تحريض الخلايا الحمراء للدم باستخدام الكالسيوم الأيوني

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يتم توفير بروتوكول لتحريض الخلايا الخلوية ، والمبرمجة موت الخلية في كريات الحمراء ، وذلك باستخدام ionophore الكالسيوم ، ionomycin ،. يتم تقييم المبرمج الناجح من خلال مراقبه التعريب فوسفاتيديلسيرين في النشرة الخارجية غشاء. وقد تم فحص العوامل التي تؤثر علي نجاح البروتوكول وتوفير الظروف المثلي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

كريات الخلايا المبرمجة الموت ، يحدث في عدد من الامراض الدموية واثناء أصابه الكريات الحمراء. السمة المميزة للخلايا eryptotic هو فقدان التماثل الموضعي لغشاء الخلية ، مما يؤدي إلى نقل فوسفاتيديلسيسيرين إلى النشرة الخارجية غشاء. يتم تشغيل هذه العملية عن طريق زيادة تركيز داخل الخلايا من Ca2 +، والذي ينشط تشويش blase ، وهو الانزيم الذي يسهل حركه ثنائيه الاتجاه من الدهون الفوسفاتية بين المنشورات غشاء. ونظرا لاهميه الخلايا البينية في الظروف المرضية المختلفة, وكانت هناك جهود للحث علي الارطح في المختبر. وقد اعتمدت هذه الجهود عموما علي ionophore الكالسيوم, ionomycin, لتعزيز Ca داخل الخلايا2 + تركيز والحث علي الارطح. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن العديد من التناقضات في الأدبيات المتعلقة بالاجراء الخاص بحمل الخلايا البينية باستخدام ionomycin. هنا ، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول خطوه بخطوه ل ionomycin المستحثة في كريات الحمراء البشرية. ونحن نركز علي الخطوات الهامه في الاجراء بما في ذلك تركيز ايوكوفيري ، ووقت الحضانة ، واستنزاف الجلوكوز ، وتوفير نتيجة تمثيليه. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتكرار حث الخلايا البينية في المختبر.

Introduction

موت الخلايا المبرمجة في كريات الدم الحمراء ، والمعروف أيضا باسم الخلية ، هو شائع في العديد من الحالات السريرية والاضطرابات الدموية. ويرتبط اريبتوسيس مع انكماش الخلية وفقدان التماثل فوسفورية في غشاء البلازما الخلية1,2. فقدان عدم التماثل النتائج في نقل فوسفاتيديلسيسيرين (PS), الدهون المترجمة عاده في النشرة الداخلية3,4, إلى النشرة الخارجية الخلية, الذي يشير إلى الضامة لفاجوسيتوسي وأزاله الكريات الحمراء المعيبة5,6,7,8. في نهاية فتره الحياة الطبيعية من كريات الدم الحمراء ، وأزاله الخلايا الدموية من قبل الضامة يضمن التوازن من كريات الدم الحمراء في التداول. ومع ذلك ، في الظروف المرضية ، مثل مرض الخلية المنجلية و الثلاسيميا9،10،11، قد يؤدي تحسين الخلايا الخلوية إلى فقر الدم الشديد2. نظرا لأهميته في امراض الدم ، هناك اهتمام كبير في دراسة العوامل التي تحفز أو تمنع الخلايا الخلوية واليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية.

غشاء البلازما من كريات الدم الحمراء الصحية غير متناظرة ، مع الفوسفورية المختلفة التعريب في المنشورات الخارجية والداخلية. يتم تنظيم التماثل غشاء في المقام الأول من قبل عمل الانزيمات الغشاء. Aminophospholipid translocase يسهل نقل أمينوفوسفوليبيدس ، PS و فوسفهاتيديليثانولامين (PE) ، من خلال توجيه هذه الدهون إلى النشرة الداخلية الخلية. من ناحية أخرى, floppase ينقل الكولين التي تحتوي علي الدهون الفوسفاتية, فوسفاتيديلكولين (PC) و سفينغوميلين (SM), من الداخل إلى النشرة الخارجية لغشاء الخلية12. ومع ذلك ، علي عكس الخلايا السليمة ، يتم خلط غشاء الكريات الحمراء الخلوية. ويرجع ذلك إلى عمل الانزيم الثالث ، الذي يعطل التباين فوسفورية عن طريق تسهيل النقل ثنائي الاتجاه من أمينوفوسفوليبيدس13،14،15،16. يتم تنشيط تشويش بلاسي من خلال مستويات مرتفعه من الخلايا من Ca2 +. ولذلك ، ionophores الكالسيوم ، والتي تسهل نقل Ca2 + عبر غشاء الخلية12، هي محفزات فعاله من الخلايا البينية.

Ionomycin ، ايونومور الكالسيوم ، وقد استخدمت علي نطاق واسع للحث علي الخلايا الحمراء في كريات الصدر12،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26. Ionomycin لديه كل من المجموعات هيدروفيلييك ومسعور ، والتي هي ضرورية لربط والتقاط Ca2 + أيون ، ونقله إلى الفضاء عصاري خلوي27،28،29. وهذا يؤدي إلى تفعيل التشويش ونقل الموقع من PS إلى النشرة الخارجية ، والتي يمكن الكشف عنها بسهوله باستخدام الملحقات-V ، وهو بروتين خلوي مع تقارب عاليه إلى PS12. وعلي الرغم من انه يتم الإبلاغ عن الآثار التي يسببها ionomycin عاده ، وهناك تباين طريقه كبيره في الأدب (الجدول 1). يعتمد السكان من كريات الحمراء التي تمر بالخلايا الخلوية علي عوامل مختلفه مثل تركيز ايوكوفيري ، ووقت العلاج مع ايوفونور ، ومحتوي السكر في البيئة خارج الخلية (استنزاف الجلوكوز ينشط قنوات الموجبة ويسهل دخول Ca2 + في الفضاء عصاري خلوي)30،31. ومع ذلك ، هناك القليل من الاتساق في هذه العوامل في الأدبيات ، مما يجعل من الصعب القيام التكرار في المختبر.

في هذا البروتوكول ، نقدم اجراء خطوه بخطوه للحث علي الارطح في كريات الحمراء البشرية. يتم فحص العوامل التي تؤثر علي الخلايا البينية الناجحة بما في ذلك Ca2 + تركيز ، تركيز ايوكوفيري ، وقت العلاج ، وما قبل الحضانة في المخزن المؤقت المنضب الجلوكوز ويتم الإبلاغ عن القيم المثلي. يوضح هذا الاجراء ان ما قبل الحضانة من كريات الحمراء في المخزن المؤقت الخالي من الجلوكوز يزيد بشكل كبير من نسبه الخلايا البينية مقارنه بالمخزن المؤقت المحتوي علي الجلوكوز. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر لإنتاج كريات الحمراء الخارجية للتطبيقات المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم شراء جميع عينات الدم البشرية المستخدمة في البروتوكول الموصوف أدناه كعينات تم التعرف عليها. ولم يشارك في هذه الدراسة اي أشخاص من البشر أو جندوا بصوره مباشره. وينبغي استخدام المبادئ التوجيهية لإعلان هلسنكي عندما تشمل البحوث المواضيع البشرية.

1-العزلة الكرياته عن الدم الكامل

  1. أضافه 500 μL من الدم كله في حمض السكر سيترات (الحوار) (المخزنة في 4 درجه مئوية) إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير.
    ملاحظه: تم شراء الدم الكامل في الحوار الاسيوي. وفقا للشركة ، يتم أضافه 1.5 مل من الحوار إلى 7 مل من الدم الكامل (8.5 mL حجم الكلي).
  2. الطرد المركزي الدم كله في 700 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT) وأزاله البلازما واضحة ومعطف بافي رقيقه باستخدام ماصه لترك طبقه كريات الحمراء.
  3. اعداد 1 لتر من الحل الرنين التي تحتوي علي 125 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ملم KCl ، 1 مم MgSO4، 32 MM hepes ، 5 ملم الجلوكوز ، و 1 مم cacl2. ضبط درجه الحموضة إلى 7.4 باضافه 2 μL قطرات من 1.0 M NaOH. لاعداد حل الرنين الخالي من الجلوكوز ، اتبع نفس البروتوكول ، ولكن لا تقم بتضمين الجلوكوز في الحل.
  4. غسل كريات الحمراء 2x في الحل الرنين عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 mL من الحل الرنين ، يطرد في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT ، وأزاله supernatant.
  5. جعل 0.4 ٪ هيتوكريت عن طريق أعاده تعليق 40 μL من بيليه كريات في 9,960 μL من الجلوكوز خاليه من حل الرنين للوصول إلى حجم النهائي من 10 مل.
    ملاحظه: هيتوكريت مصطلح يستخدم للاشاره إلى حجم جزء من كريات الدم الحمراء في التعليق. A 0.4 ٪ هيتوكريت هو تعليق يحتوي علي 0.4 ٪ كريات الدم الحمراء.
  6. احتضان تعليق الخلية في 37 درجه مئوية لمده 7 أيام.

2. علاج كريات الحمراء مع ايونوميمايسين وقياس انحلال الدموي

  1. تذوب 1 ملغ من ملح الكالسيوم ionomycin في 630 μL من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) للوصول إلى التركيز النهائي من 2 ملم. Aliquot ومخزن في-20 درجه مئوية.
  2. خذ 1 مل من الدم 0.4 ٪ من الخطوة 1.5 وأضافه 0.5 μL من 2 mM ionomycin للوصول إلى تركيز نهائي من 1 μM. احتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية.
    1. استخدام 1 مل من الهيكوكريت مع عدم وجود العلاج ionomycin كعنصر تحكم سلبي.
  3. الطاردة للطرد المركزي ionomycin المعالجة والدموية غير المعالجة في 700 x g ل 5 دقيقه في RT ، وأزاله supernatants بهم لترك الكريات الخلية في الجزء السفلي من الأنابيب.
  4. غسل الخلايا 3x مع الحل الرنين عن طريق تعليق الكريات الخلية في 1.5 mL من الحل الرنين ، يطرد في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT ونبذ supernatants.
  5. لقياس انحلال الدم ، أضف 1 مل من الدم غير المعالج 0.4 ٪ من الهيكوريت من الخطوة 1.5 إلى أنبوب الطرد المركزي واحتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية كعنصر تحكم سلبي لانحلال الدم (0 ٪).
  6. أضافه 1 مل من 0.4 ٪ غير المعالجة من الدم من الخطوة 1.5 إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT. أزاله ماده طافي وأضافه 1 مل من الماء المقطر إلى بيليه الخلية واحتضان ل 2 ح في 37 درجه مئوية كعنصر تحكم إيجابي لانحلال الدم (100 ٪).
  7. أضافه 1 مل من ionomycin-معالجه 0.4 ٪ الهيكوريت من الخطوة 2.2 إلى أنبوب الطرد المركزي.
  8. طرد مركزي الخلايا غير المعالجة ، الخلايا المعالجة ، والخلايا في الماء المقطر في 700 x g لمده 5 دقائق في RT.
  9. خذ 200 μL من supernatants وأضافه إلى لوحه 96-حسنا.
  10. قياس الامتصاص في 541 nm باستخدام قارئ ميكروبلايت.
  11. حساب انحلال النصفي باستخدام المعادلة 132:

    % انحلال الدموي = (اT -a0)/(1000) * 100

    حيث A0 هو امتصاص كريات الحمراء في حل الرنين ، a100 هو امتصاص كريات الحمراء في الماء ، وT هو امتصاص الكريات الحمراء المعالجة بواسطة ionomycin.

3-المرفق الخامس لمقايسة الربط

  1. تمييع 2 مل من 5x المرفق الخامس المخزن المؤقت ملزمه في 8 مل من الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) للحصول علي 1x ملزمه العازلة.
  2. أعاده التعليق الكريات الخلية ionomycin المعالجة وغير المعالجة من الخطوة 2.4 في 1 مل من 1x العازلة ملزمه.
  3. خذ 235 μL من تعليقات الخلية في المخزن المؤقت للربط وأضافه 15 μL من الضم الخامس-اليكسا الطحين 488 المقارن.
  4. احتضان الخلايا في RT لمده 20 دقيقه في مكان مظلم. الطرد المركزي في 700 x g لمده 5 دقائق في RT وأزاله supernatant.
  5. غسل الخلايا 2x مع 1x العازلة ملزمه ، عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 mL من العازلة ملزمه ، يطرد في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT وأزاله supernatant.
  6. أعاده تعليق كريات الخلية في 250 μL من المخزن المؤقت للربط 1x لقياسات التدفق الخلوي.

4. تدفق الخلوي

  1. نقل 200 μL من المرفقات-V الكريات الحمراء الملونة إلى 1 مل أنابيب البوليسترين أسفل الجولة متوافقة مع تدفق الخلوي.
  2. تسجيل الدخول إلى برنامج تدفق الخلوي وانقر علي زر التجربة الجديدة . انقر علي زر أنبوب جديد . حدد ورقه العالمية واختيار تطبيق التحليل لقياس كثافة مضان مع الطول الموجي الاثاره من 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 530 nm.
  3. تعيين عدد الخلايا إلى 20,000 ليتم جمعها لتحليل الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) الفرز.
  4. حدد الأنبوب المطلوب وانقر علي زر تحميل . انقر علي زر التسجيل لقياسات مبعثرة إلى الامام والجانب مبعثر. كرر لجميع العينات.
  5. الحق انقر علي زر العينة وانقر علي تطبيق تحليل الدفعة لإنشاء ملف النتيجة.
  6. الحق انقر علي زر عينه وانقر علي إنشاء ملفات FSC.
  7. أضافه بيانات التدفق الخلوي (ملفات FSC) في مكان العمل من البرمجيات تدفق الخلوي.
  8. تحليل بيانات عنصر التحكم عن طريق تحديد عدد الخلايا من الفائدة وأضافه إحصائيات للقيمة المبرمجة.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق التحكم وحدد الرسم البياني مقابل كثافة الفلورية.
    2. انقر علي زر البوابة لرسم بوابه علي المدرج التكراري الذي يشير إلى النسبة المئوية للارطح.
  9. تطبيق نفس الإحصائيات لكافة الأنابيب التجريبية الأخرى للحصول علي قيم الخلايا الخارجية. انقر بزر الماوس الأيمن علي التحكم وحدد نسخ التحليل إلى المجموعة.
  10. بعد النابضة بشكل صحيح جميع العينات ، نقل البيانات التي تم تحليلها عن طريق سحب وإسقاطها في محرر التخطيط.
    1. تراكب البيانات المحللة مع عنصر التحكم في محرر التخطيط.
    2. قم بتعيين الرسوم البيانية المطلوبة والشدات عن طريق تغيير محور x و y للرسومات البيانية المتراكبه.
    3. تصدير ملفات الصور عن طريق النقر علي زر التصدير وحفظ الرسوم البيانية في الموقع المطلوب.

5. المجهر البؤري

  1. نقل 5 μL من الملحقات-V-الخلايا الملونة علي شريحة المجهر وتغطيتها مع زلة الغطاء. يحفظ في مكان مظلم لمنع الرشح الضوئي.
  2. استخدام الليزر الارجون من المجهر مضان البؤري لمراقبه الخلايا متحمس في 488 nm مع التكبير المطلوب.
    ملاحظه: المجهر البؤري لا حاجه بالضرورة ويمكن استخدام اي المجهر مع قدرات مضان للحصول علي الصور الفلورية التي تثبت الضم الخامس ملزمه.
  3. الحصول علي صور فلورية لعنصر التحكم (الخلايا غير المعالجة) والخلايا المعالجة.
    ملاحظه: من المتوقع ان تظهر الخلايا غير المعالجة إشارات فلورية ضعيفه جدا ، بينما من المتوقع ان تظهر الخلايا المعالجة الفلورية الخضراء الساطعة علي اغشيها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحسين تركيز ايونوميمايسين

في حين ان ionomycin مطلوب للحث علي الخلايا الدموية ، يمكن ان تؤدي زيادة تركيزات ionomycin إلى انحلال الدم (اي تحلل كريات الدم الحمراء وإفراز الهيموجلوبين) ، والذي يحتاج إلى تجنب. علاج الكريات الحمراء مع ionomycin 1 μM في الحل الرنين ل 2 ح يكفي للحث علي اربيتوسيس ، كما يتضح من الوسم الناجحة مع الملحق-V اليكسا الطحين 488 المقارن والتقدير الكمي من قبل تحليل FACS (الشكل 1ا). التركيزات العالية من ايونومايسين (5 و 10 μM) يؤدي إلى زيادة طفيفه في الخلايا البينية (الشكل 1ا-د). ومع ذلك ، فان هذه التركيزات تعزز أيضا انحلال الكريات (الشكل 1ه) ، وهو أمر غير مرغوب فيه. من أجل البقاء اقل من 5 ٪ انحلال النصفي ، يجب استخدام 1 μM ionomycin.

وقت العلاج مع ايونوميمايسين

حضانة الكريات الحمراء مع ionomycin في الحل الرنين لأقل قدر 30 دقيقه كافيه للحث علي اريبتوسيس (الشكل 2ا). زيادة وقت الحضانة يزيد من مستوي الخلايا البينية ، كما تقاس بالملحق الخامس الربط المقايسة ، لمده تصل إلى 2 h (الشكل 2B ، C). ومع ذلك ، المزيد من الوقت الحضانة النتائج في انخفاض طفيف في مستوي اريبتوسيس (الشكل 2د). تم الحصول علي الحد الأقصى للارطح بعد 2 ح من العلاج مع ionomycin 1 μM ، النسبة لجميع أوقات العلاج الأخرى ، تم الحصول علي اقل من الخلايا البينية (الشكل 2ه). يتم عرض الرسوم البيانية للتدفق الخلوي التمثيلي في الشكل 2ا-د. الاضافه إلى ذلك ، ترد في الشكل 2هاء والشكل 2واو، علي التوالي ، متوسط النسبة المئوية وانحلال الدم ، لمختلف مرات العلاج مع ionomycin 1 μM. القيمة الأعلى لانحلال الكريات بعد 180 دقيقه يفسر الانخفاض في الخلية بعد نفس القدر من الحضانة (الشكل 2ه) كما توجد خلايا اقل قابليه للحياة عند 180 دقيقه من العلاج مع ionomycin.

وعلاوة علي ذلك ، عولجت الخلايا مع تركيزات منخفضه من ايونومايسين بما في ذلك 0 ، 0.25 ، 0.5 ، و 1 μM لفترات العلاج الأطول بما في ذلك 6 و 12 ح ، وتم قياس اريبتوسيس (الشكل 3). الخلايا المعالجة مع تركيزات ionomycin اقل ان 1 μM ل 6 و 12 ح تظهر انخفاض الخلايا البينية مقارنه مع الخلية المعالجة مع ionomycin 1 μM (الشكل 3). منذ تناقص تركيز وزيادة وقت التعرض لم تعزز اريبتوسيس ، تم استخدام 1 μM لتحريك الخلايا البينية.

تعتمد الخلايا الخلوية علي وقت الحضانة وتركيز الجلوكوز خارج الخلية

يؤثر تركيز الجلوكوز خارج الخلية علي نتيجة العملية. يتم ملاحظه القيم الأعلى لمعدل الخلايا عند الكريات الحمراء التي يتم احتضانها في محلول الرنين الخالي من الجلوكوز مقارنه بمحلول الرنين المحتوي علي الجلوكوز قبل الاحتضان باستخدام ionomycin 1 μM لمده 2 ساعة. يتم الحصول علي اعلي القيم المبرمج بعد 7 أيام من مرحله ما قبل الحضانة في كلا الحلين. ومع ذلك ، هو اعلي بعد الحضانة في حل الرنين خاليه من الجلوكوز مقارنه مع الحل العادي الرنين ، الذي يحتوي علي 5 مم الجلوكوز (انظر الشكل 4ا لمؤامرات التمثيلية والشكل 4ب للمقارنة بين الوسائل العالمية). الاضافه إلى ذلك ، تشير الرسوم البيانية مبعثر إلى الامام تاثير نضوب الجلوكوز علي انكماش كريات (الشكل 5ا-د). مبعثر إلى الامام هو مقياس لحجم الخلية استنادا إلى الانكسار الضوئي ، ومستوي الضوء المتناثرة يتناسب مباشره مع حجم الخلايا33. تظهر الخلايا المحتضنة في محلول الرنين الخالي من الجلوكوز اقل تشتت إلى الامام مقارنه بالخلايا المحتضنة في المخزن العازل المحتوي علي الجلوكوز (الشكل 5ه) ، مما يشير إلى انكماش الخلايا في بيئة خاليه من الجلوكوز.

بالاضافه إلى قياسات التدفق الخلوي ، لوحظت الخلايا تحت المجهر المحوري البؤري للتاكد من الخلية البينية. الكريات الحمراء مع عدم العلاج (الشكل 6ا) ومع العلاج ionomycin (الشكل 6ب) ووصفت مع الملحق-V اليكسا الطحين 488 المقارن ولاحظ تحت المجهر. وأظهرت الخلايا المعالجة اشاره فلورية ساطعه (الشكل 6(ب)) بسبب تجليد المرفق الخامس إلى PS في المنشور الخارجي. وعلي النقيض من ذلك ، أظهرت الخلايا التي لا يوجد فيها علاج اشاره فلورية ضعيفه جدا (الشكل 6ا) مما يشير إلى انه منخفض جدا. ويرد مزيد من الامثله علي الصور من الكريات الحمراء eryptotic المسمية مع الملحق-V مع اشاره مضان عاليه في الشكل 6ج.

Figure 1
الشكل 1: الرسوم البيانية التمثيلية لتاثير تركيزات ايونوميمايسين المختلفة علي الخلايا البينية وانحلال النصفي. تدفق الرسوم البيانية الخلوية من كريات الدم الحمراء تعامل مع (ا) 1 μm ، (ب) 5 μm ، و (ج) 10 μm ionomycin (رمادي) عند 37 درجه مئوية في 0.4 ٪ هيتوكريت في حل الرنين ل 2 ح. يشير الخط الأسود إلى الخلايا غير المعالجة. ويشار إلى النسبة المئوية للارطح في كل شكل. تم قياس التعرض فوسفاتيديلسيريني باستخدام ربط الملحق V. (د) الحساب يعني ± sd (ن = 3) من النسبة المئوية للخلايا المعالجة بتركيزات مختلفه من ايونوميسين بعد 2 ح العلاج ، و (ه) الحسابية يعني ± SD (ن = 3) من انحلال الكريات الحمراء من قبل تركيزات مختلفه من ionomycin في ظل نفس الظروف. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الأرقام التمثيلية بشان تاثير العديد من مرات العلاج ايونومايسين علي الخلايا البينية. تدفق الرسوم البيانية الخلوية من كريات الدم الحمراء تعامل مع 1 μM ionomycin (رمادي) في 37 درجه مئوية ل (ا) 30 دقيقه ، (ب) 60 دقيقه ، (ج) 120 دقيقه ، و (د) 180 دقيقه في 0.4 ٪ هيتوكريت في حل الرنين. يشير الخط الأسود إلى الخلايا غير المعالجة. ويشار إلى النسبة المئوية للارطح في كل شكل. تم قياس التعرض فوسفاتيديلسيريني من خلال ربط الملحق-V. (ه) الحساب يعني ± SD (ن = 3) من النسبة المئوية للخلايا المعالجة مع ionomycin 1 μM لأوقات مختلفه. تم الحصول علي اعلي اريبتوسيس بعد 120 دقيقه العلاج. (و) الحسابية يعني ± SD (ن = 3) من النسبة المئوية انحلال الخلايا المعالجة مع ionomycin 1 μM لأوقات مختلفه. للتحليل الإحصائي ، أجريت في اتجاه واحد ANOVA غير بارامتريه مع كروكال واليس الاختبار ، و erypتوسيس بعد 120 دقيقه العلاج كان اعلي بكثير من السيطرة كما هو مبين في لوحه e. * هو ل p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تاثير مختلف تركيزات ايونوميسين وأوقات العلاج علي الخلايا البينية. الحساب يعني ± SD (ن = 3) من النسبة المئوية للخلايا المعالجة مع تركيزات مختلفه من ionomycin يظهر بعد أوقات العلاج المختلفة. عولجت الخلايا بتركيزات منخفضه من ايونوميمايسين بما في ذلك 0, 0.25, 0.5, و 1 μM للتعرض الطويل (6 ساعات و 12 ساعة). وأديت التركيزات العالية والعلاجات الأطول إلى ارتفاع قيم الخلايا البينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تاثير نضوب الطاقة علي الخلايا البينية. (ا) تدفق الرسم البياني الخلوي التكراري لكريات الدم الحمراء تعامل مع 1 μM ionomycin (رمادي) في 37 درجه مئوية ل 2 ح في 0.4 ٪ هيتوكريت ، بعد الحضانة في حل الرنين خاليه من الجلوكوز (اعلي الأرقام) والحل الرنين (الأرقام السفلي) من 1 إلى 7 أيام ، ويكشف ان استنزاف الطاقة يسهل يشير الخط الأسود إلى الخلايا غير المعالجة. ويشار إلى النسب المئوية للارطح في الرسوم البيانية لكل يوم. (ب) الحسابية يعني ± SD (ن = 3) من النسبة المئوية للدم من كريات الدم الحمراء تعامل مع 1 μM ionomycin في 37 درجه مئوية لمده 2 ح في 0.4 ٪ هيتوكريت ، بعد الحضانة في الحل الرنين (القضبان السوداء) والجلوكوز خاليه من حل الرنين (أشرطه بيضاء) من 1 إلى 7 أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تاثير نضوب الطاقة علي حجم الخلية. الرسم البياني مبعثر إلى الامام لكريات الدم الحمراء التعامل مع 1 μM ionomycin في 37 درجه مئوية ل 2 ح في 0.4 ٪ هيتوكريت ، بعد حضانة في حل الرنين خاليه من الجلوكوز (الرمادي) والحل الرنين (الخط الأسود) ل (ا) 1 يوم ، (ب) 3 أيام ، (ج) 5أيام ، و يشير الرسم البياني المبعثر إلى الامام مع مرور الوقت إلى انكماش كريات في المخزن المؤقت الخالي من الجلوكوز. (ه) الحسابية يعني ± SD (ن = 3) من كثافة مبعثر إلى الامام من كريات الدم الحمراء تعامل مع 1 μM ionomycin في 37 درجه مئوية ل 2 ح في 0.4 ٪ هيتوكريت ، بعد الحضانة في الحل الرنين (القضبان السوداء) والجلوكوز خاليه الحل الرنين (القضبان البيضاء) من 1 إلى 7 أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الصور المجهرية البؤرية المحورية لكريات الدم الحمراء التعامل مع (ا) 0 μm ، (B) و (C) 1 μm ionomycin في 37 درجه مئوية لمده 2 ساعة في 0.4 ٪ هيتوكريت. تم استخدام التكبير الموضوعي 40x للصور في اللوحتين A و B ، و 100x تم استخدام التكبير الموضوعي للتقاط الصور للوحه c. PS في الكريات الحمراء الصحية يقع علي النشرة الداخلية لغشاء الخلية ، التالي لا يوجد اشاره مضان في لوحه A. في لوحات الكريات الحمراء B و C وقد تم المستحثة للارسبات وهناك اشاره فلوري مشرق الناتجة عن ربط الملحق الخامس إلى PS العابرة إلى النشرة الخارجية لغشاء الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

كثافة الخلايا/الهيكوريت تركيز ايونوميمايسين المخزن المؤقت مرحله ما قبل الحضانة وقت العلاج مع ايونوميمايسين طريقه الكشف مرجع
1.65 x 108 خلايا/مل 0.3 مم المخزن المؤقت A * 36 h في المخزن المؤقت A 1 ساعة المرفق الخامس 12
0.40 في المائة 1 مم حل الرنين 48 h في الرنين 1 ساعة المرفق الخامس 17
50 في المائة 10 مم المخزن المؤقت B * * - 3 ساعات ميريسيانيني 540 18
0.40 في المائة 1 مم حل الرنين 48 h في الرنين 1 ساعة المرفق الخامس 19
0.40 في المائة 1 مم حل الرنين 48 h في الرنين 1 ساعة المرفق الخامس 20
2 1 مم حل الرنين - 4 ساعات المرفق الخامس 21
0.40 في المائة 1 مم حل الرنين - 0.5 الساعة المرفق الخامس 22
10 1 مم حل الرنين - 3 ساعات المرفق الخامس 23
0.40 في المائة 10 مم حل الرنين - 0.5 الساعة المرفق الخامس 24
0.40 في المائة 1 مم حل الرنين 48 h في الرنين 0.5 الساعة المرفق الخامس 25
2 × 106 خلايا/مل 1 مم المحلول الملحي المخزن (HBS) - 0.5 الساعة المرفق الخامس 26
* العازلة A: 10 مم HEPES ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ملم KCl ، 1 مم MgCl2· 6h2س ، 10 ملم الجلوكوز ، و 1.8 mm cacl2· 2h2o
* * العازلة B: تريس 5 ملم ، 100 mM KC1 ، 60 mM NaCl ، و 10 ملم الجلوكوز

الجدول 1: البروتوكولات المختلفة المستخدمة في الأدبيات للحث علي الخلايا البينية باستخدام ionomycin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

والهدف من هذا الاجراء هو توفير القيم المثلي لتركيز ايوكوفيري ، والوقت العلاج ، وتركيز الجلوكوز خارج الخلية ، والتي هي عوامل هامه في ضمان الحث الناجح للارطح. ومن الخطوات الحاسمة في البروتوكول استنفاد الجلوكوز خارج الخلية ، والتي ، علي الرغم من أهميتها ، لم يتم التاكيد بما فيه الكفاية في الأدبيات. محتوي السكر في الحل العادي الرنين (5 ملم) له تاثير مثبط علي اريبتوسيس. استنزاف الجلوكوز في البيئة خارج الخلية يدفع الإجهاد الخلوي وينشط بروتين كيناز C (PKC) ، مما ادي إلى تفعيل قنوات الكالسيوم والبوتاسيوم. وهذا يؤدي إلى زيادة في دخول Ca2 + في الفضاء عصاري خلوي30,31,34 وينشط في نهاية المطاف علي التشويش16, الذي يزيد من الخلايا البينية. تنشيط قناه البوتاسيوم يؤدي أيضا إلى تسرب كلوريد البوتاسيوم من الخلية ، مما يؤدي إلى انكماش كريات35.

الاجراء المبين أعلاه يحتاج إلى القيام به مع إيلاء اهتمام خاص لانحلال النصفي. من المهم استخدام تركيز ايوكوفيري الأمثل ، والذي هو عاليه بما يكفي للحث علي الارفطح ، ومنخفضه بما يكفي لمنع انحلال الخلايا. المثل ، احتضان كريات الدم الحمراء مع ionomycin لفتره قصيرة من الوقت يؤدي إلى انخفاض الخلايا الخلوية في حين ان حضانة طويلة جدا قد تؤدي إلى اضطراب غشاء الخلية وانحلال الدم. وتجدر الاشاره أيضا إلى انه في حين ان البروتوكول المعروض موثوق به إلى حد كبير عندما يتم تنفيذه علي نفس العينة الكرياته ، فان الخلايا من مختلف الافراد تستجيب بشكل مختلف ل ionomycin وقد يكون هناك تباين بين الموضوعات بين العينات المختلفة.

وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتحليل البيانات من قياس التدفق الخلوي. تشير النسبة المئوية للخلايا التي تم الحصول عليها من مقياس التدفق الخلوي إلى النسبة المئوية لعدد الخلايا مع PS علي النشرة الخارجية الخاصة بها. ومع ذلك ، لا يمكن تمييز الخلايا ذات كثافة مختلفه من ربط الملحق V استنادا إلى هذا الرقم. الضم-V يربط إلى ps يتعرض علي سطح الخلية ، مع تقارب عاليه جدا وخصوصية عاليه ل ps36،37،38. ومع ذلك ، كما هو مبين في الصور المجهرية في هذا التقرير ، تظهر الخلايا المختلفة اختلافات في كثافة ربط الملحقات-V. الخلايا مع انخفاض PS علي اغشيه لها كثافة فلوري منخفضه ، في حين ان ارتفاع الاشغال PS علي غشاء الخلية يؤدي إلى كثافة فلوري اعلي.

يمكن تعديل البروتوكول المعروض في هذه الورقة عن طريق زيادة تركيز Ca2 + خارج الخلية. في هذا البروتوكول ، تم استخدام ionomycin للحث علي الخلايا البينية في وجود 1 مم CaCl2؛ اعلي Ca2 + تركيزات قد تؤدي إلى تعزيز مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، وقد تحفز المزيد من الخلايا البينية. الاضافه إلى ذلك ، قد تكون مختلفه الكالسيوم الايونيه ، مثل سيليتوهيور و calcimycin ، والقدرة المختلفة لتعزيز تركيز داخل الخلايا من Ca2 +، بالمقارنة مع ionomycin ، ويمكن ان يؤدي إلى قيم مختلفه للارطح. ومع ذلك ، يمكن تحقيق الثابتة من الكريات الحمراء باستخدام ionomycin مع البروتوكول المحدد ويمكن استخدامها في المختبر لفحص أليات الجزيئية للارطح ، وتقليد الظروف المرضية39،40في المختبر، والعلاجات المحتملة الشاشة التي تمنع اريبتوسيس ، من بين تطبيقات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحه R15ES030140 و NSF منحه CBET1903568. ومن المسلم به أيضا الدعم المالي من كليه روس للهندسة والتكنولوجيا وقسم الهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية في جامعه أوهايو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8, (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39, (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323, (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405, (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22, (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27, (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87, (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39, (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19, (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112, (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146, (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39, (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468, (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43, (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902, (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6, (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4, (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6, (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38, (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98, (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38, (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46, (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22, (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277, (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253, (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290, (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257, (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6, (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157, (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018, (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264, (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265, (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329, (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40, (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10, (4), 403-414 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics