작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

Genetics

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Summary

우리는 작은 머리핀 (sh) RNA를 사용하여 C2C12 근구 세포재이상체에서 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 코딩하는 유전자를 안정적으로 무너뜨리는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 C2C12 근강초 동안 mRNA, 단백질 및 세포 수준에서 의 녹다운 효율의 유효성을 검증하기 위한 방법을 myotube 분화로 표적화한다.

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Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

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Abstract

세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 골격 근 발달과 항상성에 매우 중요합니다. C2C12 근구 세포체에서 ECM 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운은 골격 근력 발달에서 이러한 단백질의 역할을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 C2C12 세포에서 작은 헤어핀(sh) RNA를 사용하여 ECM 단백질 ADAMTSL2를 고갈시키기 위한 프로토콜을 예로 기술한다. shRNA 플라스미드의 형질감염 후, 안정한 세포는 푸로마이신을 사용하여 일괄 선택하였다. 우리는 또한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 C2C12 분화를 통해 이들 세포주의 유지 및 표현형 분석의 유지를 기술한다. 이 방법의 장점은 비교적 빠른 안정적인 C2C12 녹다운 세포의 생성과 세포 배양 배지에서 혈청의 고갈 시 다중 핵화 된 myotubes로 C2C12 세포의 신뢰할 수있는 분화이다. C2C12 세포의 분화는 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 및 MyoD, myogenin, 또는 myosin 중대체인 (MyHC)과 같은 정식 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 Myotube로 C2C12 근강변 분화의 진행을 나타내는 모니터링할 수 있습니다. 작은 간섭 (si) RNA를 가진 유전자의 과도 한 녹다운대조적으로, C2C12 분화 도중 또는 myotube 성숙 도중 나중에 표현되는 유전자는 shRNA를 안정적으로 발현하는 C2C12 세포를 생성해서 보다 효율적으로 표적으로 할 수 있습니다. 이 방법의 한계는 CRISPR/Cas9에 기초한 유전자 녹아웃 전략을 사용하여 극복될 수 있는 특정 shRNA에 따라 녹다운 효율의 가변성뿐만 아니라 고려해야 할 shRNA의 잠재적인 오프 타겟 효과이다.

Introduction

세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 모든 조직에 대한 구조적 지원을 제공하고 세포 세포 통신을 중재하며 세포 운명을 결정합니다. ECM의 형성 및 동적 리모델링은 따라서 조직 및 장기 항상성을 유지하는 데 중요합니다1,2. ECM 단백질을 위해 코딩하는 몇몇 유전자에 있는 병리학적인 이체는 근위축성에서 가성형성에구역 수색하는 표현형을 가진 근골격계 무질서를 초래합니다3,4. 예를 들어, ADAMTSL2의 병원성 변이체는 매우 드문 근골격계 질환인 겔레오피식 이형성증을 일으키며, 이는 가짜 근육, 즉 골격근 질량의 명백한증가5를제시한다. 마우스 및 인간에서유전자 발현 데이터와 함께, 이것은 골격 근 발달 또는 항상성6,7에서ADAMTSL2에 대한 역할을 시사한다.

우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 ADAMTSL2가 세포 배양 설정에서 골격 근육 발달 및 / 또는 항상성을 조절하는 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었습니다. 우리는 뮤린 C2C12 근강세포주에서 ADAMTSL2를 안정적으로 쓰러뜨렸습니다. C2C12 근세포 및 이들의 근체 내분체는 골격근 분화 및 골격근생물공학8,9에대해 잘 설명되고 널리 사용되는 세포 배양 모델이다. C2C12 세포는 혈청 철수 후 뚜렷한 분화 단계를 거치며, 배양 에서 3-10 일 후에 다중 핵화 된 myotubes의 형성을 초래합니다. 이러한 분화 단계는 MyoD, myogenin, 또는 myosin 중대체인(MyHC)과 같은 별개의 마커 유전자의 mRNA 수준을 측정함으로써 안정적으로 모니터링될 수 있다. C2C12 세포에서 안정적인 유전자 녹다운을 생성하는 한 가지 장점은 C2C12 분화의 후기 단계에서 발현되는 유전자가 형질감염 후 5-7일 동안 지속되고 형질전환 효율에 의해 전형적으로 지속되는 작은 간섭(si) RNA에 의해 달성된 과도적 녹다운에 비해 보다 효율적으로 표적화될 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 바와 같은 프로토콜의 제2 의제는 puromycin 선택을 사용하여 C2C12 녹다운 셀의 비교적 빠른 배치 생성이다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃 또는 인간 또는 표적 유전자 결핍 마우스로부터의 1차 골격 근 세포 전구체의 분리와 같은 대안은 기술적으로 더 도전적이거나 환자 근육 생검 또는 표적 유전자 결핍 마우스의 가용성을 각각 요구한다. 그러나, 다른 세포 배양 기반 접근법과 유사하게, C2C12 세포를 골격 근 세포 분화모델로 사용하는 데 한계가 있는데, 예를 들어 세포 배양체의 2차원(2D) 성질설정 및 미분화 골격근 전구체세포(10)를유지하는 데 중요한 생체내 미세환경의 부족.

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Protocol

1. 대장균에서 shRNA 플라스미드 DNA 준비

  1. shRNA 플라스미드를 운반하는 클론 세균 식민지의 생성
    1. 상업적 출처로부터 표적 특이적 shRNA 플라스미드 및 대조군 플라스미드를 운반하는 대장균의 글리세롤 주식을입수한다(재료표).
      참고: 3개의 상이한 shRNA 플라스미드가 사용되었고, 뮤린 아담트슬2 mRNA의 상이한 영역을 표적으로 삼았다. 하나의 shRNA는 재조합 전신 ADAMTSL2 또는 개별 ADAMTSL2 단백질 도메인을 인코딩하는 발현 플라스미드를 사용하여 구조 실험을 용이하게 하기 위해 아담트슬2의 3'-untranslated 영역(3'UTR)을 표적으로 하기 위해 선택되었다. 또한, 스크램블된 shRNA 플라스미드를 음성 대조군으로 포함시켰다. shRNA 서열의 세부 사항은 그림 1A.
    2. 실온(RT)에서 shRNA 세균성 글리세롤 스톡을 해동합니다. 100 μg/mL 암피실린(LB-Amp)으로 보충된 루리아-베르타니(LB) 한천 플레이트에 10 μL의 세균성 글리세롤 스톡을 옮니다.
      참고 : LB-Amp 플레이트는 1L 의 LB 배지 1 L (트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, pH를 7.0으로 조정)과 함께 한천 12g으로 오토클레이브하여 제조됩니다. 배지를 ~50°C로 식히고 암피실린(스톡 용액: 멸균수50 mg/mL)을 μg/mL(LB-Amp agar)의 최종 농도에 추가합니다. 즉시 10cm 페트리 접시에 LB-Amp 한천의 ~ 20mL를 부어 한천을 사용하기 전에 고형화시키십시오. LB-Amp 한천 1L는 일반적으로 약 40 10cm 페트리 접시를 붓기에 충분하다. LB-Amp 한천을 함유하는 페트리 접시는 어둠 속에서 4°C에서 밀봉된 경우 적어도 1개월 동안 안정적이다.
    3. 멸균 Drygalski 주걱 또는 단일 세균 식민지를 달성하기 위해 다른 적절한 방법으로 박테리아를 확산. 37°C에서 밤새 거꾸로 배양하는 세균판.
  2. 플라스미드 준비
    1. 다음날 아침, 개별 세균 식민지와 함께 페트리 접시를 제거하고 세균 식민지의 과성장과 위성 식민지의 형성을 피하기 위해 4 °C에 저장합니다. 하룻밤 이상 보관하면 페트리 접시를 밀봉하십시오.
    2. 오후에, 폴리 프로필렌 세균 배양 튜브에 LB-Amp 배지 5 mL를 추가합니다. 하룻밤 동안 배양된 페트리 접시로부터 단일 세균 콜로니를 파이펫 팁으로 선택하고 LB-Amp 배지를 함유하는 박테리아 배양 튜브에서 피펫 팁을 배출하여 LB-Amp 배지를 접종하였다.
    3. 37°C에서 250 rpm에서 셰이커에서 밤새 배양된 세균 배양액을 뚜껑을 느슨하게 부착하여 폭기를 허용하였다.
    4. 다음날 아침 세균 배양 튜브를 꺼내서 세균 과성장을 피하기 위해 4 °C에서 유지하십시오. 오후에, 250 mL 원추형 플라스크에서 LB-Amp 배지의 50 mL에서 밤새 세균 배양의 1 mL을 소용돌이 및 이송함으로써 박테리아를 재중단한다. 37°C에서 250 rpm에서 셰이커에서 밤새 인큐베이팅합니다.
    5. 다음날 아침, 50 mL 일회용 원심분리기 튜브와 원심분리기 박테리아를 RT에서 6,000 x g에서 15분 동안 옮기고 배지를 제거하고 1.2.6단계를 계속한다.
      참고: 플라스미드 DNA를 즉시 분리할 수 없는 경우 원심분리 단계 후 LB-Amp 배지를 제거하고 박테리아 펠릿을 -20°C에 저장합니다.
    6. 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 추출하기 위해 플라스미드 제제 키트(midi scale)에 대한 지침을 따르십시오. 분광광도계를 사용하여 A260/A280 비율을 측정하여 플라스미드 DNA 품질을 평가합니다.
      참고: >1.8의 A260/A280 비율이 바람직하며, 이는 플라스미드 DNA 제제의 고순도를 나타낸다. A260/A280 비율이 낮을 경우 단백질 오염 또는 추출 시약의 제거가 불충분합니다. 추가의 플라스미드 정제 단계가 필요할 수 있다.

2. C2C12 세포 및 푸로마이신 선택의 배양 및 형질전환

  1. C2C12 세포 배양
    1. 해동 C2C12 세포(재료의 표)신속 하 게 37°C 수조에서 세포를 붓고 멸 균 일회용 15 mL 원심분리기 튜브에 포함 된 8 mL의 DMEM 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배지는 100 단위의 페니실린 및 스트렙토마이신 항생제 (혈청 무혈청 DMEM)로 보충됩니다. RT에서 160 x g에서 3 분 동안 원심 분리전 세포.
    2. 흡위제 및 10 mL의 혈청 프리 DMEM에서 세포 펠릿을 10% 태아 소 혈청(FBS)(완전한 DMEM)으로 보충하였다. 세포를 10cm 조직 배양처리된 플라스틱 접시로 옮김을 옮김을 옮김. 5%CO2 분위기에서 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다.
    3. 다음 날, 매체를 신선한 완전한 DMEM으로 교체하십시오.
    4. 3-4 10cm 접시에 낮은 통로 C2C12 세포를 확장합니다. C2C12 세포가 50-60% 합류에 도달하면 배지를 흡인하고 인산완충 식염수(PBS)의 10 mL로 C2C12 세포를 헹구는다.
    5. 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL을 추가하고 RT. 모니터 세포 분리에서 2 분 동안 배양하고 필요한 경우 대부분의 세포가 분리 될 때까지 배양 시간을 연장하십시오.
      참고 : 조심스럽게 접시를 두드리면 세포를 빼낼 수 있습니다.
    6. 대부분의 셀이 분리되면 접시에 10 mL의 완전한 DMEM을 추가하고 볼륨을 여러 번 파이펫하고 셀 현탁액을 멸균 일회용 15 mL 원심 분리 튜브로 옮김을 옮김시. RT에서 160 x g에서 3 분 동안 원심 분리 세포를 흡인 상피제와 동결 배지의 2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오 (10 % 디메틸 설폭사이드 [DMSO]/90 % FBS).
    7. 10cm 접시당 1mL 의 알리쿼트 2개를 저온 으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 -80°C 냉동고에서 적어도 24시간 동안 RT 이소프로판올로 채워진 세포 동결 용기에 배양하여 얼음 결정의 형성을 피하기 위해 분당 약 -1°C의 동결속도를 초래한다. 액체 질소의 증기 상에서 장기간 사용하기 위해 세포를 저장합니다.
      참고: 공급업체는 통로 번호 15까지 C2C12 셀을 사용하는 것이 좋습니다. 저자의 경험은 또한 낮은 통로 수 세포가 myotubes로 더 일관되고 급속한 분화를 보였다는 것을 보여주었습니다. 분화의 조기 발병을 피하기 위해 낮은 세포 밀도 (&50% 합류)에서 C2C12 세포를 유지하는 것이 필수적입니다. 분화 또는 분화 된 C2C12 셀은 원래 근강구 상태로 되돌릴 수 없으며 폐기해야합니다.
  2. 형질 감염을 위한 C2C12 셀 준비
    1. 10cm 접시에 미분화 C2C12 세포를 배양하여 50-60% 합류에 도달할 때까지 배양한다. 배지를 흡인하고, 10 mL의 PBS로 C2C12 세포를 헹구고, 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL을 추가한다. RT에서 2 분 동안 배양하고 현미경으로 세포 분리를 모니터링하고 필요한 경우 대부분의 세포가 분리 될 때까지 배양 시간을 연장하십시오.
      참고 : 조심스럽게 접시를 두드리면 세포를 빼낼 수 있습니다.
    2. 대부분의 세포가 분리되면 접시에 10 mL의 완전한 DMEM을 넣고 멸균 일회용 15 mL 원심 분리튜브에 셀 현탁액을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다. RT. 흡인 상피에서 160 x g에서 3 분 동안 원심 분리 세포를 완료 DMEM의 4 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단.
    3. 10 μL의 셀 서스펜션과 1.5 mL 반응 튜브에 10 μL의 트라이판 블루를 결합하고, 반응 튜브를 위아래로 파이펫팅하고 조심스럽게 플릭하여 혼합하고 셀을 계수 슬라이드로 옮깁니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 번호/mL을 결정합니다.
    4. C2C12 세포를 50,000 개의 세포 / mL로 희석하고 6 웰 플레이트에서 잘 당 100,000 세포 (2 mL)를 희석하여 밤새 배양 후 약 40-50 % 합류를 달성합니다. 5%CO2 분위기에서 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다.
  3. 폴리에틸렌민(PEI) 및 푸로마이신 선택을 이용한 shRNA 플라스미드를 이용한 C2C12 세포의 형질감염
    1. PEI 재고 솔루션 의 준비
      1. 멸균 증류수 50 mL(재고 용액 농도: 0.32 mg/mL)에 PEI 16 mg을 스크류 캡이 있는 50mL 유리 미디어 병에 녹입니다. 용액을 65°C에서 1시간 동안 배양하고 용액을 수배기 동안 격렬하게 여러 번 격렬하게 배양하여 PEI를 완전히 용해시다.
      2. 50 mL당 1N HCl의 15 μL을 추가하여 pH 8로 조정하십시오.
        주의: HCl은 부식성입니다. 농축 된 HCl은 연기 후드 에서 처리해야합니다. 구도자들은 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 한다.
      3. PEI 용액을 -80°C에서 1시간 동안 느슨하게 부착된 뚜껑으로 동결하고 수조에서 37°C에서 빠르게 해동하여 용해도를 더욱 향상시킵니다. 동결 해동 주기를 3x 반복합니다.
      4. PEI 재고 용액을 -20 °C에서 일회성으로 0.5 mL aliquots에 저장합니다.
    2. C2C12 세포의 형질 감염
      1. PEI 스톡 용액의 25.5 μL(8.5 μL/μg 플라스미드 DNA)을 1.5 mL 반응 튜브에 100 μL의 25 mM NaCl과 결합하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 플라스미드 DNA 3 μg를 25 mM NaCl 100 μL과 결합하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      2. 희석된 PEI 시약의 전체 부피를 희석된 플라스미드와 결합하고 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 섞습니다. 37 °C에서 25 분 동안 배양하십시오.
      3. 인큐베이션 시간 동안, FBS 또는 항생제 없이 DMEM으로의 형질전환을 위한 C2C12 세포의 배지를 변경한다.
      4. C2C12 세포에 PEI/DNA 형질전환 믹스를 넣고 한 방울씩 떨어뜨리고 세포 배양 접시를 조심스럽게 움직여 지속적으로 섞습니다. 5%CO2 분위기에서 37°C에서 가습 된 인큐베이터에서 배양. 6시간 후, 매체를 변경하여 DMEM을 완료합니다.
    3. 푸로마이신 셀렉션
      1. 24 시간 후, 선택 매체로 매체를 전환하십시오 (완전한 DMEM + 5 μg / mL puromycin). puromycin 저항하는 C2C12 세포가 얻어지날 때까지 puromycin 선택을 계속합니다, 이는 전형적으로 10-14 일이 걸립니다.
      2. 낮은 세포 밀도에서 puromycin 저항하는 C2C12 세포를 확장 (<50-60% 합류), 즉, 단계 2.1.4-2.1.7에 설명 된 바와 같이 향후 실험을위한 6-10 바이알의 미분화 상태 및 냉동 보존을 유지합니다.
        참고: 일상적인 세포 배양 및 확장을 위해 5 μg/mL 푸로마이신이 있는 상황에서 푸로마이신 내성 C2C12 세포를 유지하십시오. 그러나, 퓨로마이신은 분화 실험에서 생략되었다.

3. C2C12 차별화의 표현형 분석

참고: 아래에 설명된 방법은 서양 블로팅에 사용되는 특정 항체 또는 정량적 폴리머에 사용되는 유전자 특이적 프라이머를 변화시킴으로써 C2C12 근강초 분화의 일반적인 표현형 분석에 쉽게 적응할 수 있습니다. 연쇄 반응 (qPCR) 분석.

  1. C2C12 분화 프로토콜 및 브라이트필드 현미경 검사법
    1. 씨앗 150,000 세포 / 잘 12 웰 플레이트. 배양 퓨로마이신 내성 C2C12 는 5%CO2 분위기에서 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 선별 배지에서 12개의 웰 플레이트에서 안정한 세포를 양호한다. 배양 C2C12 세포는 완전한 DMEM에서 ~95% 합류에 도달할 때까지.
    2. C2C12 세포의 분화를 유도하기 위해 완전한 DMEM을 무혈청 DMEM(분화 0일째)으로 대체하십시오. 2일마다 배지를 변경하고 카메라를 사용하여 거꾸로 된 밝은 필드 현미경을 사용하여 C2C12 myotube 형성을 따르십시오.
      참고: 많은 프로토콜은 C2C12 세포를 myotube로 분화하기 위해 2% 말 세럼을 사용합니다. 저자의 손에서 혈청을 완전히 제거하는 것은 비슷한 효과가 있었습니다. 인슐린은 C2C12 분화를 가속화하기 위해 세포 배양 배지에 첨가제로서 기술된다. 그러나, 현재 프로토콜에서, C2C12 세포는 혈청 박탈 및 인슐린 첨가 후 3-5일 이내에 myotube로 안정적으로 분화되었다.
  2. Myosin 중대 체인 (MyHC) myotubes를 시각화 하는 면역 염색
    1. 완전한 DMEM의 500 μL에서 8 개의 웰 챔버 슬라이드에서 챔버 당 50,000 puromycin 내성 C2C12 세포를 시드. 배양 세포는 완전한 DMEM(약 24시간)에서 95% 합류에 도달할 때까지 배양한다.
    2. 분화를 유도하기 위해 전체 DMEM에서 500 μL의 무혈청 DMEM(분화 일 0)으로 전환하십시오. 원하는 시점에서 배지를 흡인하고 0.5 mL의 PBS로 세포를 3배 헹구는다.
      참고: RT에서 다음 모든 단계를 수행합니다.
    3. 0.2 mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 PBS에서 15분 동안 희석하여 15분 동안 헹구고, 각각 5분 동안 0.5 mL의 PBS 3x로 세포를 헹구어 보시고 있습니다.
      주의: PFA는 위험합니다. 적절한 예방 조치를 취하고 파라포름알데히드 용액을 유해 폐기물로 폐기하십시오.
    4. 0.2 mL의 0.2 mL의 0.5 m글리신을 PBS에서 5 분 동안 린스 세포와 0.5 mL의 PBS 3x로 각각 5 분 동안 담금질.
    5. 0.2 mL의 0.1% 비이온 계면활성제/세제(표)를PBS에서 10분 동안 배양하여 세포막을 투과시한다. PBS에서 0.2 mL의 소 혈청 알부민을 1 시간 린스 세포에 대해 0.5 mL의 PBS 3x로 각각 5 분 동안 블록.
    6. MyHC 항체의 0.2 mL (PBS에서 1:200)로 배양 된 세포를 2 h. 린스 세포와 0.5 mL의 PBS 3x를 각각 5 분 동안.
    7. 염소 항 마우스 로다민 적색 공액 이차 항체의 0.2 mL로 배양 세포 (PBS에서 1:200). 0.5 mL의 PBS 3x로 세포를 각각 5 분 동안 헹구다.
    8. PBS를 정량적으로 제거한 후, 챔버당 4′,6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)를 함유하는 마운팅 배지 한 방울을 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 덮개 슬립 및 경화 장착 매체. 매니큐어로 밀봉하십시오.
    9. 적절한 필터 세트를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 C2C12 세포를 관찰하십시오.
  3. 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 통한 녹다운 효율 평가
    1. 배양 C2C12 세포는 섹션 3.1에 기재된 바와 같이 12웰 플레이트에서 분화 조건 하에서.
    2. 원하는 시점에서 분화 배지를 제거하고, 1 mL의 PBS로 세포를 한 번 헹구고, 잘 당 0.5 mL의 RNA 추출시약(물자 표)을추가합니다. 조심스럽게 상하 파이펫팅하여 세포를 분해하고 멸균 1.5 mL 반응 튜브로 세포 를 전달합니다. 제조업체의 프로토콜을 주의 깊게 따라 RNA를 분리합니다.
      주의: RNA 추출 시약에는 페놀이 포함되어 있습니다. 그것은 연기 후드 에서 사용해야합니다. RNA 추출 시약 폐기물을 수거하고 유해 폐기물로 처리합니다. 구도자들은 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 한다.
    3. 디에틸 파이로카보네이트(DEPC) 처리된 물 20 μL에서 최종 RNA 펠릿을 용해시. 분광광도계를 사용하여 RNA 제제의 양과 품질을 결정하고 품질 측정값으로 A260/A280 비율을 결정합니다.
      참고 : 12 웰 플레이트의 1 웰의 일반적인 수율은 A260/ A280 비율이 1.8-2인 총 RNA의 5-7 μg입니다.
    4. 잔류 동정제 게놈 DNA를 소화하기 위해, PCR 튜브에서 DEPC 처리된 물의 총 부피 8 μL에서 RNA 1 μg를 희석한다. 1μL의 1 μL의 반응 버퍼와 1 μL의 DNase I (1 단위 / μL)(재료표)를추가하고 RT에서 1 μL의 스톱 솔루션 (25 mM EDTA)을 추가하고 70 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
    5. cDNA를 생성하기 위해, 역전사, 랜덤 프라이머, 4 mM dNTP 믹스(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각 1mMM)를 함유하고, 역전사 마스터 믹스의 10 μL과 10 μL의 DNase 처리 RNA를 결합하고, 역전사 반응 버퍼를 결합한다. 제조업체에서 권장하는 프로그램을 사용하여 열전자전거에서 반응을 배양합니다. cDNA를 1:5 비율로 물로 희석합니다.
    6. qRT-PCR 반응을 준비하기 위해, SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스 5 μL과 0.5 μL의 유전자 특이적 전진 및 역방향 프라이머(stock: 10 μM)를 각각 결합하고, 반응당 DEPC 처리된 물 2 μL을 결합한다. 피펫 qPCR 반응은 96 웰 qRT-PCR 플레이트의 한 웰에서 희석된 cDNA 2 μL을 첨가한다. 각 생물학적 복제에 대해 3개의 기술적 복제를 설정하고 Gapdh 또는 Hprt1과같은 하우스키핑 유전자를 포함한다.
    7. 다음 프로그램을 사용하여 qRT-PCR 열자전거로 PCR 제품을 증폭: 2분 동안 50°C(우라실-DNA 글리코실라제 [UDG] 활성화), 95°C 2분(이중 잠금 DNA 폴리머라제 활성화), 40 사이클 95°C, 15초의 경우 60°C, 1분 동안 72°C.
    8. QRT-PCR 결과를 Gapdh 또는 Hprt1과같은 하우스키핑 유전자로 정규화하는 DDCt 방법을 사용하여 정량화합니다.
  4. 웨스턴 블로팅으로 녹다운 효율 평가
    1. 종자 300,000 puromycin 내성 C2C12 세포는 서양 얼룩 분석을위한 6 웰 플레이트에서 잘 당. 24시간 후, 배지를 무혈청 DMEM으로 변경하여 분화를 시작합니다(분화의 0일째).
    2. 원하는 시점에서, 1.5 mL 반응 튜브와 원심분리기에서 1mL무성 조절 배지 2개를 RT에서 500 x g에서 5분 동안 수집하여 분리된 세포와 세포 파편을 제거한다.
      참고: 이 단계는 조절된 매체에 있는 ECM 단백질 또는 그밖 분비한 단백질이 조사되는 경우에 필요합니다. 관심 있는 단백질이 세포질에 국한되어 있거나 막결합인 경우, 세포 배양 배지를 흡인하고 세포 포해 단계(3.4.7−3.4.12)를 진행한다. 세포 용해는 세포 층의 장기간 저장의 단백질 분해 및 기타 의도하지 않은 결과를 최소화하기 위해 혈청이없는 조절 배지에서 단백질 침전과 병행하여 수행되어야합니다.
    3. 원심분리 후, 새로운 1.5 mL 반응 튜브에 컨디셔닝 배지 1 mL을 옮기고 트리클로로 아세트산 (TCA)과 비 이온 계면 활성제 / 세제의 혼합물0.391 mL을 추가하여 단백질을 침전시. 혼합물을 잠시 소용돌이시키고 얼음에 10 분 동안 배양합니다.
      참고: 55% TCA의 0.252 mL과 0.139 mL의 1% 비이온 계면 활성제/세제를 컨디셔닝된 배지 및 와류의 mL당 간단히 결합하여 사용하기 전에 단백질 침전 혼합물을 직접 준비합니다. 용액은 혼탁해집니다.
      주의: TCA는 부식성이며 적절하게 취급해야 합니다.
    4. 4 °C에서 10 분 동안 침전 된 단백질을 >16,000 x g에 펠트. 상급제는 버리십시오.
      주의: 상급제는 TCA를 포함하고 별도로 수거하여 유해 물질로 폐기해야 합니다.
    5. 단백질 펠릿 을 얼음 차가운 아세톤과 원심 분리기로 매번 >16,000 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 씻으십시오.
    6. RT에서 3-4 분 동안 단백질 펠릿을 건조시키고 1x 나트륨 도데실 황산염 폴리아클로미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 샘플 버퍼 (50 mM Tris pH 6.8, 2 % SDS, 6 % 글리세롤 및 0.004 % 브로모페놀 블루, 5 %로 보충)의 50 μL에 용해하십시오. 95°C에서 5분간 시료를 끓이고 표준 절차를 사용하여 원하는 표적 단백질을 검출하기 위해 서양 블로팅에 사용합니다.
      주의: β-메르카포에탄올은 냄새가 나고 독성이 있으며 연기 후드에서 처리해야 합니다.
    7. 세포 내 및 막 결합 단백질의 경우, PBS 2 mL로 세포층을 한 번 헹구어 보시킵니다.
    8. 1 mL의 PBS를 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 우물을 긁어 세포를 빼냅니다. 4°C에서 3분 동안 3,420 x g에서 1.5 mL 반응 튜브 및 원심분리기에서 세포를 수집합니다. 세포 펠릿을 1 mL의 PBS및 원심분리기로 3,420 x g에서 3 분 동안 4 °C에서 매번 씻어 내십시오.
    9. 세포를 용해시키기 위하여는, 용해 완충의 0.2 mL에 있는 세포 펠릿을 다시 중단합니다 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 2.5 mM 나트륨 파이로포스페이트, 1 mMβ-글리세로 포스페이트, 1 mM 나트륨 orthovanadate) 1x EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 재증액으로 보충.
    10. 23 kHz의 작동 주파수에서 10의 전력 출력 설정으로 얼음에 15 s용 초음파.
    11. 4 °C에서 20 분 동안 13,680 x g에서 원심 분리로 세포 이물질을 제거하십시오. 새로운 1.5 mL 반응 튜브에서 상판액을 수집하고 상업적인 브래드포드 분석법 또는 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
    12. 각 시료에 대해 100 μg의 단백질과 5x SDS-PAGE 샘플 버퍼를 총 부피 60 μL에 넣고 95°C에서 5분간 끓입니다. 원하는 표적 단백질의 존재에 대한 표준 서양 블로팅 절차에 의해 샘플을 분석합니다.

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Representative Results

puromycin 저항하는 C2C12의 선택은 비 저항성, 즉, 비감염세포의 효율적인 제거로 인해 형질전환 후 10-14일 후에 달성될 수있다(도 1B). 전형적으로, 세포의 80% 이상은 세포 배양 접시에서 분리하고 이 세포는 일상적인 세포 유지 동안 제거됩니다. Puromycin 저항하는 C2C12 세포는 제어 (스크램블드) shRNA를 표현하는 낮은 세포 밀도및 myotube로 분화하는 기능에서 스핀들 모양, 가늘게 한 세포 형태를 유지합니다. 혈청 금단에 따른 C2C12 분화는 밝은 현장 현미경 검사법및 myotube 마커 미오신 중대사슬(MyHC)에 대한 면역염색에 의해 모니터링될 수있다(그림 2). MyHC 양성 myotubes는 분화 개시 후 3-5 일 사이에 관찰됩니다. Myotube는 MyHC 양성 세포 경계 내에서 하나 이상의 DAPI 양성 핵의 존재에 의해 도시된 바와 같이 다중핵화된다. 도 3A는 완전한 DMEM에서 배양된 안정적인 C2C12 세포의 밝은 필드 이미지를 나타낸다. 여기에 제시된 녹다운 효율은 40-60%(그림3B)입니다. mRNA는 작은 Adamtsl2가 발현되는 증식 상태에서 수확되었기 때문에, 녹다운 효율은 낮게 보이지만, C2C12 분화 동안 나중에 더 큰 것으로 예상되며, 여기서 내인성 아담트슬2가 유도되어 훨씬 더 높은 수준으로 표현된다. 서방 블롯 분석은 대조군 shRNA에 비해 안정적으로 shRNA 3086을 발현하는 C2C12 세포로부터 수득된 세포 에서 ADAMTSL2의 성공적인 녹다운을 확인하였다(도3C).

Figure 1
그림 1: shRNA 인코딩 플라스미드 DNA로 형질전환 후 안정적인 C2C12 세포의 선택. (A)대상 영역(CDS, 코딩 시퀀스; 3'-UTR, 3'-번역되지 않은 영역), 클론 ID(이하 1977, 3086 및 972) 및 Adamtsl2를타겟팅하는 데 사용되는 shRNA의 시퀀스를 나타내는 표. (B)패널은 대조군 shRNA 및 3개의 아담트슬2-표적화shRNA로 형질감염된 C2C12 세포의 선택을 보여준다. C2C12 세포는 shRNA 플라스미드및 푸로마이신을 배지에 첨가하였고, 24시간 후에 푸로마이신에 민감한 세포가 둥글게 나타나고 결국 일상적인 세포 배양 유지(빨간 화살표) 동안 분리하였다. 대조적으로, 통합된 shRNA 플라스미드를 품고 있는 푸로마이신 내성 세포는 스핀들 모양, 약간 길쭉한, 부착된, 및 실행 가능한 (파란색 화살표)를 나타난다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: C2C12 근강물에서 근체화분화. 분화 C2C12 세포의 밝은 필드 이미지는 분화의 시작 부분에서 세포의 조밀한 조약돌 모양을 보여 (일 0−1) 및 다중 핵근 myotubes 는 5 일 후 관찰되었다 (상부 행). myoin 중추체인을 가진 분화 C2C12 세포의 면역 염색(MyHC, red),이는 myotubes를 위한 마커인, 분화의 3일째에 유도된다(중간 패널). 핵은 DAPI로 염색되었고 병합된 이미지는 하부 패널에 도시된다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 증식 C2C12 셀에서 안정적인 녹다운 검증. (A)완전한 DMEM에서 배양된 안정적인 C2C12 세포의 밝은 필드 이미지. 스케일 바 = 300 μm.(B)안정한 C2C12 세포에서 Adamtsl2 mRNA 발현의 qRT-PCR 분석. Ct 값은 하우스키핑 유전자 Hprt1으로정규화되었습니다. mRNA는 분화의 개시 전에 수확되었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (C)CC12 세포로부터 세포 포해액/ECM 분획에서 감소된 ADAMTSL2 단백질을 나타내는 서방 블롯 분석은 shRNA 3086을 안정적으로 발현한다. 내인성 ADAMTSL2는 맞춤형 폴리클로날 펩티드 항체를 사용하여 검출되었다(요청 시 사용 가능). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 여기에서 C2C12 근강초체에 있는 ECM 단백질의 안정한 녹다운을 위한 프로토콜및 myotubes로 C2C12 근세포의 분화의 표현형 분석을 위한 기술합니다. 여러 가지 요인이 실험 결과를 결정하며 신중하게 고려해야 합니다. 증식 상에서 C2C12 세포를 유지하는 것은 C2C12 세포를 근구 전구체 상태로 유지하는 중요한 단계이다. C2C12 세포의 능력을 유지하여 지속적으로 myotube로 분화하는 것은 i) 세포의 통로 수, ii) 일상적인 유지 동안 배양된 세포의 밀도, 및 iii) 영양소 가용성에 따라 달라지며, 세포 배양 배지11,12,13의빈번하고 정기적인 보충이 요구된다. 몇몇 알려지지 않은 기계장치 때문에, 더 높은 통로 수 C2C12 세포는 또한 추가 근막융합(11)에대한 잠재력을 잃는다. C2C12 세포의 공급자로부터의 지침은 통로 번호 15까지 이 세포를 유지하는 것을 건의합니다. 그 후, 분화 전위가 감소될 수 있고 이러한 세포를 실험하면 덜 일관된 myotube 형성을 초래할 수 있다. 한편, 유지 보수 중 셀 밀도는 유사한 효과를 초래할 수있다 9. 일상적인 세포 배양 동안 응과 C2C12 세포 밀도에 도달하면 C2C12 근강구 분화의 개시를 촉진하고 따라서 세포 집단의 분화 잠재력에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서 일상적인 C2C12 세포 유지 보수 중에 C2C12 세포가 높은 세포 밀도에 도달하지 못하도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 낮은 세포 밀도에서 이미 서브 배양 C2C12 세포에 의해 달성 될 수있다 (<50−60% 합류). 혈청 기아는 Myotubes로 C2C12 세포 분화를 유도하기 위하여 이용됩니다. 따라서, 배지를 보충하지 않고 더 긴 시간 동안 세포를 유지하면 영양소와 혈청 수치가 심각하게 소모됩니다. 적어도 이틀에 한 번씩 배지를 함유하는 신선한 혈청으로 보충하면 영양분과 혈청 부족으로 인한 원치 않는 조기 분화의 발병을 방지할 수 있습니다.

C2C12 분화는 전형적으로 혈청 기아에 의해 유도된다. C2C12 분화를 유도하는 데 사용되는 혈청의 백분율은 결과, 특히 MyHC 양성 myotubes14,15를형성하는 데 걸리는 시간에 크게 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 프로토콜은 각종 혈청 농도의 분화의 성공적인 유도를 보여줍니다. 2-10% FBS 또는 말 혈청 및 완전한 혈청 박탈의 사용은 보고되었으며 모든 조건은 C2C12 myotube 형성을 초래합니다. 혈청 백분율 또는 혈청 로트의 변화는 분화를 위한 마커를 현저하게 바꿀 수 있다. 또한, 혈청의 공급원은 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는데, 이는 원산지 국가가 소 혈청 생산 동안 특정 첨가제를 허용하거나 허용하지 않을 수 있기 때문이다8. 혈청 수준은 특정 실험 요건에 따라 분화 속도를 달성하기 위해 조정될 수 있다. 인슐린은 C2C12 세포의 배양 배지에 첨가되어 분화 및 미오튜브 형성을 가속화할 수있다(16).

형질 감염을 통해 C2C12 세포로 shRNA 또는 재조합 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 전달하는 능력은 C2C12 세포의 매력적인 기능입니다. 몇몇 상업적리포솜 계 형혈 시약은 가변보고된 형혈 효율을 가진 C2C12 세포로 플라스미드 DNA를 전달하기 위하여 이전에 사용되었습니다17,18,19,20,21. PEI는 또한 합리적인 형질 감염 효율을 나타내며 리포솜 기반 형질 감염 시약에 대한 비용 효율적인 대안입니다. 상업적 리포솜 계 형질감염 시약 및 PEI와의 형질감염 간의 비교는 형질감염 효율에 상당한 변화가 없었으며 PEI22로약간 더 높은 효율을 보였다. 우리의 손에, PEI를 가진 형질감염 효율은 안정한 puromycin 저항하는 C2C12 세포를 생성하기 위하여 충분했습니다. 그러나, 이 프로토콜의 중요한 단계는 형질감염 시약의 인큐베이션 시간을 짧게 유지하는 것이다. 위에서 언급한 바와 같이, C2C12 세포는 혈청 금단에 민감하고 형질전환 동안 낮은 혈청 조건에 장기간 노출되면 C2C12 세포 분화를 선호할 수 있다. 형질감염은 혈청의 부재에서 수행되기 때문에, 형질전환 후 배양 시간은 조기 분화를 방지하기 위해 혈청 함유 배지를 신속하게 재공급하기 위해 짧게 유지되었다. 푸로마이신은 투상 후 24시간 배양배지에 첨가하여 푸로마이신 내성 C2C12 세포의 선택을 개시하였다. 플라스미드 DNA를 분화된 myotube에 도입하는 방법은 형질감염(최대 85% 효율 보고), 전기천공, 또는 생물학적 접근법23,24,25를포함한다. 대안적으로, 유도성 shRNA 플라스미드를 수용하는 안정된 C2C12 세포는 myotube 분화의 나중 단계에서 또는 myotube 성숙시(26)동안 유전자를 무너뜨리기 위해 생성될 수 있었다.

여기에 설명된 방법은 C2C12 세포에서 ADAMTSL2의 안정적인 녹다운을 초래하여 myotube로 분화하는 동안의 기능을 결정할 수 있습니다. 안정한 녹다운 세포의 생성은 myotube 대형 또는 성숙 도중 유도되는 단백질의 기능을 공부하는 것을 특히 중요할 지도 모릅니다. 예를 들어 siRNA를 가진 과도 한 transfection는 이 유전자를 능등하게 무너뜨리기 위하여 충분하지 않을 것입니다, siRNA의 과도 한 녹다운 효력은 5-7 일 후에 떨어져 wean 수 있기 때문에. 또는 CRISPR/Cas9를 사용하는 ECM 단백질의 녹아웃은 기술적으로 더 까다롭고 개별 클론은 원하는 유전자의 녹아웃을 보장하기 위해 선택되고 시퀀싱되어야 합니다. 그러나, 시약의 진화 라인은 CRISPR/Cas9를 미래에 기능 상실 실험을 위한 선택 방법을 렌더링할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

D.H.는 국립 보건원 (국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소, NIAMS, 교부금 번호 AR070748)과 레니 & 피터 W. 월 정형 외과, 아이칸 의과 대학의 종자 기금에 의해 지원됩니다. 시나이 산.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

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