OaAEP1-mediert enzymatisk syntese og immobilisering av polymerisert protein for enkeltmolekylet kraftspektroskopi

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å konjugere proteinmonomer ved enzymer som danner proteinpolymer med en kontrollert sekvens og immobilisere den på overflaten for enkeltmolekylkraftspektroskopistudier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kjemiske og bio-konjugering teknikker har blitt utviklet raskt de siste årene og tillate bygging av protein polymerer. Imidlertid er en kontrollert proteinpolymeriseringsprosess alltid en utfordring. Her har vi utviklet en enzymatisk metodikk for å konstruere polymerisert protein trinnvis i en rasjonelt kontrollert sekvens. I denne metoden er C-terminus av et protein monomer NGL for proteinbøyning ved hjelp av OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mens N-terminus var et cleavable TEV (tobakk etsevirus) spaltingssted pluss en L (ENLYFQ/GL) for midlertidig N-beskyttende terminaling. Følgelig var OaAEP1 i stand til å legge til bare én proteinmonomer om gangen, og deretter tev protease spaltet N-terminus mellom Q og G for å avsløre NH2-Gly-Leu. Deretter er enheten klar for neste OaAEP1 ligation. Det konstruerte polyproteinet undersøkes ved å utfolde individuell proteindomene ved hjelp av atomkraftmikroskopibasert enkeltmolekylstyrkespektroskopi (AFM-SMFS). Derfor gir denne studien en nyttig strategi for polyproteinengineering og immobilisering.

Introduction

Sammenlignet med syntetiske polymerer har naturlige multidomener proteiner en ensartet struktur med et godt kontrollert antall og type underdomener1. Denne funksjonen fører vanligvis til forbedret biologisk funksjon og stabilitet2,3. Mange tilnærminger, som cystein-basert disulfid bindingkobling og rekombinant DNA-teknologi, er utviklet for å bygge et slikt polymerisert protein med flere domener4,5,6,7. Den tidligere metoden resulterer imidlertid alltid i en tilfeldig og ukontrollert sekvens, og sistnevnte fører til andre problemer, inkludert vanskeligheten for overuttrykk av giftige og store proteiner og rensing av komplekst protein med cofactor og andre delikate enzymer.

For å møte denne utfordringen utvikler vi en enzymatisk metode som konjugerer proteinmonomer sammen for polymer / polyprotein på en trinnvis måte ved hjelp av en proteinligase OaAEP1 kombinert med en protease TEV8,9. OaAEP1 er en streng og effektiv endopeptidase. To proteiner kan knyttes sammen kovalent som Asn-Gly-Leu sekvens (NGL) gjennom to termini av OaAEP1 på mindre enn 30 min hvis N-terminus er Gly-Leu rester (GL) og den andre som C-terminus er NGL rester10. Imidlertid fører bruk av OaAEP1 bare for å koble proteinmonomer til en proteinpolymer med en ukontrollert sekvens som cysteinbasert koblingsmetode. Derfor utformer vi N-terminus av proteinenheten med et flyttbart TEV-proteaseområde pluss en leukcinerester som ENLYFQ/G-L-POI. Før TEV-spalingen ville ikke N-terminalen delta i OaAEP1 ligation. Og så blir GL-rester ved N-terminus, som er kompatible med ytterligere OaAEP1 ligation, utsatt etter TEV-spaltingen. Dermed har vi oppnådd en sekvensiell enzymatisk biosyntesemetode for polyprotein med en relativt godt kontrollert sekvens.

Her kan vår trinnvise enzymatiske syntesemetode brukes i polyproteinprøvepreparat, inkludert sekvenskontrollert og ukontrollert, og proteinimmobilisering for enkeltmolekylstudier også, spesielt for det komplekse systemet som metalloprotein.

Videre tillater AFM-baserte SMFS-eksperimenter oss å bekrefte proteinpolymerkonstruksjonen og stabiliteten på enkeltmolekylnivå. Enkeltmolekylkraftspektroskopi, inkludert AFM, optisk pinsett og magnetisk pinsett, er et generelt verktøy i nanoteknologi for å manipulere biomolekyl mekanisk og måle stabiliteten11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20. Enkeltmolekylet AFM har vært mye brukt i studiet av protein (un)folding21,22,23,24,25, styrkemåling av reseptor-ligand interaksjon26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, uorganisk kjemisk binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 og metall-ligand binding i metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Her brukes enkeltmolekylet AFM til å verifisere den syntetiserte polyproteinsekvensen basert på det tilsvarende proteinutfoldende signalet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinproduksjon

  1. Genklone
    1. Kjøp gener koding for protein av interesse (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, cellulosebindende modul (CBM), dockerin-X domene (XDoc) og samhold fra Ruminococcus flavefacience, tobakk etch virus (TEV) protease, elastin-lignende polypeptider (ELPs).
    2. Utfør polymerasekjedereaksjon og bruk tre-restriksjons fordøyelsesenzymsystem BamHI-BglII-KpnI for å kombinere genet fra forskjellige proteinfragmenter.
    3. Bekreft alle gener ved direkte DNA-sekvensering.
  2. Proteinuttrykk og produksjon
    1. Transform E. coli BL21(DE3) med pQE80L-POI eller pET28a-POI plasmid for uttrykk.
    2. Plukk én enkelt koloni i 15 ml LB medium med respektive antibiotika (f.eks. 100 μg/ml amicillinnatriumsalt eller 50 μg/ml, kanamycin). Fortsett å riste kulturer ved 200 o/min ved 37 °C i 16-20 timer.
    3. Fortynn overnattingskulturene i 800 ml LB medium (1:50 fortynning). For rubredoksin, sentrifuge kulturen på 1800 x g,deretter resuspendere i 15 ml M9 medium (supplert med 0,4% glukose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4),og deretter fortynne den i 800 ml M9 medium.
    4. Inkuber kulturen ved 37 °C mens du rister ved 200 rpm, til kulturen når en optisk tetthet ved 600 nm (OD600) på 0,6. Spar 100 μL prøve av kulturen som pre-induksjonskontroll for testing av proteinuttrykk.
    5. Indusere proteinuttrykk ved å legge IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM og rist kulturen ved 37 °C i 4 timer ved 200 o/min. Reserver en 100 μL prøve av kulturen som post-induksjonskontroll for testing av proteinuttrykk.
    6. Sentrifuge kulturen ved 13.000 x g for 25 min ved 4 °C og oppbevares ved -80 °C før rensing.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  3. Rensing av protein av interesse
    1. Resuspender cellene i 25 ml lysebuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 som inneholder DNase, RNase, PMSF) og bruk en sonikator (15% amplitude) for å lyse den i 30 min på is.
    2. Avklar cellelysatet ved 19 000 x g i 40 min ved 4 °C.
    3. Pakning 1 ml (sengevolum) av Co-NTA eller Ni-NTA affinitetssøyle og vask kolonnen med 10 kolonnevolumer (CV) av ultrarent vann og deretter 10 CV-er med vaskebuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazole, pH 7,4) ved tyngdekraften.
    4. Pass proteinet supernatant gjennom kolonnen ved tyngdekraften flyt i tre ganger.
    5. Hell vaskebufferen på kolonnen med 50 CV-er for å bevege seg bort kontaminantproteiner.
    6. Elute bundet protein med 3 CV-er med iskald elutionbuffer (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7.4). Når det gjelder rubredoksinproteiner, er det nødvendig med ytterligere anionutvekslingsutveksling ved hjelp av anionutvekslingskolonne ved pH 8,5 ved 4 °C.
    7. Analyser eksemplet etter SDS-PAGE.

2. Funksjonalisering av dekkslip og cantilever overflate

  1. Funksjonalisert tilberedning av dekselslipoverflate
    1. Løs opp 20 g kaliumkromat i 40 ml ultrarent vann. Tilsett langsomt 360 ml konsentrert svovelsyre til kaliumkromatløsningen med glassstangrør forsiktig og for å forberede kromsyren.
      FORSIKTIG: Kjemikaliet som brukes her og den endelige kromsyre naversterkt og sur. Arbeid med riktig verneutstyr. Løsningen frigjør varme når du legger til konsentrert svovelsyre, noe som betyr langsom tilsetning og riktig pause for nedkjøling.
    2. Rengjør og aktiver en glassdekselslip ved 80 °C i 30 min ved behandling med kromsyre. Dypp trekksedlene helt i 1% (v /v) APTES toluen løsning i 1 time ved romtemperatur mens du beskytter dem mot lys.
    3. Vask dekkslip med toluen og absolutt etylalkohol og tørk dekkslip med en strøm av nitrogen.
    4. Inkuber dekselet slip ved 80 ° C i 15 min og deretter avkjøles til romtemperatur.
    5. Tilsett 200 μL sulfo-SMCC (1 mg/ml) i dimetylsulfoksid (DMSO) oppløsning mellom to immobiliserte dekkslepper og inkubator i 1 t beskyttet mot lys.
    6. Vask dekksslip med DMSO først og deretter med absolutt etylalkohol for å fjerne gjenværende sulfo-SMCC.
    7. Tørk dekksslip under en strøm av nitrogen.
    8. Rør 60 μL av 200 μM GL-ELP50nm-C proteinoppløsning på en funksjonalisert dekkslip og inkubator i ca 3 timer.
    9. Vask dekksslip en ultrarent vann for å fjerne ureagert GL-ELP50nm-C.
      MERK: Funksjonaliserte dekkslepper er i stand i ca. to uker under lagring ved 4 °C.
  2. Funksjonalisert cantilever overflateforberedelse
    1. Rengjør cantilevers ved 80 °C i 10 min ved behandling med kromsyre.
    2. Funksjonaliser cantilever ved amino-silanization med 1% (v / v) APTES toluen løsning og deretter bake cantilever ved 80 ° C i 15 min før bøyning til sulfo-SMCC.
    3. Koble C-ELP50nm-NGL til overflaten med maleimidgruppen av sulfo-SMCC i 1,5 timer.
    4. Vask bort ureagert c-ELP50nm-NGL på dekkslip av ultrarent vann.
    5. Dypp en funksjonalisert cantilever i 200 μL av 50 μM GL-CBM-XDoc proteinoppløsning som inneholder 200 nM OaAEP1 ved 25 °C i 20-30 min. Bruk deretter AFM-buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) til å vaske bort ureagert protein.
      MERK: Overflatekjemien til kantileverene og dekksslipen er like.

3. Trinnvis polyproteinpreparat med kontrollerte sekvenser

  1. Koble ligation enheten Coh-tev-L-POI-NGL til GL-ELP50nm immobilisert på dekkslip overflaten av OaAEP1 for 30 min.
  2. Bruk 15-20 ml AFM-buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) til å vaske bort ureagerte proteiner.
  3. Tilsett 100 μL TEV protease (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glyserol, pH 8.0) for å holde proteinenheten på T gjenkjenneEV-stedet i 1 t ved 25 °C.
  4. Bruk 15-20 ml AFM-buffer til å vaske bort gjenværende proteiner.
  5. Koble ligation enheten Coh-tev-L-POI-NGL til GL-Ub-NGL-Glass av OaAEP1 for 30 min.
  6. Gjenta trinn 3,3 til 3,5 N-1 ganger for å bygge proteinkonstruksjon GL-(Ub)n-NGL på glassoverflaten. Utelate den siste TEV cleavage reaksjon å reservere samhold på protein-polymer som Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Måling og dataanalyse av AFM Experiment

  1. AFM-målinger
    1. Tilsett 1 ml AFM-buffer til kammeret med 10 mM CaCl2 og 5 mM askorbinsyre.
    2. Velg D-spissen til den funksjonaliserte AFM-sonden for eksperimentet. Bruk det likepartisjonte teoremet til å kalibrere cantilever i AFM-buffer med en nøyaktig fjærkonstant (k) verdi før hvert eksperiment.
    3. Fest cantilever-spissen til prøveoverflaten for å danne Cohesin/Dockerin-paret.
    4. Trekk cantilever en konstant hastighet på 400 nm·s−1 fra overflaten. I mellomtiden registrerer du kraftforlengelseskurven med en samplingshastighet på 4000 Hz.
  2. Dataanalyse
    1. Bruk JPK-databehandling velg force-extension spor.
    2. Bruk programvare til å analysere sporene. Monter kurvene med den ormlignende kjedemodellen (WLC) av polymerelastitet og oppnå utfoldende kraft og konturlengdeøkning for individuell proteinutfoldende topp.
    3. Monter histogrammer av utfoldende krefter med gaussisk modell for å oppnå de mest sannsynlige verdiene av utfoldende kraft (u>) og konturlengdeøkning (<ΔLc>).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NGL-rester introdusert mellom tilstøtende proteiner av OaAEP1 ligation vil ikke påvirke protein monomerstabilitet i polymeren som utfoldende kraft (u>), og konturlengdeøkning (<ΔLc>) kan sammenlignes med forrige studie (Figur 1). Renseresultatet av rubredoksinproteinet er vist i figur 2. For å bevise proteinet etter TEV-spalting er kompatibelt med følgende OaAEP1 ligation for å konstruere proteinpolymer med en kontrollsekvens og konstruksjonen er høyeffektivitet, gir figur 3 et SDS-PAGE-bilde som referanse. Trinnene i funksjonalisert cantilever og coverslip forberedelse er beskrevet i figur 4. Den trinnvise enzymatiske biosyntesen og immobiliseringen av polyprotein på dekkslip er vist i figur 5. Bruk denne protokollen, en proteinpolymer med den kontrollerte sekvensen kan bygges og egnet for AFM-baserte SMFS-eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: AFM-baserte SMFS-målinger av polyprotein bygget av OaAEP1. (A) Typiske sagtannlignende kraftforlengelseskurver av Ub (kurve 1 i blått) ble vist med forventet ΔLc på ~ 23 nm. (B) Scatter plottet presenterer forholdet mellom Ub utfoldende kraft (202 ± 44 pN, gjennomsnitt ± s.d., n = 198) og ΔLc (23 ± 2 nm, gjennomsnitt ± s.d.). Dette tallet er endret fra Ref.8. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: UV-Vis absorbansspektret til GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL og GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. Fe(III)-form Rd (Venstre spektrum, farget i brun, PDB kode: 1BRF) presenterttypiskUV-Vis absorpsjon topper på 495 nm og 579 nm mens Zn-formen ikke (Høyre spektrum, farget i vin, PDB kode: 1IRN). Dette tallet er endret fra Ref.8. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: SDS-PAGE gel resultater av trinnvis fordøyelse og ligation ved hjelp av TEV protease og OaAEP1 for å bygge Ub dimer. Baner 1–4 viste Coh-tev-L-Ub, resultatproteinblandingen av TEV-spalting, ren SFGFP-TEV-protease og renset produkt (GL-Ub). Lanes 5-7 viste den spaltede GL-Ub og Coh-tev-L-Ub-NGL ligation blanding med (Lane 5) eller uten (Lane 6) OaAEP1 og ren OaAEP1. Dette tallet er endret fra Ref.8. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Prosessdiagram som beskriver hvert trinn for funksjonalisering av glasstrekkog cantilever. Etter rengjøring og aktivering av kromsyre deler du en funksjonsslip og cantilever lignende funksjonaliseringsprosess, bortsett fra det siste trinnet der GL-ELP50nm-C par med dekkslip mens C-ELP50nm-NGL par med cantilever. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Prosessdiagram som beskriver hvert trinn for polyproteinimmobilisering på overflaten. Topp venstre prosessflytdiagram viser trinnvis bygging av polyprotein med kontrollerte sekvenser på dekkslip. Topp høyre diagram viser utarbeidelsen av den funksjonaliserte cantilever som brukes i AFM-målingene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Typiske utfoldende spor av proteinpolymerene med en rasjonelt kontrollert sekvens av AFM-baserte SMFS. (A) Typisksagtann-lignende force-extension kurver av Ub presentert δlc av ~ 23 nm som forventet. (B) Typiske force-forlengelse kurver av Rd presentert ΔLc av ~ 13 nm som forventet. (C)Typiske kraftforlengelseskurver av (Ub-Rd)n proteinblanding der den blå toppen betyr utfoldende hendelser i Ub mens den røde betyr Rd. Dette tallet er endret fra Ref.8. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Supplerende figur 1: SDS-PAGE gel resultater av proteinligation effektivitet under forskjellig forhold mellom to reaktanter. Ligation effektiviteten var 20% når forholdet er 1 til 1 og nådde 75% i forholdet mellom 10 til 1. Dette tallet er endret fra Ref.8. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en protokoll for enzymatisk biosyntese og immobilisering av polyprotein og verifisert polyproteindesignen av AFM-baserte SMFS. Denne metodikken gir en ny tilnærming til å bygge protein-polymer i en designet sekvens, som utfyller tidligere metoder for polyprotein engineering og immobilisering4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.

Sammenlignet med den klassiske rekombinant DNA-metodikken for polyproteinkonstruksjon7,62,baserer vår metode på ligasjonen mellom små proteinmonomerer. Dermed tillater det uttrykk for store eller giftige proteinmolekyler for polyproteinkonstruksjon. I tillegg tillater det rensing av proteinmonomeren før bøyning.

Sammenlignet med den mye brukte bi-cysteinmetoden som danner intermolekylærdisulfidbinding for proteinpolymerisering4,resulterer vår enzymatiske metode ved hjelp av både OaAEP1 og TEV protease i et polyprotein med en relativt kontrollert sekvens og definert tilkoblingsgeometri. Og det bruker ikke cystein, som er en viktig funksjonell rest for mange proteiner.

Vår metode er for det meste lik sortasebasert proteinkonjugasjon59. Det unike ved vår metode er at OaAEP1-baserte proteinligation er mye mer effektiv, og dermed tillater bygging av protein pentamer med en rimelig avkastning10,53. Det trenger også færre rester for ligation og resulterer i en kortere tre-rester NGL linker. Som et resultat viser det ingen "linker effekt" som den nyopprettede NGL linker påvirker ikke stabiliteten til individuellprotein monomer eller indusere ri unaturlig protein-protein interaksjon. Likevel mener vi at alle metoder har sine egne fordeler og ulemper. For eksempel legger den klassiske rekombinant DNA-metoden ikke til noen rester mellom proteinmonomer og krever ikke bruk av noe enzym for ligasjon. Og bi-cysteinmetoden er enkel og enkel for proteinpolymerisering. Dermed kan de alle være nyttige under forskjellige eksperimentelle krav.

For vår trinnvise konstruksjon av polyprotein er det avgjørende å fjerne det ureagerte proteinet helt. Ta nok volum av AFM-buffer og nok tid til å rengjøre den reaksjonerte overflaten nøye. Ellers vil det gjenværende proteinet eller proteasen påvirke ytterligere syntesereaksjoner.

Effektiviteten av OaAEP1 ligation er en kritisk grense for vår metode som TEV cleavage effektivitet er nesten komplett (96%). Det er avgjørende å øke forholdet mellom de to reaktantene, GL-proteinet og protein-NGL, for å forbedre ligasjonseffektiviteten. Vår studie viser at når protein-NGL er tidoblet til GL-protein, øker effektiviteten fra 20% (forholdet er 1 til 1) til 75% (Tilleggstall figur 1). Det er avgjørende å konsumere reaktanten, som ble immobilisert på overflaten, da den frie reakteren kan flyttes bort ved å vaske med buffer. I tillegg er om N- eller C-terminus er utsatt for løsningen også en avgjørende faktor for ligasjon. Det er en valgfri tilnærming for å eksponere terminalen ved å legge til en koblingsenhet som inneholder det anerkjente området til den respektive terminalen.

Til slutt er vår protokoll en enzymatisk måte å konjugere proteiner i en designet sekvens. Det gir også en alternativ tilnærming til par og immobilisere proteinprøver i enkeltmolekylstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) og Shuangchuang Program of Jiangsu-provinsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276, (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8, (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1, (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9, (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41, (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10, (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139, (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8, (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13, (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137, (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1, (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355, (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11, (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12, (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264, (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197, (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19, (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55, (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9, (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11, (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3, (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135, (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58, (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39, (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134, (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139, (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9, (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52, (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30, (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57, (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29, (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49, (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27, (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5, (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2, (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47, (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116, (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28, (17), 174003 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics