אינדוקציה של אירוטוזה בתאי דם אדומים באמצעות היואופלפור סידן

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול עבור אינדוקציה של אריטוזה, מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, באמצעות סידן היואופלפור, איקונמיצין, מסופק. הערכה מוצלחת מוערכת על-ידי ניטור פוספוליזה של הלוקליזציה בעלון החיצוני של הממברנה. הגורמים המשפיעים על הצלחת הפרוטוקול נבדקו ותנאים אופטימליים שסופקו.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

האריציטוזה, מוות מתוכנת באמצעות אריתרופוציטים, מתרחש במספר מחלות המטאולוגיות ובמהלך הפגיעה באריתרופותאי. הסימן ההיכר של התאים eryptotic הוא אובדן של הקובית סימטריה של קרום התא, המוביל הטרנסלוקציה של פוספארידילסרין אל העלון החיצוני קרום. תהליך זה מופעל על ידי ריכוז תאיים מוגבר של Ca2 +, אשר מפעיל את הסמבלאז, אנזים המקל על התנועה הדו של פוספוליפידים בין עלונים ממברנה. בהתחשב בחשיבות הארגטוזה בתנאים נגועים שונים, היו מאמצים לגרום לארגטוזה בתוך מבחנה. מאמצים כאלה בדרך כלל להסתמך על הסידן היואופלפור, איקונמיצין, כדי לשפר את Ca תאיים2 + ריכוז ולגרום אריפיסיס. עם זאת, אי-התאמות רבים דווחו בספרות לגבי ההליך לגרימת שימוש באיקונמיצין. להלן, אנו מדווחים על פרוטוקול צעד אחר צעד לאיקונמיצין-המושרה באמצעות אריתרופוציטים אנושיים. אנו מתמקדים בצעדים חשובים בהליך, כולל ריכוז ביופור, זמן דגירה, ומחסור בגלוקוז, ולספק תוצאה מייצגת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפשר באופן מידי לגרום הארגיוסיס במעבדה.

Introduction

מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, הידוע גם בשם eryptosis, הוא נפוץ בתנאים קליניים רבים הפרעות המטולוגית. Eryptosis קשורה להתכווצות התאים ואובדן פוספוליפיד-סימטריה בקרום פלזמה התא1,2. אובדן של א. א. א. תוצאות ב רוברטסוניים של זרחן (PS), שומנים בדרך כלל מקומי בעלון הפנימי3,4, אל העלון החיצוני התא, אשר אותות מקרופאגים כדי phagocytose ולהסיר אריתרופוציטים פגום5,6,7,8. בסוף תוחלת החיים הנורמלית של אריתרופוציטים, הסרת התאים eryptotic על ידי מקרופאגים מבטיח את האיזון של אריתרופוציטים במחזור הדם. עם זאת, בתנאים חולים, כגון מחלת תאים מגל ו תלסמיה9,10,11, eryptosis משופרת עלולה לגרום לאנמיה חמורה2. בשל חשיבותו במחלות המטולוגית, יש עניין משמעותי בבדיקת הגורמים העלולים להיות מעכבים או לעכב את המנגנונים המולקולריים ואת המנגנון המולקולרי שבבסיס תהליך זה.

קרום הפלזמה של אריתרופוציטים בריאים הוא אסימטרי, עם שונים פוספוליפידים לוקליזציה על העלונים החיצוניים והפנימיים. א-סימטריה ממברנה מוסדר בעיקר על ידי פעולה של אנזימים ממברנה. Aminophospholipid טרנסלוקייס מקלה על ההובלה של aminophospholipids, PS ו פוספולידילטהולאמין (PE), על ידי הנחיית שומנים אלה אל העלון הפנימי של התא. מצד שני, floppase מסיע את כולין המכיל פוספוליפידים, זרחן (PC) ו ספינגומיילין (SM), מן הפנימי אל העלעל החיצוני של קרום התא12. עם זאת, בניגוד לתאים בריאים, קרום של האריתרופוציטים eryptotic מעורבל. הדבר נובע מהפעולה של אנזים שלישי, השבלקלז, אשר משבש פוספוליפיד על אי-סימטריה על ידי הקלה על ההובלה הדו-כיוונית של aminophospholipids13,14,15,16. הסמבלאז מופעל על ידי רמות תאיים גבוהות של Ca2 +. לכן, סידן ionophores, אשר להקל על ההובלה של Ca2 + על פני קרום התא12, הם השראות יעיל של אריפיסיס.

איקונמיצין, סידן מיואופלפור, נעשה שימוש נרחב כדי לגרום לאריטוסיס ב אריתרופוציטים12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. איקונמיצין יש גם קבוצות ידרופילי ו הידרופובי, אשר נחוצים כדי לאגד וללכוד Ca2 + יון, ולהעביר אותו לחלל ציטוסולג27,28,29. הדבר מוביל להפעלת הסמבלאז והטרנסלוקציה של PS לעלעל החיצוני, שניתן לאתרם בקלות באמצעות השימוש ב-אנסי-V, חלבון תאי בעל זיקה גבוהה ל-PS12. למרות שמפעיל את האירוטוזה על ידי איקונמיצין מדווחים בדרך כלל, יש אי-התאמה ניכרת בשיטה בספרות (שולחן 1). האוכלוסייה של אריתרופוציטים שעברו אריטוציטוזה תלוי בגורמים שונים כגון ריכוז ביוופפור, זמן טיפול עם היופופור, ואת תכולת הסוכר של הסביבה המרחפת (גלוקוז המחסור מפעיל ערוצי הקטיון ומקל את הכניסה של Ca2 + לתוך שטח cytosolic)30,31. עם זאת, יש מעט עקביות בגורמים אלה בספרות, מה שמקשה על ביצוע של האריטוסיס בלתי מתורבת.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד כדי לזרז את התהליך של אריתרופוציטים אנושיים. הגורמים המשפיעים על האריטוסיס המצליח כולל Ca2 + ריכוז, ריכוז ביופור, זמן טיפול, וטרום דגירה במאגר מרוקן גלוקוז נבדקים ערכים אופטימליים מדווחים. הליך זה מדגים כי טרום דגירה של אריתרופוציטים במאגר נטול גלוקוז מגדיל באופן משמעותי את אחוז האריטוזה לעומת מאגר המכיל גלוקוז. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדה כדי לייצר האריציטים eryptotic עבור יישומים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל דגימות הדם האנושיות המשמשות בפרוטוקול המתואר להלן נרכשו כדגימות דה מזוהה. שום אדם לא היה מעורב במישרין. או גויס למחקר הזה יש להשתמש בהנחיות של הצהרת הלסינקי כאשר המחקר כולל נושאים אנושיים.

1. בידוד אריתרופוציט מדם שלם

  1. הוסף 500 μL של דם שלם ב חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) (מאוחסן ב -4 ° c) לצינור מיקרוצנטריפוגה.
    הערה: דם שלם נרכש ב-ACD. לדברי החברה, 1.5 mL של ACD מתווסף 7 מ ל של דם שלם (8.5 mL כולל נפח).
  2. צנטריפוגה את הדם כולו על 700 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהסיר את הפלזמה ברורה ואת המעיל באפי דק באמצעות הפיפטה לעזוב את שכבת אריתרופואריציט אדום.
  3. הכינו 1 L של פתרון הצלצול המכיל 125 מ"מ מילימטר, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgSO4, 32 מ"מ hepes, 5 מ"מ גלוקוז, ו 1 מ"מ cacl2. להתאים את ה-pH ל 7.4 על ידי הוספת 2 μL טיפות של 1.0 M NaOH. כדי להכין פתרון לצלצול ללא גלוקוז, בצע את אותו הפרוטוקול, אך אל תכלול גלוקוז בפתרון.
  4. לשטוף את האריתרופוציטים 2x בפתרון הצלצול על ידי השעיית הגלולה תא ב 1.5 mL של הפתרון הצלצול, תפרידו ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT, והסרת supernatant.
  5. הפוך 0.4% המטוקריט על-ידי השעיית 40 μL של כמות האריתרופואריציט ב-9,960 μL של פתרון הצלצול ללא גלוקוז כדי להגיע לנפח הסופי של 10 mL.
    הערה: המטוקריט הוא מונח המשמש להתייחסות לחלק האמצעי של אריתרופוציטים בהשעיה. 0.4% המטוקריט הוא השעיה המכילה 0.4% אריתרופוציטים.
  6. מכשיר הבולם הסלולרי ב-37 ° c במשך 7 ימים.

2. טיפול באריתרופוציטים עם איקונמיצין ומדידה של המוליזה

  1. התמוססות 1 מ ג של איקונמיצין מלח סידן ב 630 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להגיע לריכוז הסופי של 2 מ"מ. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
  2. לקחת 1 מ ל של 0.4% המטקריט משלב 1.5 ולהוסיף 0.5 μL של 2 מ"מ ionomycin כדי להגיע לריכוז הסופי של 1 μM. הדגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
    1. השתמש ב-1 מ ל של המטוקריט ללא טיפול איקונמיצין כשליטה שלילית.
  3. צנטריפוגה את ionomycin-מטופלים המטוקריטים ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT, ולהסיר supernatants שלהם לעזוב את כדורי התא בתחתית הצינורות.
  4. לשטוף את התאים 3x עם הפתרון הצלצול על ידי השעיית כדורי התא ב 1.5 mL של הפתרון הצלצול, תפרידו ב 700 x g עבור 5 דקות ב RT ו להשליך את supernatants.
  5. כדי למדוד המוליזיס, להוסיף 1 מ ל של 0.4% המטקריט מטופל משלב 1.5 לצינור מיקרוצנטריפוגה ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° צ' כפקד שלילי עבור המוליזה (0%).
  6. הוסף 1 מ ל של 0.4% המטקריט מטופל משלב 1.5 לצינור מיקרוצנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 700 x g עבור 5 דקות ב RT. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מים מזוקקים לתוך הגלולה תא ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° צ' כפקד חיובי עבור המוליזיס (100%).
  7. הוסף 1 מ ל של האיקונמיצין שטופלו 0.4% המטוקריט משלב 2.2 לצינור מיקרוצנטריפוגה.
  8. צנטריפוגה את התאים מטופל, תאים מטופלים, ואת התאים במים מזוקקים ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  9. קח 200 μL של סופרנטנים ולהוסיף לצלחת 96-באר.
  10. למדוד את ספיגת ב 541 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלייט.
  11. חישוב המוליזיס באמצעות משוואה 132:

    % המוליזיס = (א- ת0)/(a100 -a0) * 100

    כאשר0 הוא ספיגת האריתרופוציטים בפתרון הצלצול,100 הוא ספיגת האריתרופוציטים במים, ו-T הוא ספיגת האריתרופוציטים המטופלת על ידי איקונמיצין.

3. שיטת הכריכה של אנשין-וי

  1. לדלל 2 מ ל של מאגר כריכה V 5x לספח של 5-mL ב 8 מ ל של פוספט מאגר פוספטים (PBS) כדי להשיג במאגר כריכה של 1x.
  2. השהה מחדש את כדורי התאים שטופלו על-ידי האיקונצין משלב 2.4 ב-1 mL של מאגר איגוד של 1x.
  3. קח 235 μL של השעיות התא במאגר הכריכה והוסף 15 μL של הקמח של אנשין V-אלקסה 488 המשלים.
  4. מודקון את התאים ב-RT עבור 20 דקות במקום חשוך. צנטריפוגה ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant.
  5. לשטוף את התאים 2x עם מאגר כריכת כריכה 1x, על ידי השעיית הגלולה תא ב 1.5 mL של מאגר הכריכה, תפרידו ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT והסרה של supernatant.
  6. השהה מחדש את כדורי התא ב-250 μL של מאגר כריכה של 1x לצורך זרימה של המדידות cy, מדידות.

4. להזרים את הציטוזה

  1. העבר 200 μL של היחידה לניקוי מוכתם ב-1 mL בפוליסטירן מוקצף עם שפופרות מתאימות עם cy, הזרימה.
  2. התחבר אל התוכנה cy, ללחוץ על כפתור הניסוי החדש . לחץ על כפתור הצינורית החדשה . בחר את הגיליון הגלובלי ולבחור את הניתוח להחיל כדי למדוד את עוצמת הקרינה עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ו-אורך הגל של 530 ננומטר.
  3. הגדר את מספר התאים ל-20,000 שייאספו עבור ניתוח מיון תאים המופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS).
  4. בחר את הצינור הרצוי ולחץ על כפתור עומס . לחץ על לחצן הקלטה עבור מדידות העברה פיזור ופיזור בצד. חזור על כל הדגימות.
  5. קליק ימני על לחצן הדגימה ולחץ על החל ניתוח אצווה כדי ליצור את קובץ התוצאה.
  6. קליק ימני על לחצן דגימה ולחץ על ליצור קבצי fsc.
  7. הוסף את הזרם cy, לנסות את הנתונים (קבצי FSC) למקום העבודה של התוכנה cy, לנסות לזרום.
  8. נתח את נתוני הפקד על-ידי בחירת אוכלוסיית התא המעניינים והוספת נתונים סטטיסטיים עבור ערך eryptosis.
    1. לחץ פעמיים על השליטה ובחר היסטוגרמה לעומת עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית.
    2. לחץ על כפתור השער כדי לצייר שער על ההיסטוגרמה אשר מציין את אחוז האריטוסיס.
  9. החל את אותה סטטיסטיקה עבור כל הצינורות הניסיוניים האחרים כדי להשיג את ערכי האריטוזה. לחץ לחיצה ימנית על הפקד ובחר העתק ניתוח לקבוצה.
  10. לאחר מעבר כראוי את כל הדגימות, להעביר את הנתונים שנותחו על ידי גרירה ושחרורו לתוך עורך הפריסה.
    1. שכבת-על של הנתונים שנותחו באמצעות הפקד בעורך הפריסה.
    2. קבעו את הכיוון הרצוי של היסטגרמות והעוצמות על-ידי שינוי ציר x ו-y של הגרפים הערוכים בשכבות.
    3. ייצוא קבצי תמונה על ידי לחיצה על כפתור ייצוא ולשמור את הגרפים במיקום הרצוי.

5. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. העברה 5 μL של אנשין-וי מוכתם תאים על שקופית מיקרוסקופ ולכסות אותו עם שובר כיסוי. שמור במקום אפל כדי למנוע הלבנה.
  2. השתמש לייזר ארגון של מיקרוסקופ הקונגניסטנטית לבחון את התאים הנרגשים ב 488 ננומטר עם המאגציות הרצויות.
    הערה: מיקרוסקופ קונפוקלית וקד אינו נחוץ בהכרח, כל מיקרוסקופ עם יכולות קרינה ניתן להשתמש כדי לקבל תמונות פלואורסצנטית הממחישים את הכריכה של אנשין-וי.
  3. להשיג תמונות של הזריחה של הפקד (תאים שאינם מטופלים) ותאים מטופלים.
    הערה: תאים שאינם מטופלים צפויים להראות אותות זריחה חלשה מאוד, ואילו תאים מטופלים צפויים להראות זריחה ירוקה בהירה על הקרומים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אופטימיזציה של הריכוז האיקונמיצין

בעוד איקונמיצין נדרש כדי לזרז את האריטוסיס, ריכוזי ionomycin מוגברת יכולים להוביל למוליזיס (כלומר, הליזה של אריתרופוציטים ושחרור של המוגלובין), אשר צריך להימנע. הטיפול של אריתרופוציטים עם 1 μM ionomycin בפתרון הצלצול עבור 2 h הוא מספיק כדי לגרום eryptosis, כפי שמעידים על ידי תיוג מוצלח עם אנשין-V אלקסה קמח 488 המשלים ו קוונפיקציה על ידי ניתוח FACS (איור 1א). ריכוזים גבוהים יותר של איקונמיצין (5 ו-10 μM) נובעים מעלייה קלה באריטוזה (איור 1א-ד). עם זאת, ריכוזים כאלה גם לשפר את המוליזיס (איור 1E), אשר אינו רצוי. על מנת להישאר מתחת 5% המוליזיס, יש להשתמש באיקונמיצין 1 μM.

זמן טיפול עם איקונמיצין

דגירה של אריתרופוציטים עם האיקונמיצין בפתרון הצלצול עבור מעט כמו 30 דקות הוא מספיק כדי לגרום האריטוזה (איור 2א). זמן דגירה מוגברת מגביר את רמת האריטוזה, כפי שנמדד על ידי שיטת הכריכה הנ, עד 2 שעות (איור 2ב, ג). עם זאת, זמן דגירה נוסף מביא ירידה קלה ברמת האריטוזה (איור 2ד). מקסימום eryptosis התקבל לאחר 2 שעות של טיפול עם אחד μM איקונמיצין, ועבור כל זמני הטיפול האחרים, eryptosis התחתון הושג (איור 2E). זרם מייצג cy, היסטגרמות מוצגות באיור 2א-ד. בנוסף, ממוצע אחוז האריטוזה והמוליזיס, לתקופות טיפול שונות עם 1 μM ionomycin, מוצגים באיור 2E ואיור 2F, בהתאמה. ערך גבוה יותר של המוליזה לאחר 180 דקות מסביר את הפחתת eryptosis לאחר כמות זהה של דגירה (איור 2E) כמו תאים פחות קיימא קיימים על 180 דקות של טיפול עם ionomycin.

יתר על כן, התאים טופלו בריכוזים נמוכים של ionomycin כולל 0, 0.25, 0.5, ו-1 μM לתקופות טיפול ארוכות יותר כולל 6 ו 12 h, ו eryptosis נמדד (איור 3). תאים מטופלים עם ריכוזי ionomycin של נמוך כי 1 μM עבור 6 ו 12 h להראות eryptosis התחתון לעומת התאים שטופלו 1 μM איקונמיצין (איור 3). מאז הפחתת הריכוז והגדלת זמן החשיפה לא לשפר את הגירוי, 1 μM השתמשו כדי להפעיל את האריטוסיס.

ארגטוזה תלוי בזמן הדגירה וריכוז הגלוקוז בתמציות

ריכוז הגלוקוז בתמציות. משפיע על תוצאות התהליך ערכי eryptosis גבוה יותר הם נצפו כאשר אריתרופוציטים הם טרום מודבטים בתמיסה ללא גלוקוז לעומת התמיסה המכילה גלוקוז לפני דגירה עם 1 μM ionomycin עבור 2 h. הערכים הארגוליטיים הגבוהים ביותר מתקבלים לאחר 7 ימים של דגירה מראש בשני הפתרונות. עם זאת, האריטוזה גבוה יותר לאחר הדגירה מראש בתמיסה ללא גלוקוז בהשוואה לפתרון הצלצול הרגיל, המכיל 5מילימטר גלוקוז (ראה איור 4לחלקות ייצוגיות ואיור 4ב' להשוואת האמצעים הגלובליים). בנוסף, היסטגרם פיזור הקדמי מציינים את השפעת המחסור בגלוקוז על הצטמקות אריתרופואריציט (איור 5A-D). פיזור קדמי הוא מדד לגודל תא המבוסס על השבירה הקלה, ורמת האור המתפזרת ביחס ישיר לגודל התאים33. התאים מודבטים בתמיסה ללא גלוקוז להראות הפיזור הקדמי פחות לעומת התאים מודבטים במאגר המכיל גלוקוז (איור 5E), המציין את הצטמקות התא בסביבה נטולת גלוקוז.

בנוסף לזרימת cy, מדידות הזרימה, התאים נצפו תחת מיקרוסקופ מיקוד של הקונטסיס כדי לאשר את האריציטוזה. אריתרופוציטים ללא טיפול (איור 6א) ועם הטיפול האיקונמיצין (איור 6ב) היו מסומנים ב-488, המשלים והנצפה במיקרוסקופ. תאים מטופלים הראו אות פלואורסצנטית בהיר (איור 6ב) בשל הכריכה של אנשין-וי ל-PS בעלון החיצוני. לעומת זאת, תאים עם טיפול לא הראו אות זריחה חלשה מאוד (איור 6א) המציין האריטוסיס נמוך מאוד. תמונות נוספות לדוגמה של אריתרופוציטים eryptotic מתויג עם אנשין-וי עם אות זריחה גבוהה מוצגים באיור 6ג.

Figure 1
איור 1: גרפים מייצגים של ההשפעה של ריכוזי איקונמיצין שונים על האריטוזה והמוליזיס. זרם cy, לנסות היסטגרמות של אריתרופוציטים מטופלים עם (A) 1 μm, (ב) 5 μm, ו (ג) 10 μm איקונמיצין (אפור) ב 37 ° c ב 0.4% המטוקריט בפתרון צלצול עבור 2 h. קו שחור מציין תאים שאינם מטופלים. אחוז האריטוזה מצוין בכל אחת מהספרות. החשיפה של פוספלידיסרין נמדדה באמצעות כריכת אנשין-וי. (ד) המשמעות היא ± SD (n = 3) של האחוזים של התאים שטופלו בריכוזים שונים של ionomycin לאחר 2 h טיפול, ו (ה) אריתמטיקה פירושו ± SD (n = 3) של המוליזה של אריתרופוציטים על ידי ריכוזים שונים של ionomycin באותם תנאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דמויות מייצגות על השפעת זמני טיפול שונים של איקונמיצין ב-eryptosis ההקיטונסה היסטלגרמות של אריתרופוציטים שטופלו 1 μM איקונמיצין (אפור) ב 37 ° צ' (א) 30 דקות, (ב) 60 דקות, (ג) 120 דקות, ו (ד) 180 דקות ב-0.4% המטוקריט בפתרון הצלצולים. הקו השחור מציין תאים שאינם מטופלים. אחוז האריטוזה מצוין בכל אחת מהספרות. החשיפה של פוספלידיסרין. נמדדה באמצעות מאגד המבקרים (ה) אריתמטיקה פירושו ± SD (n = 3) של האחוזים של התאים שטופלו ב-1 μm איקונמיצין עבור זמנים שונים. Eryptosis הגבוהה ביותר הושגה לאחר 120 דקות טיפול. (ו) אריתמטיקה פירושו ± SD (n = 3) של אחוז המוליזה של תאים שטופלו 1 μm איקונמיצין עבור זמנים שונים. לניתוח סטטיסטי, בכיוון אחד-ANOVA לא פרמטרית עם מבחן קרוקאל-ווליס בוצע, ו eryptosis לאחר הטיפול 120 דקות היה גבוה באופן משמעותי מאשר שליטה כפי שצוין בלוח E. * הוא עבור p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השפעת ריכוזי האיקונמיצין השונים וזמני הטיפול בארגיוסיס. אריתמטיקה פירושה ± SD (n = 3) של מספר האחוזים של התאים שטופלו בריכוזים שונים של ionomycin מוצג לאחר זמני טיפול שונים. התאים טופלו בריכוזים נמוכים של איקונמיצין כולל 0, 0.25, 0.5, ו-1 μM עבור חשיפה ארוכה יותר (6 h ו-12 h). ריכוזים גבוהים יותר וטיפולים ארוכים יותר הביאו לערכי eryptosis גבוה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השפעת המחסור באנרגיה על האריטוזה. (א) זרימה cy, היסטוגרמה לאריתרופוציטים שטופלו ב-1 μM איקונמיצין (אפור) ב-37 ° צ' ב-2 h ב 0.4% המטוקריט, לאחר הדגירה מראש בתמיסה ללא גלוקוז (דמויות בצמרת) ופתרון הצלצול (הדמויותהתחתונות) מ 1 עד 7 ימים, מגלה כי המחסור באנרגיה מקלה הקו השחור מציין תאים שאינם מטופלים. אחוזי האריטוזה מצוינים בגרפים עבור כל יום. (ב) אריתמטיקה פירושה ± SD (n = 3) של האחוזים של אריפיסיס של אריתרופוציטים שטופלו 1 μm איקונמיצין ב 37 ° c עבור 2 h ב 0.4% המטוקריט, לאחר הדגירה מראש בפתרון צלצול (ברים שחורים) ו-גלוקוז חינם הפתרון צלצול (ברים לבנים) מ 1 עד 7 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: השפעת המחסור באנרגיה על גודל התא. היסטוגרמה פיזור החוצה עבור אריתרופוציטים מטופלים עם 1 μM איקונמיצין ב-37 ° c עבור 2 h ב 0.4% המטוקריט, לאחר שלפני הדגירה בפתרון הצלצולים ללא גלוקוז (אפור) ופתרון הצלצולים (קו שחור) ליום 1, (ב) 3 ימים, (ג) 5 ימים, ו (ד) 7 ימים. היסטוגרמה פיזור קדימה לאורך זמן מצביע על הצטמקות אריתרופואריציט במאגר נטול גלוקוז. (ה) המשמעות היא ± SD (n = 3) של עוצמות פיזור של כוונות של אריתרופוציטים שטופלו 1 μm ionomycin ב-37 ° c עבור 2 h ב 0.4% המטוקריט, לאחר הדגירה המוקדמת של פתרון הצלצול (ברים שחורים) ופתרון הצלצולים ללא גלוקוז (ברים לבנים) מ 1 עד 7 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונות מיקרוסקופית הקרינה מיקרואוסקופיה של אריתרופוציטים מטופלים עם (A) 0 μm, (ב) ו-(ג) 1 μm איקונצין ב 37 ° צ' ב-2 h ב 0.4% המטוקריט. 40 x ההגדלה האובייקטיבית שימש עבור תמונות פאנלים A ו-B, ו 100x המטרה ההגדלה שימש לצלם תמונות עבור פאנל C. PS ב אריתרופוציטים בריאים ממוקם על העלון הפנימי של קרום התא, ולכן אין אות פלואורסצנטית בלוח A. ב פאנלים B ו-C אריתרופוציטים המושרה עבור eryptosis ויש אות הזריחה בהיר וכתוצאה מכך הכריכה של אנשין-וי ל-PS הממוקם אל העלעל החיצוני של קרום התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

צפיפות תא/המטוקריט איקונמיצין אגר טרום דגירה זמן טיפול עם איקונמיצין שיטת איתור פניה
1.65 x 108 תאים/mL 0.3 ממ ' מאגר A * 36 h במאגר A מיכל ברכה אנשין וי 12
0.40% 1 ממ ' תמיסת צלצול 48 h בצלצול מיכל ברכה אנשין וי 17
50% 10 ממ ' מאגר B * * - שלוש שעות מרקיאניין 540 18
0.40% 1 ממ ' תמיסת צלצול 48 h בצלצול מיכל ברכה אנשין וי 19
0.40% 1 ממ ' תמיסת צלצול 48 h בצלצול מיכל ברכה אנשין וי 20
2 1 ממ ' תמיסת צלצול - 4 ה אנשין וי 21
0.40% 1 ממ ' תמיסת צלצול - 0.5 h אנשין וי 22
10 1 ממ ' תמיסת צלצול - שלוש שעות אנשין וי 23
0.40% 10 ממ ' תמיסת צלצול - 0.5 h אנשין וי 24
0.40% 1 ממ ' תמיסת צלצול 48 h בצלצול 0.5 h אנשין וי 25
2 x 106 תאים/mL 1 ממ ' תמיסת מלח באגירה (HBS) - 0.5 h אנשין וי 26
* מאגר: 10 מ"מ HEPES, 150 mM הנאקל, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl2· 6h2O, 10 מ"מ גלוקוז, ו 1.8 mm cacl2· 2h2o
* * מאגר B: 5 mM טריס, 100 mM KC1, 60 מ"מ הנאל, ו 10 מ"מ גלוקוז

שולחן 1: פרוטוקולים שונים המשמשים בספרות כדי לגרום לארגיוסיס באמצעות איקונמיצין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה של הליך זה היא לספק ערכים אופטימליים עבור ריכוז ביופור, זמן הטיפול, וריכוז גלוקוז החילוץ, שהם גורמים חשובים בהבטחת אינדוקציה מוצלחת של האריטוסיס. צעד קריטי בפרוטוקול הוא דלדול הגלוקוז של החילוץ, אשר, למרות חשיבותו, לא הודגש מספיק בספרות. תכולת הסוכר בפתרון הצלצול הרגיל (5 מ"מ) היא בעלת השפעה מעכבות על האריטוזה. המחסור בגלוקוז בסביבת החילוץ גורם למתח התאי ולהפעלת החלבון קינאז C (PKC), וכתוצאה מכך הפעלת ערוצי סידן ואשלגן. התוצאה היא עלייה בערך של Ca2 + בחלל ציטוסולג30,31,34 ובסופו של דבר מפעיל את הבמבקלז16, אשר מגדיל את האריציטוזה. הפעלת ערוץ האשלגן גורמת גם לדליפת אשלגן כלוריד מתוך התא, אשר מוביל להתכווצות התכווצות35.

ההליך המתואר לעיל צריך להתבצע עם תשומת לב ספציפית המוליזיס. חשוב להשתמש בריכוז ביואופלפור מיטבי, שהוא גבוה מספיק כדי לזרז, ומספיק נמוך כדי למנוע המוליזיס. באופן דומה, הדגירה של אריתרופוציטים עם איקונמיצין לתקופה קצרה של תוצאות זמן קצר eryptosis נמוך בעוד דגירה ארוכה מאוד עלול להוביל הפרעה קרום התא המוליזיס. יש לציין כי בעוד הפרוטוקול המוצג הוא אמין מאוד כאשר מבוצע על אותו דגם אריתרופוציטוטה, תאים מאנשים שונים להגיב באופן שונה כדי ionomycin וייתכן שיש השתנות בין הנושאים בין דגימות שונות.

תשומת לב מיוחדת יש לשלם לניתוח נתונים מתוך הזרימה cy, לנסות. האחוזים שהתקבלו מהcytomמטר הזורם מציינים את אחוז אוכלוסיית התאים עם PS בעלון החיצוני שלהם. עם זאת, לא ניתן להבדיל בין תאים עם עוצמות שונות של כריכת כריכה מבוססת-ששין-וי בהתבסס על מספר זה. אנשין-V נקשר ל ps חשוף על פני השטח התא, עם זיקה גבוהה מאוד וספציפיות הגבוהה ל PS36,37,38. עם זאת, כפי שמוצג בתמונות המיקרוסקופיה בדוח זה, תאים שונים מציגים הבדלים בעוצמת הכריכה של אנשין-וי. התאים עם PS נמוך על הקרומים שלהם יש עוצמות זריחה נמוכה, ואילו תפוסת PS גבוהה יותר על קרום התא תוצאות בעוצמות של כוונות זריחה גבוהה יותר.

הפרוטוקול המוצג במאמר זה יכול להיות שונה על ידי הגדלת החילוץ Ca2 + ריכוז. בפרוטוקול זה, השתמשו באיקונמיצין כדי לזרז את המצב בנוכחות של 1 מ"מ CaCl2; גבוה יותר Ca2 + ריכוזים עלול להוביל לרמות הסידן תאיים משופרת והוא עשוי לגרום ליותר ארגוליזה. בנוסף, סידן ionophores שונים, כגון בסלטופור ו מיוזימיצין, יכול להיות יכולת שונה כדי לשפר את הריכוז התאיים של Ca2 +, לעומת ionomycin, והוא יכול לגרום ערכי eryptosis שונים. עם זאת, ניתן להשיג את הצורה העקבית של אריתרופוציטים באמצעות איקונמיצין עם הפרוטוקול המחולק לרשת וניתן להשתמש בה במעבדה כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים של הארגטוזה, לחקות את התנאים הנגועים39,40בתחומי החוץוהtherapeutics הפוטנציאליים של המסך, ובהם יישומים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק R15ES030140 ו NSF מענק CBET1903568. תמיכה פיננסית מהמכללה ראס להנדסה וטכנולוגיה והמחלקה להנדסה כימית וביוקולקולארית באוניברסיטת אוהיו מוכרת גם כן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8, (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39, (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323, (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405, (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22, (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27, (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87, (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39, (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19, (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112, (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146, (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39, (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468, (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43, (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902, (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6, (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4, (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6, (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38, (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98, (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38, (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46, (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22, (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277, (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253, (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290, (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257, (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6, (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157, (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018, (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264, (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265, (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329, (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40, (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10, (4), 403-414 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics