. Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108, (8), 616-618 (1984).
  23. Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105, (1-2), 129-133 (1980).
  24. Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129, (5), 1577-1582 (1983).
  25. Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278, (22), 20345-20357 (2003).
  26. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4, (1), (2017).
  27. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26, (5), 827-830 (1988).
  28. Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238, (2), 95-101 (2010).
  29. Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137, (3), 185-187 (1984).
  30. Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163, (3), 1180-1185 (1985).
  31. Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158, (2), 115-126 (1992).
  32. Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12, (2), 254-264 (2013).
  33. Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97, (3), 580-588 (2005).
  34. Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226 (2013).
  35. Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93, (2), 399-412 (2018).
  36. Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60, (6), 1140-1143 (2011).
  37. Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
  38. Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
  39. Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13, (4), 337-343 (2018).
  40. Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  41. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9, (7), 697-710 (2012).
  42. Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13, (2), 1187 (2017).
  43. Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37, (1), 109-119 (2002).
  44. Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
  46. Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268, (1), 13-27 (2017).
  47. Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1, (5), 2253-2256 (2006).
  48. Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103, (15), 5793-5798 (2006).
  49. Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
  50. Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics