Induktion der Eryptose in roten Blutkörperchen mit einem Calcium-Ionophor

Biochemistry

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Summary

Ein Protokoll zur Induktion von Eryptose, programmierter Zelltod in Erythrozyten, mit dem Calciumionophor, Ionomycin, wird zur Verfügung gestellt. Erfolgreiche Eryptose wird durch Dieüberwachung der Lokalisation Phosphatidylserin in der Membran äußere Packungsbeilage bewertet. Faktoren, die den Erfolg des Protokolls beeinflussen, wurden untersucht und optimale Bedingungen bereitgestellt.

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Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

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Abstract

Eryptose, Erythrozyten programmiertzelltod, tritt bei einer Reihe von hämatologischen Erkrankungen und während der Verletzung von Erythrozyten. Ein Kennzeichen eryptotischer Zellen ist der Verlust der kompositorischen Asymmetrie der Zellmembran, die zur Translokation von Phosphatidylserin in die äußere Membranbroschüre führt. Dieser Prozess wird durch eine erhöhte intrazelluläre Konzentration von Ca2+ausgelöst, die Scramblase aktiviert, ein Enzym, das die bidirektionale Bewegung von Phospholipiden zwischen Membranbroschüren erleichtert. Angesichts der Bedeutung der Eryptose unter verschiedenen krankheiten gab es Bemühungen, Eryptose in vitrozu induzieren. Solche Bemühungen haben sich im Allgemeinen auf das Calciumionophor, Ionomycin, zur Verbesserung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und induzieren Eryptose verlassen. Jedoch, viele Diskrepanzen wurden in der Literatur über das Verfahren zur Induktion von Eryptose mit Ionomycin berichtet. Hierin berichten wir über ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für Ionomycin-induzierte Eryptose bei menschlichen Erythrozyten. Wir konzentrieren uns auf wichtige Schritte im Verfahren, einschließlich der Ionophorkonzentration, Inkubationszeit und Glukoseermangel, und liefern repräsentative Ergebnisse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Reproduzierbar Eryptose im Labor zu induzieren.

Introduction

Programmierter Zelltod bei Erythrozyten, auch bekannt als Eryptose, ist bei vielen klinischen Erkrankungen und hämatologischen Erkrankungen häufig. Eryptose ist mit Zellschrumpfung und dem Verlust der Phospholipid-Asymmetrie in der Zellplasmamembran1,2verbunden. Der Verlust der Asymmetrie führt zur Translokation von Phosphatidylserin (PS), einem Lipid, das normalerweise in der inneren Packungsbeilage3,4, zur äußeren Zellbroschüre lokalisiert ist, die Anmacrophagen an Phagozytose sendet und defekte Erythrozyten5,6,7,8. Am Ende der normalen Lebensdauer von Erythrozyten sorgt die Entfernung eryptotischer Zellen durch Makrophagen für das Gleichgewicht der erythrozyten im Umlauf. Jedoch, bei kranken Bedingungen, wie Sichelzellerkrankung und Thalassämie9,10,11, verbesserte Eryptose kann zu schwerer Anämie führen2. Aufgrund seiner Bedeutung bei hämatologischen Erkrankungen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung der Faktoren, die die Eryptose auslösen oder hemmen, und der molekularen Mechanismen, die diesem Prozess zugrunde liegen.

Die Plasmamembran gesunder Erythrozyten ist asymmetrisch, wobei verschiedene Phospholipide an den äußeren und inneren Blättchen lokalisiert werden. Membranasymmetrie wird in erster Linie durch die Wirkung von Membranenzymen reguliert. Aminophospholipid translocase erleichtert den Transport von Aminophospholipiden, PS und Phosphatidylethanolamin (PE), indem diese Lipide auf die innere Packungsbeilage der Zelle geleitet werden. Auf der anderen Seite transportiert Floppase das Cholin enthaltende Phospholipide, Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin (SM), von der inneren zur äußeren Packungsbeilage der Zellmembran12. Im Gegensatz zu gesunden Zellen wird die Membran eryptotischer Erythrozyten jedoch durchwühlt. Dies ist auf die Wirkung eines dritten Enzyms, Scramblase, zurückzuführen, das die Phospholipid-Asymmetrie durch die Erleichterung des bidirektionalen Transports von Aminophospholipiden13,14,15,16stört. Scramblase wird durch erhöhte intrazelluläre Konzentrationen von Ca2+aktiviert. Daher sind Calciumionophore, die den Transport von Ca2+ über die Zellmembran12erleichtern, effiziente Induktoren der Eryptose.

Ionomycin, ein Calcium-Ionophor, wurde weit verbreitet, um Eryptose in Erythrozyten12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26zu induzieren. Ionomycin hat sowohl hydrophile als auch hydrophobe Gruppen, die notwendig sind, um Ca2+ Ion zu binden und zu erfassen und in den zytosolischen Raum27,28,29zu transportieren. Dies führt zur Aktivierung von Scramblase und Translokation von PS in die äußere Packungsbeilage, die leicht mit Annexin-V, einem zellulären Protein mit einer hohen Affinität zu PS12,nachgewiesen werden kann. Obwohl die Auslösung der Eryptose durch Ionomycin häufig berichtet wird, besteht eine erhebliche Methodabweichung in der Literatur (Tabelle 1). Die Population der Erythrozyten, die sich einer Eryptose unterziehen, hängt von verschiedenen Faktoren wie der Ionophorkonzentration, der Behandlungszeit mit Ionophor und dem Zuckergehalt der extrazellulären Umgebung ab (Glukose-Erschöpfung aktiviert Kationenkanäle und erleichtert den Eintritt von Ca2+ in den zytosolischen Raum)30,31. Allerdings gibt es wenig Konsistenz in diesen Faktoren in der Literatur, so dass es schwierig ist, Eryptose reproduzierbar in vitrodurchzuführen.

In diesem Protokoll stellen wir ein Schrittweiseverfahren zur Induziniösisierung von Eryptose bei menschlichen Erythrozyten vor. Es werden Faktoren untersucht, die eine erfolgreiche Eryptose beeinflussen, einschließlich Ca2+-Konzentration, Ionophorkonzentration, Behandlungszeit und Vorinkubation im Glukose-Erschöpften Puffer und es werden optimale Werte gemeldet. Dieses Verfahren zeigt, dass die Vorinkubation von Erythrozyten in einem glukosefreien Puffer den Prozentsatz der Eryptose im Vergleich zum glukosehaltigen Puffer signifikant erhöht. Dieses Protokoll kann im Labor verwendet werden, um eryptotische Erythrozyten für verschiedene Anwendungen zu produzieren.

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Protocol

Alle menschlichen Blutproben, die in dem nachstehend beschriebenen Protokoll verwendet wurden, wurden als nicht identifizierte Proben erworben. Für diese Studie wurden keine menschlichen Probanden direkt beteiligt oder rekrutiert. Die Leitlinien der Erklärung von Helsinki sollten verwendet werden, wenn die Forschung menschliche Subjekte betrifft.

1. Erythrozyten-Isolation vom Vollblut

  1. Fügen Sie 500 l Vollblut in saurer Citratdextrose (ACD) (bei 4 °C) zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu.
    HINWEIS: Vollblut wurde in ACD gekauft. Nach Angaben des Unternehmens werden 1,5 ml ACD zu 7 ml Vollblut (8,5 ml Gesamtvolumen) hinzugefügt.
  2. Zentrifugieren Sie das Ganze Bei 700 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie das klare Plasma und das dünne, buffy Mantel mit einer Pipette, um die rote Erythrozytenschicht zu verlassen.
  3. Bereiten Sie 1 L Ringer Lösung mit 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM Glukose und 1 mM CaCl2vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 2 L-Tropfen von 1,0 M NaOH hinzufügen. Um glukosefreie Ringer-Lösung vorzubereiten, folgen Sie dem gleichen Protokoll, aber enthalten Sie keine Glukose in der Lösung.
  4. Waschen Sie die Erythrozyten 2x in Ringer-Lösung, indem Sie das Zellpellet in 1,5 ml Ringer-Lösung aufhängen, bei RT bei 700 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  5. Machen Sie einen 0,4% Hämatokrit, indem Sie 40 l des Erythrozytenpellets in 9.960 l glukosefreier Ringer-Lösung wieder aufheben, um ein Endvolumen von 10 ml zu erreichen.
    HINWEIS: Hämatokrit ist ein Begriff, der verwendet wird, um sich auf den Volumenanteil von Erythrozyten in suspension zu beziehen. Ein 0,4% Hämatokrit ist eine Suspension, die 0,4% Erythrozyten enthält.
  6. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 °C für 7 Tage.

2. Behandlung von Erythrozyten mit Ionomycin und Messung der Hämolyse

  1. Lösen Sie 1 mg Ionomycin-Calciumsalz in 630 l Dimethylsulfoxid (DMSO) auf, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Aliquot und lagern bei -20 °C.
  2. Nehmen Sie 1 ml des 0,4% Hämatokrits ab Schritt 1,5 und fügen Sie 0,5 l von 2 mM Ionomycin hinzu, um eine Endkonzentration von 1 m zu erreichen. Inkubieren Sie für 2 h bei 37 °C.
    1. Verwenden Sie 1 ml des Hämatokrits ohne Ionomycin-Behandlung als Negativkontrolle.
  3. Zentrifugieren Sie die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Hämatokriten bei 700 x g für 5 min bei RT, und entfernen Sie ihre Überwälstmittel, um die Zellpellets an der Unterseite der Rohre zu verlassen.
  4. Waschen Sie die Zellen 3x mit Ringer-Lösung, indem Sie die Zellpellets in 1,5 ml Ringer-Lösung aufhängen, bei 700 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und die Überwälten entsorgen.
  5. Um die Hämolyse zu messen, fügen Sie 1 ml des unbehandelten 0,4% Hämatokrits von Schritt 1,5 in ein Mikrozentrifugenrohr und inkubieren 2 h bei 37 °C als negative Kontrolle für Hämolyse (0%).
  6. 1 ml des unbehandelten 0,4% Hämatokrits aus Schritt 1,5 in ein Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 700 x g für 5 min bei RT geben. Überstand entfernen und 1 ml destilliertes Wasser in das Zellpellet geben und 2 h bei 37 °C als positive Kontrolle für Hämolyse (100%) inkubieren.
  7. 1 ml des mit Ionomycin behandelten 0,4% Hämatokrits ab Schritt 2.2 in ein Mikrozentrifugenrohr geben.
  8. Zentrifugieren Sie die unbehandelten Zellen, behandelten Zellen und die Zellen in destilliertem Wasser bei 700 x g für 5 min bei RT.
  9. Nehmen Sie 200 L der Überstande und fügen Sie zu einer 96-Well-Platte hinzu.
  10. Messen Sie die Absorption bei 541 nm mit einem Mikroplattenleser.
  11. Berechnen Sie die Hämolyse mit Gleichung 132:

    %Hämolyse = (AT - A0)/(A100 - A0)*100

    wobei A0 die Absorption von Erythrozyten in Ringer-Lösung ist, A100 die Absorption von Erythrozyten im Wasser und AT die Absorption von behandelten Erythrozyten durch Ionomycin.

3. Anhangin-V-Bindungstest

  1. 2 ml des 5x Annexin V Bindungspuffers in 8 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) verdünnen, um 1x Bindungspuffer zu erhalten.
  2. Setzen Sie die mit Ionomycin behandelten und unbehandelten Zellpellets von Schritt 2,4 in 1 ml 1x Bindungspuffer wieder aus.
  3. Nehmen Sie 235 l der Zellsuspensionen in den Bindungspuffer und fügen Sie 15 L Von Annexin V-Alexa Flour 488 Konjugat hinzu.
  4. Inkubieren Sie die Zellen bei RT für 20 min an einem dunklen Ort. Zentrifuge bei 700 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie den Überstand.
  5. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1x Bindungspuffer, indem Sie das Zellpellet in 1,5 ml des Bindungspuffers aufhängen, bei 700 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  6. Setzen Sie die Zellpellets in 250 l 1x Bindungspuffer für Durchflusszytometriemessungen wieder auf.

4. Durchflusszytometrie

  1. Übertragen Sie 200 l der als beizufügenden Erythrozyten auf 1 ml runde Unterteil-Polystyrolröhren, die mit der Durchflusszytometrie kompatibel sind.
  2. Melden Sie sich bei der Flow-Zytometrie-Software an und klicken Sie auf den neuen Experiment-Button. Klicken Sie auf die neue Tube-Taste. Wählen Sie das globale Blatt aus, und wählen Sie die Anwendungsanalyse aus, um die Fluoreszenzintensität mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm zu messen.
  3. Legen Sie die Anzahl der Zellen auf 20.000 fest, die für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gesammelt werden sollen.
  4. Wählen Sie das gewünschte Rohr und klicken Sie auf Ladetaste. Klicken Sie auf die Aufnahmetaste für Vorwärtsstreuungs- und Seitenstreumessungen. Wiederholen Sie dies für alle Proben.
  5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Musterschaltfläche und klicken Sie auf Chargenanalyse anwenden, um die Ergebnisdatei zu generieren.
  6. Rechtsklick auf Muster-Button und klicken Sie auf FSC-Dateien generieren.
  7. Fügen Sie die Flow Cytometry Data (FSC-Dateien) in den Arbeitsplatz der Durchflusszytometriesoftware ein.
  8. Analysieren Sie die Steuerdaten, indem Sie die von Interesse vorhandene Zellpopulation auswählen und Statistiken für den Eryptosewert hinzufügen.
    1. Doppelklicken Sie auf Steuerung und wählen Sie Histogramm versus Fluoreszenzintensität.
    2. Klicken Sie auf die Tor-Taste, um ein Tor auf dem Histogramm zu zeichnen, das den Prozentsatz der Eryptose angibt.
  9. Wenden Sie die gleichen Statistiken für alle anderen Versuchsröhren an, um die Eryptosewerte zu erhalten. Rechtsklick auf Steuerelement und wählen Sie Kopieranalyse zu gruppieren.
  10. Nachdem Sie alle Samples ordnungsgemäß gegating, übertragen Sie die analysierten Daten, indem Sie sie ziehen und in den Layout-Editor ablegen.
    1. Überlagern Sie die analysierten Daten mit Steuerung im Layout-Editor.
    2. Legen Sie die gewünschten Histogramme und Intensitäten fest, indem Sie die x- und y-Achse der überlagerten Diagramme ändern.
    3. Exportieren Sie Bilddateien, indem Sie auf die Schaltfläche "Exportieren" klicken, und speichern Sie die Diagramme an der gewünschten Position.

5. Konfokale Mikroskopie

  1. Übertragen Sie 5 l von Anhangin-V-gefärbten Zellen auf ein Mikroskopschlitten und bedecken Sie es mit einem Abdeckschlupf. Halten Sie sich an einem dunklen Ort, um Photobleichungen zu verhindern.
  2. Verwenden Sie argon laser des konfokalen Fluoreszenzmikroskops, um die bei 488 nm angeregten Zellen mit den gewünschten Vergrößerungen zu beobachten.
    HINWEIS: Ein konfokales Mikroskop ist nicht unbedingt erforderlich, und jedes Mikroskop mit Fluoreszenzfähigkeiten kann verwendet werden, um Fluoreszenzbilder zu erhalten, die eine Annexin-V-Bindung belegen.
  3. Erhalten Sie Fluoreszenzbilder der Kontrolle (nicht behandelte Zellen) und behandelter Zellen.
    HINWEIS: Von nicht behandelten Zellen wird erwartet, dass sie sehr schwache Fluoreszenzsignale aufweisen, während von behandelten Zellen eine hellgrüne Fluoreszenz auf ihren Membranen erwartet wird.

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Representative Results

Optimierung der Ionomycinkonzentration

Während Ionomycin erforderlich ist, um Eryptose zu induzieren, können erhöhte Ionomycinkonzentrationen zu Hämolyse führen (d. h. Lyse von Erythrozyten und Freisetzung von Hämoglobin), die vermieden werden muss. Die Behandlung von Erythrozyten mit 1 M Ionomycin in Ringer-Lösung für 2 h reicht aus, um Eryptose zu induzieren, wie eine erfolgreiche Etikettierung mit Annexin-V Alexa Mehl 488 Konjugat und Quantifizierung durch FACS-Analyse belegt (Abbildung 1A). Höhere Konzentrationen von Ionomycin (5 und 10 m) führen zu einem leichten Anstieg der Eryptose (Abbildung 1A-D). Solche Konzentrationen verstärken jedoch auch die Hämolyse (Abbildung 1E), was nicht erwünscht ist. Um unter 5% Hämolyse zu bleiben, sollte 1 'M Ionomycin verwendet werden.

Behandlungszeit mit Ionomycin

Die Inkubation von Erythrozyten mit Ionomycin in Ringer-Lösung für nur 30 min reicht aus, um Eryptose zu induzieren (Abbildung 2A). Erhöhte Inkubationszeit erhöht den Eryptosespiegel, gemessen am Anhang-V-bindungstest, um bis zu 2 h(Abbildung 2B,C). Eine weitere Inkubationszeit führt jedoch zu einer leichten Abnahme des Eryptosespiegels (Abbildung 2D). Die maximale Eryptose wurde nach 2 h Behandlung mit 1 M Ionomycin und für alle anderen Behandlungszeiten eine niedrigere Eryptose erhalten (Abbildung 2E). Repräsentative Strömungszytometrie-Histogramme sind in Abbildung 2A-Ddargestellt. Darüber hinaus sind in Abbildung 2E bzw. Abbildung 2Fdie durchschnittliche prozentuale Eryptose und Hämolyse für verschiedene Behandlungszeiten mit 1 M Ionomycin dargestellt. Der höhere Wert der Hämolyse nach 180 min erklärt die Reduktion der Eryptose nach der gleichen Menge an Inkubation (Abbildung 2E) wie weniger lebensfähige Zellen nach 180 min Behandlung mit Ionomycin existieren.

Darüber hinaus wurden die Zellen mit niedrigen Konzentrationen von Ionomycin einschließlich 0, 0,25, 0,5 und 1 M für längere Behandlungszeiten einschließlich 6 und 12 h behandelt und Eryptose gemessen (Abbildung 3). Zellen, die mit Ionomycin-Konzentrationen von niedrigeren als 1 M für 6 und 12 h behandelt wurden, zeigen eine niedrigere Eryptose im Vergleich zu den Zellen, die mit 1 M Ionomycin behandelt wurden (Abbildung 3). Da die Verringerung der Konzentration und die Erhöhung der Expositionszeit die Eryptose nicht verbesserten, wurde 1 M verwendet, um Eryptose auszulösen.

Eryptose ist abhängig von Inkubationszeit und extrazellulärer Glukosekonzentration

Die extrazelluläre Glukosekonzentration beeinflusst das Ergebnis des Prozesses. Höhere Eryptosewerte werden beobachtet, wenn Erythrozyten in glukosefreier Ringer-Lösung vorbebrütet werden, verglichen mit einer glukosehaltigen Ringer-Lösung vor der Inkubation mit 1 M Ionomycin für 2 h. Die höchsten Eryptosewerte werden nach 7 Tagen Vorinkubation in beiden Lösungen ermittelt. Allerdings ist die Eryptose nach der Vorinkubation in der glukosefreien Ringer-Lösung höher als bei der normalen Ringer-Lösung, die 5 mM Glukose enthält (siehe Abbildung 4A für repräsentative Parzellen und Abbildung 4B zum Vergleich globaler Mittel). Darüber hinaus zeigen Vorwärtsstreuhistogramme die Wirkung des Glukoseabbaus auf die Erythrozytenschrumpfung an (Abbildung 5A-D). Die Vorwärtsstreuung ist ein Maß für die Zellgröße basierend auf der Lichtbrechung, und der Lichtgrad ist direkt proportional zur Größe der Zellen33. Die zelleninkubierten in glukosefreien Ringer-Lösung zeigen weniger Vorwärtsstreuung im Vergleich zu den Zellen inGlukose-haltigen Puffer inkubiert (Abbildung 5E), was auf Zellschrumpfung in der glukosefreien Umgebung.

Zusätzlich zu den Durchflusszytometriemessungen wurden Zellen unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um die Eryptose zu bestätigen. Erythrozyten ohne Behandlung (Abbildung 6A) und mit Ionomycin-Behandlung (Abbildung 6B) wurden mit Annexin-V Alexa Mehl 488 Konjugat gekennzeichnet und unter Dem Mikroskop beobachtet. Behandelte Zellen zeigten aufgrund der Bindung von Annexin-V an PS in der äußeren Packungsbeilage ein helles Fluoreszenzsignal (Abbildung 6B). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen ohne Behandlung ein sehr schwaches Fluoreszenzsignal (Abbildung 6A), das auf eine sehr geringe Eryptose hindeutet. Weitere Beispielbilder von eryptotischen Erythrozyten mit Anhang-V mit hohem Fluoreszenzsignal sind in Abbildung 6Cdargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Graphiken der Wirkung verschiedener Ionomycinkonzentrationen auf Eryptose und Hämolyse. Durchflusszytometrie Histogramme von Erythrozyten, die mit (A) 1 M, (B) 5 M und (C) 10 M Ionomycin (grau) bei 37 °C bei 0,4% Hämatokrit in Ringer-Lösung für 2 h behandelt wurden. Schwarze Linie zeigt nicht behandelte Zellen an. Der Prozentsatz der Eryptose wird in jeder Abbildung angegeben. Die Phosphatidylserin-Exposition wurde mit Annexin-V-Bindung gemessen. (D) Arithmetische mittels SD (n = 3) der prozentualen Eryptose von Zellen, die nach 2 h Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ionomycin behandelt werden, und (E) arithmetische Mittel für SD (n = 3) der Hämolyse von Erythrozyten durch unterschiedliche Ionomycinkonzentrationen unter denselben Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Zahlen über die Wirkung verschiedener Ionomycin-Behandlungszeiten auf die Eryptose. Durchflusszytometrie Histogramme von Erythrozyten, die mit 1 'M Ionomycin (grau) bei 37 °C behandelt werden, für (A) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min und (D) 180 min bei 0,4% Hämatokrit in Ringer-Lösung. Schwarze Linie zeigt nicht behandelte Zellen an. Der Prozentsatz der Eryptose wird in jeder Abbildung angegeben. Die Phosphatidylserin-Exposition wurde durch Annexin-V-Bindung gemessen. (E) Arithmetischemittel : SD (n = 3) der prozentualen Eryptose von Zellen, die mit 1 M Ionomycin für unterschiedliche Zeiten behandelt wurden. Die höchste Eryptose wurde nach 120 min Behandlung erhalten. (F) Arithmetischemittel : SD (n = 3) der prozentualen Hämolyse von Zellen, die mit 1 M Ionomycin für unterschiedliche Zeiten behandelt wurden. Für die statistische Analyse wurde eine unwegsame nicht-parametrische ANOVA mit Kruskal-Wallis-Test durchgeführt, und die Eryptose nach 120 min Behandlung war signifikant höher als die Kontrolle, wie in Panel E angegeben. * ist für p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Wirkung verschiedener Ionomycinkonzentrationen und Behandlungszeiten auf Dieyptose. Arithmetischemittel sD (n = 3) der prozentualen Eryptose von Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ionomycin behandelt werden, werden nach verschiedenen Behandlungszeiten gezeigt. Die Zellen wurden mit niedrigen Konzentrationen von Ionomycin einschließlich 0, 0,25, 0,5 und 1 m für eine längere Exposition (6 h und 12 h) behandelt. Höhere Konzentrationen und längere Behandlungen führten zu höheren Eryptosewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Wirkung des Energieabbaus auf die Eryptose. (A) Durchflusszytometrie histogramm für Erythrozyten, die mit 1 M Ionomycin (grau) bei 37 °C für 2 h bei 0,4 % Hämatokrit behandelt werden, nach Vorinkubation in glukosefreier Ringerlösung (obere Zahlen) und Ringerlösung (untere Werte) von 1 bis 7 Tagen, zeigt, dass der Energieabbau die Eryptose erleichtert. Schwarze Linie zeigt nicht behandelte Zellen an. Die Prozentsätze der Eryptose werden in den Diagrammen für jeden Tag angegeben. (B) Arithmetischemittel für SD (n = 3) der prozentualen Eryptose von Erythrozyten, die mit 1 M Ionomycin bei 37 °C für 2 h bei 0,4 % Hämatokrit behandelt werden, nach Vorinkubation in Ringer-Lösung (schwarze Balken) und glukosefreier Ringer-Lösung (weiße Balken) von 1 bis 7 Tagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Auswirkungen des Energieabbaus auf die Zellgröße. Vorwärtsstreuhistogramm für Erythrozyten, die mit 1 M Ionomycin bei 37 °C bei 2 h bei 0,4% Hämatokrit behandelt werden, nach Vorinkubation in glukosefreier Ringerlösung (grau) und Ringerlösung (schwarze Linie) für (A) 1 Tag, (B) 3 Tage, (C) 5 Tage und (D) 7 Tage. Das Vorwärtsstreuhistogramm im Laufe der Zeit zeigt Erythrozytenschrumpfung im glukosefreien Puffer an. (E) Arithmetische mittels SD (n = 3) der Vorwärtsstreuintensitäten von Erythrozyten, die mit 1 M Ionomycin bei 37 °C bei 37 °C bei 0,4 % Hämatokrit, nach Vorinkubation in Ringerlösung (schwarze Balken) und glukosefreier Ringerlösung (weiße Balken) von 1 bis 7 Tagen behandelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Konfokale Fluoreszenzmikroskopiebilder von Erythrozyten, die mit (A) 0 M, (B) und (C) 1 M Ionomycin bei 37 °C bei 0,4 % Hämatokrit behandelt wurden. 40x objektive Vergrößerung wurde für Bilder in den Panels A und B verwendet, und 100x objektive Vergrößerung wurde verwendet, um Bilder für Panel C zu nehmen. PS in gesunden Erythrozyten befindet sich auf der inneren Packungsbeilage der Zellmembran, daher gibt es kein Fluoreszenzsignal in Panel A. In den Paneelen B und C wurden Erythrozyten für Eryptose induziert, und es gibt ein helles Fluoreszenzsignal, das sich aus der Bindung von Annexin-V an PS ergibt, die an die äußere Packungsbeilage der Zellmembran transloziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zelldichte /hämatokrit Ionomycin-Konzentration Puffer Vorinkubation Behandlungszeit mit Ionomycin Erkennungsmethode Verweis
1,65 x 108 Zellen/ml 0,3 mM Puffer A* 36 h im Puffer A 1 h Anhang V 12
0.40% 1 mM Ringer-Lösung 48 h in Ringer 1 h Anhang V 17
50% 10 mM Puffer B** - 3 h Merocyanin 540 18
0.40% 1 mM Ringer-Lösung 48 h in Ringer 1 h Anhang V 19
0.40% 1 mM Ringer-Lösung 48 h in Ringer 1 h Anhang V 20
2% 1 mM Ringer-Lösung - 4 h Anhang V 21
0.40% 1 mM Ringer-Lösung - 0,5 h Anhang V 22
10% 1 mM Ringer-Lösung - 3 h Anhang V 23
0.40% 10 mM Ringer-Lösung - 0,5 h Anhang V 24
0.40% 1 mM Ringer-Lösung 48 h in Ringer 0,5 h Anhang V 25
2 x 106 Zellen/ml 1 mM HEPES-gepufferte Saline (HBS) - 0,5 h Anhang V 26
*Puffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,6H2O, 10 mM Glukose und 1,8 mM CaCl2
**Puffer B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl und 10 mM Glucose

Tabelle 1: Verschiedene Protokolle, die in der Literatur verwendet werden, um Eryptose mit Ionomycin zu induzieren.

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Discussion

Ziel dieses Verfahrens ist es, optimale Werte für die Ionophorkonzentration, die Behandlungszeit und die extrazelluläre Glukosekonzentration zu liefern, die wichtige Faktoren für eine erfolgreiche Induktion der Eryptose sind. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Erschöpfung der extrazellulären Glukose, die trotz ihrer Bedeutung in der Literatur nicht ausreichend betont wurde. Der Zuckergehalt in normaler Ringer-Lösung (5 mM) wirkt hemmend auf die Eryptose. Glukosemangel in der extrazellulären Umgebung induziert zellulären Stress und aktiviert Proteinkinase C (PKC), was zur Aktivierung von Kalzium- und Kaliumkanälen führt. Dies führt zu einer Zunahme des Eintrags von Ca2+ im zytosolischen Raum30,31,34 und aktiviert schließlich die Scramblase16, die eryptosis erhöht. Die Aktivierung des Kaliumkanals führt auch zu Kaliumchlorid-Leckaustreten aus der Zelle, was zu Erythrozytenschrumpfung35führt.

Das oben beschriebene Verfahren muss unter besonderer Berücksichtigung der Hämolyse durchgeführt werden. Es ist wichtig, eine optimierte Ionophorkonzentration zu verwenden, die hoch genug ist, um Eryptose zu induzieren, und niedrig genug, um Hämolyse zu verhindern. In ähnlicher Weise führt die Inkubation von Erythrozyten mit Ionomycin für einen kurzen Zeitraum zu einer niedrigen Eryptose, während eine sehr lange Inkubation zu Zellmembranstörungen und Hämolyse führen kann. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass das vorgelegte Protokoll zwar sehr zuverlässig ist, wenn es an der gleichen Erythrozytenprobe durchgeführt wird, aber Zellen verschiedener Individuen unterschiedlich auf Ionomycin reagieren und es möglicherweise eine Inter-Subjekt-Variabilität zwischen verschiedenen Proben gibt.

Besondere Aufmerksamkeit sollte der Datenanalyse aus der Durchflusszytometrie gewidmet werden. Der prozentuale Eryptoseanteil aus dem Durchflusszytometer gibt den Prozentsatz der Zellpopulation mit PS auf ihrer äußeren Packungsbeilage an. Zellen mit unterschiedlichen Intensitäten der Annexin-V-Bindung können jedoch anhand dieser Zahl nicht unterschieden werden. Annexin-V bindet an die PS, die auf der Zelloberfläche exponiert ist, mit einer sehr hohen Affinität und hohen Spezifität zu PS36,37,38. Wie jedoch in den Mikroskopiebildern in diesem Bericht gezeigt, zeigen verschiedene Zellen Unterschiede in der Bindungsintensität von Annexin-V. Die Zellen mit niedrigem PS auf ihren Membranen haben niedrige Fluoreszenzintensitäten, während eine höhere PS-Belegung auf der Zellmembran zu höheren Fluoreszenzintensitäten führt.

Das in diesem Dokument vorgestellte Protokoll kann durch Erhöhung der extrazellulären Ca2+-Konzentration geändert werden. In diesem Protokoll wurde Ionomycin verwendet, um Eryptose in Gegenwart von 1 mM CaCl2zu induzieren; höhere Ca2+-Konzentrationen können zu verbesserten intrazellulären Kalziumspiegeln führen und mehr Eryptose auslösen. Darüber hinaus können verschiedene Calciumionophore, wie Selekophor und Calcimycin, eine andere Fähigkeit haben, die intrazelluläre Konzentration von Ca2+im Vergleich zu Ionomycin zu verbessern, und zu unterschiedlichen Eryptosewerten führen. Eine konsistente Eryptose von Erythrozyten kann jedoch mit Ionomycin mit dem skizzierten Protokoll erreicht werden und kann im Labor verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der Eryptose, mimisch erkrankte Erkrankungen39,40in vitround Siebpotenziale, die Eryptose hemmen, unter anderem zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R15ES030140 und den NSF-Zuschuss CBET1903568 unterstützt. Die finanzielle Unterstützung durch das Russ College of Engineering and Technology und das Department of Chemical and Biomolecular Engineering an der Ohio University wird ebenfalls anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

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References

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