Validert LC-MS/MS-panel for kvantifisering av 11 legemiddelresistente TB-medisiner i små hårprøver

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nåværende metoder for å analysere pasientenes overholdelse av komplekse legemiddelresistente-tuberkuloseregimer (DR-TB) kan være unøyaktige og ressursintensive. Vår metode analyserer hår, en lett samlet og lagret matrise, for konsentrasjoner av 11 DR-TB medisiner. Ved hjelp av LC-MS/MS kan vi bestemme subnanogram legemiddelnivåer som kan brukes til å forstå legemiddeloverholdelse naviss.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Reckers, A., Wen, A., Aguilar, D., Bacchetti, P., Gandhi, M., Metcalfe, J., Gerona, R. Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples. J. Vis. Exp. (159), e60861, doi:10.3791/60861 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Legemiddelresistent tuberkulose (DR-TB) er en økende folkehelsetrussel, og vurdering av terapeutiske legemiddelnivåer kan ha viktige kliniske fordeler. Plasma narkotika nivåer er dagens gull standard vurdering, men krever phlebotomy og en kald kjede, og fange bare svært nylig overholdelse. Vår metode bruker hår, en matrise som lett samles inn og reflekterer langsiktig overholdelse, for å teste for 11 anti-TB medisiner. Tidligere arbeid fra gruppen vår viser at antiretrovirale legemiddelnivåer i håret er forbundet med HIV-utfall. Vår metode for DR-TB narkotika bruker 2 mg hår (3 cm proksimal til roten), som pulveriseres og ekstraheres i metanol. Prøver analyseres med en enkelt LC-MS/MS-metode, og kvantifiserer 11 legemidler i en 16 min-kjøring. Lavere grenser for kvantifisering (LLOQs) for de 11 legemidlene varierer fra 0,01 ng/mg til 1 ng/mg. Tilstedeværelse av legemidler bekreftes ved å sammenligne forhold mellom to massespektrometrioverganger. Prøver kvantifiseres ved hjelp av områdeforholdet mellom stoffet og deuterated, 15N-, eller 13C-merket legemiddel isotopologue. Vi brukte en kalibreringskurve fra 0,001-100 ng/mg. Anvendelse av metoden til en praktisk prøve av hårprøver samlet inn fra DR-TB pasienter på direkte observert terapi (DOT) indikerte legemiddelnivåer i håret innenfor det lineære dynamiske området av ni av de elleve legemidlene (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloksacin, moxifloxacin, clofazimin, bedaquiline, pretomanid). Ingen pasienter var på prothionamid, og de målte nivåene for ethionamid var nær sin LLOQ (med videre arbeid i stedet undersøke egnetheten av ethionamid metabolitt for overvåking eksponering). Oppsummert beskriver vi utviklingen av et multi-analyte panel for DR-TB narkotika i håret som en teknikk for terapeutisk legemiddelovervåking under legemiddelresistent TB-behandling.

Introduction

I det tjueførste århundre, resistente TB (DR-TB) er en utviklende katastrofe for allerede svake nasjonale TB kontrollprogrammer, med bekreftede tilfeller dobling i de siste 5 årene alene, står for nesten en tredjedel av alle dødsfall knyttet til antimikrobiell motstand globalt1,2. Vellykket behandling av DR-TB har konvensjonelt krevd lengre og mer giftige andrelinjeregimer enn behandling for legemiddelsensitiv tuberkulose. Videre har pasienter med DR-TB ofte betydelige eksisterende utfordringer for etterlevelse, noe som bidro til fremveksten av resistens i utgangspunktet3.

I motsetning til HIV-infeksjon der virusbelastninger kan brukes til å overvåke behandling, er surrogatendepunkter for behandlingsrespons i TB forsinket og upålitelig på individuell nivå4. Overvåking av pasientens etterlevelse, en viktig prediktor for subterapeutisk anti-TB-konsentrasjon og behandlingssvikt, er også utfordrende. Selvrapportert etterlevelse lider av tilbakekalling bias og ønsket om å behage leverandører5,6. Pilletellinger og medisinering hendelse overvåkingssystemer (MEMS) kan være mer objektiv7 men ikke måle faktiske narkotikabruk8,9,10. Legemiddelnivåer i biomatrices kan gi både etterlevelse og farmakokinetiske data. Derfor er plasmalegemiddelnivåer ofte brukt i terapeutisk legemiddelovervåking11,12. I sammenheng med overvåking av legemiddeletterlevelse representerer imidlertid plasmanivåer kortsiktig eksponering og er begrenset av signifikant intra- og interpasientvariabilitet ved fastsettelse av passende referanseområde for overholdelse. "Hvit frakk" effekter, hvor overholdelse forbedrer før klinikk eller studiebesøk, kompliserer ytterligere evnen til plasmanivåer for å gi nøyaktige legemiddeloverholdelsesmønstre13.

Hår er en alternativ biomatrix som kan måle langsiktig legemiddeleksponering14,15. Mange stoffer og endogene metabolitter innlemme i håret protein matrise fra systemisk sirkulasjon som håret vokser. Som denne dynamiske prosessen fortsetter under hårvekst, mengden av narkotika deponert i hårmatrisen avhenger av kontinuerlig tilstedeværelse av stoffet i omløp, noe som gjør håret til en utmerket temporal avlesning av legemiddelinntak. Hår som biomatrix har den ekstra fordelen av å bli lett samlet uten behov for kald kjede for lagring og forsendelse sammenlignet med blod. Videre er håret ikke-biofarlig, noe som gir ytterligere mulighetsfordeler i feltet.

Hår narkotika nivåer har lenge vært brukt i rettsmedisinske applikasjoner16. I løpet av det siste tiåret har hårantiretrovirale (ARV) nivåer vist nytte i å vurdere legemiddeloverholdelse i HIV-behandling og forebygging, som vår gruppe bidro til. ARV nivåer i håret har vist seg å være de sterkeste uavhengige prediktorer av behandlingsutfall i HIV-infeksjon17,18,19,20,21. For å finne ut om hårnivåer av DR-TB-pasienter vil ha samme nytte i å forutsi behandlingsutfallet, brukte vi LC-MS / MS for å utvikle og validere en metode for å analysere 11 DR-TB medisiner i små hårprøver. Som en innledende vurdering av analysens ytelse målte vi DR-TB-legemiddelnivåer i en praktisk prøve av pasienter med DR-TB som fikk direkte observert behandling (DOT) i Western Cape, Sør-Afrika22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke før hårprøveinnsamling. Vi fikk Institutional Review Board godkjenning fra University of Cape Town og University of California, San Francisco.

1. Hår prøvetaking

  1. Innhente skriftlig informert samtykke.
  2. Bruk ren saks til å kutte ca 20-30 hodebunnen hårtråder fra occipital regionen så nær hodebunnen som mulig.
  3. Plasser tape rundt den distale siden av håret for å indikere retningsbestemthet. Brett hårprøven inn i en aluminiumsfolie firkant og lagre ved romtemperatur. Merk den distale enden av håret for å unngå mulig kontaminering fra ekstra håndtering av den proksimale enden.
  4. I tillegg til pasientprøver, samle "tomt hår": en hodebunn hårprøve fra noen som ikke har tatt TB medisiner. Samle en stor mengde (> 30 mg tomt hår for hver 20 pasientprøver).

2. Utvinning av legemidler

  1. Merk perlerør. Hver pasientprøve krever ett rør. Merk 12 rør fra "C0" til "C11", en for hvert av de 12 kalibreringspunktene. Merk et rør for lav kvalitetskontroll, et rør for middels kvalitetskontroll og et rør for høy kvalitetskontroll. Til slutt merker du et rør for Matrix Blank.
  2. Åpne aluminiumsfoliefirkanten som inneholder hårprøve. Hvis hårprøven er lengre enn 3 cm, klipp håret på 3 cm fra den proksimale enden og bruk den proksimale delen for analyse.
  3. Vei 2 mg av hårprøven i et perlerør.
  4. Vei 2 mg tomt hår i 16 ekstra perlerør. Disse vil bli brukt som kalibreringspunkter, kvalitetskontroller og matrise blank. Rørene vil følge samme ekstraksjonsprosedyre som pasientprøvene, bortsett fra å bli spiked med narkotikareferansestandarder på nivåer som er angitt i trinn 2.8 og 2.9.
  5. Plasser alle perlerørene i homogenisatoren. Kjør homogenisator med hastighet 6,95 m/s. Kjør i to sykluser på 30 s hver, med en 15 s hvileperiode mellom de to syklusene.
  6. Lag intern standardblanding og legg den til prøvene.
    1. Tilsett ~ 40 ml metanol til en 50 ml volumetrisk kolbe.
    2. I hetteglass med gult glass, gjør blandingene av de interne standardene som vises i tabell 1, ved hjelp av metanol som løsningsmiddel.
      MERK: Metanol er veldig flyktig. La alle hetteglass begrenset under denne prosessen for å forhindre tap på grunn av fordampning.
    3. Fra disse blandingene legger du til volumet som vises i tabell 1 til 50 ml volumetrisk kolbe. Fyll deretter kolben til 50 ml med metanol.
    4. Cap og bland volumetrisk kolbe. Tilsett 500 μL av blandingen til hver av de pulveriserte hårrørene, bortsett fra matriseblankrøret. Tilsett 500 μL metanol i matriseblankrøret.
  7. Kom det å referere til standardmikser.
    1. Utgjør pene referansestandarder for følgende legemidler med metanol for å få konsentrasjonen vist i tabellen i trinn 2.7.2. Kun 1 ml av følgende konsentrasjoner er nødvendig.
    2. Tilsett 1768 μL metanol i et hetteglass, og tilsett deretter referansestandarden som er oppført i tabell 2, til samme hetteglass for å få 2 ml endelig volum. Merk dette hetteglasset "Ref Std Mix 1x". Vortex.
    3. Spike 100 μL fra "Ref Std Mix 1x" til 900 μL metanol i et nytt hetteglass. Merk dette hetteglasset "Ref Std Mix 10x". Vortex.
    4. Spike 100 μL fra "Ref Std Mix 10x" til 900 μL metanol i et nytt hetteglass. Merk dette hetteglasset "Ref Std Mix 100x". Vortex.
    5. Spike 100 μL fra "Ref Std Mix 100x" til 900 μL metanol i et nytt hetteglass. Merk dette hetteglasset "Ref Std Mix 1000x". Vortex.
  8. Spike kalibreringskurverørene ved å legge til mengden Ref Std Mix som er beskrevet i tabell 3.
  9. Lag QC mikser og pigg kvalitet kontroll rør.
    1. Label 5 hetteglass "QC-A" gjennom "QC-E".
    2. Legg til følgende mengder metanol i de fem merkede hetteglassene:
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      QC-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E: 950 μL
       
    3. Ved hjelp av 1 mg/ml legemiddelbestandene som er opprettet i trinn 2.7.1, tilsett 10 μL til de spesifikke hetteglassene som er oppført nedenfor. For BDQ- og CLF-aksjene, som er på 0,5 mg/ml, tilsett 20 μL til hetteglassene som er oppført nedenfor.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      MERK: Noen stoffer er til stede i flere blandinger.
    4. Merk et hetteglass som "QC-A df100". Fortynn 10 μL QC-A til 990 μL metanol.
    5. Merk et hetteglass som "Low QC stock". Tilsett 1832 μL metanol til dette hetteglasset. Legg til mengdene QC-mikser som er beskrevet nedenfor:
      QC-A df100: 80 μL
      QC-B: 8 μL
      QC-C: 80 μL
       
    6. Merk et hetteglass som "Mid QC stock". Tilsett 760 μL metanol til dette hetteglasset. Legg til mengdene QC-mikser som er beskrevet nedenfor:
      QC-A df100: 800 μL
      QC-B: 40 μL
      QC-C: 400 μL
       
    7. Merk et hetteglass som "High QC stock". Tilsett 1376 μL metanol til dette hetteglasset. Legg til mengdene QC-mikser som er beskrevet nedenfor:
      QC-D: 160 μL
      QC-E: 320 μL
      MFX, 1mg/ml lager: 16 μL
      INH, 1mg/ml lager: 32 μL
      LFX, 1mg/ml lager: 32 μL
      LZD, 1mg/ml lager: 32 μL
      PZA, 1mg/ml lager: 32 μL
       
    8. Spike 10 μL Low QC lager i Low QC perle rør.
    9. Spike 10 μL Mid QC lager inn i Mid QC perle rør.
    10. Spike 10 μL High QC lager i High QC perle rør.
  10. Legg alle rørene i varm shaker i 2 timer ved 37 °C. Risting bør være treg nok til at vannet ikke spruter opp på rørene.
  11. Fjern rørene fra shaker. Overfør væske fra perlerør til nye mikrocentrifugerør. Merk disse mikrocentrifugerørene på samme måte.
  12. Tilsett 500 μL metanol til de gamle rørene. Lue og virvel.
  13. For andre gang, overfør væske fra perlerørene til det tilsvarende mikrocentrifugerøret. Det er greit å overføre pulverisert hår. Dette vil etter hvert bli sentrifugert ut.
  14. Sentrifuge mikrocentrifugerørene i 10 min ved 2800 x g.
  15. Fjern væsken forsiktig og overfør den til nye sentrifugerør med tilsvarende etiketter. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer eller overfører hårpelleten.
  16. Fordamp væsken i sentrifugerørene til tørrhet ved 32 °C.
  17. Rekonstituer prøvene ved å tilsette 200 μL mobilfase A (HPLC-vann av høy kvalitet med 1 % maursyre) til de tørre rørene. Vortex.
  18. Overfør væsken til gule hetteglass med 250 μL innsatser.

3. LC-MS/MS-tilberedning

  1. Lag en liter mobil fase A (HPLC-vann med 1 % maursyre) ved å tilsette litt HPLC-vann til en en liters volumetrisk kolbe. Tilsett deretter 10 ml > 95% maursyre til den kolben, og fyll deretter til linjen med HPLC-klasse vann.
    1. Lag en liter mobil fase B (acetonitrile med 0,1% maursyre) ved å legge til noen acetonitrile til en en-liters volumetrisk kolbe. Deretter legger du til 1 ml > 95% maursyre til den kolben, og fyll deretter til linjen med acetonitrile.
  2. Monter en 2 x 100 mm kolonne med 2,5 μm partikkelstørrelse og 100 Å porestørrelse med polare endene, eterkoblede fenylperler fullt laget av porøs silika i kolonnerommet. Kontroller at kolonnen også har produsenten anbefalt beskyttelseskassett installert.
  3. Åpne datainnsamlingsprogramvaren, og dobbeltklikk maskinvarekonfigurasjon. LCMS, og klikk aktiver profil.
    1. Klikk Nytt delprosjekt, eller hvis det allerede finnes andre delprosjekter, klikker du Kopier delprosjekt. Gi navn til delprosjektet.
    2. Klikk Nytt dokument. Dobbeltklikk Anskaffelsesmetode. Klikk på Massespesifikasjon er i vinduet Anskaffelsesmetode.
    3. Endre rullegardinmenyen Skannetype til MRM (MRM). Kontroller at Polariteter er satt til Positiv.
    4. Klikk på Importer liste, og velg CSV-filen MDR-TB LCMS-metodeoverganger.csv som er inkludert i tilleggsmateriell.
    5. Rull ned og sett Varighet til 16.751 min. Riktig syklustid og antall sykluser fylles automatisk ut.
    6. I venstre sidefelt klikker du på Integrert Valco-ventil. Kontroller at posisjonsnavnet for trinn 0 er A. I kolonnen Totaltid (min) skriver du inn 0,4 i første rad og 13 i den andre raden.
    7. Sett rad 1 til B og rad to til A i Posisjon-kolonnen.
    8. Klikk på Binær pumpe ivenstre sidefelt. Angi stignings- og strømningshastighetstabellen i henhold til tabell 4.
    9. Klikk Autosampleri venstre sidefelt. Bytt injeksjonsvolum til 10 μL. Klikk på Temperaturkontroll aktivert og sett til 4 °C.
    10. Klikk Kolonnerom ivenstre sidefelt. Sett både høyre og venstre temperaturer til 50 °C.
    11. Lukk og lagre metoden.
  4. Opprett satsvis ved å klikke Nytt dokument og velge Anskaffelsesparti. Skriv inn et angitt navn, og velg den nyopprettede metoden fra rullegardinlinjen.
    1. I et regneark oppretter du en satsvis gruppe som følger denne rekkefølgen: kalibreringskurve, kvalitetskontroller, pasientprøver, kalibreringskurve, kvalitetskontroller, pasientprøver, kalibreringskurve, kvalitetskontroller. Legg til løsemiddel tomme injeksjoner i starten og slutten av løpet, samt før og etter kalibreringskurven, kvalitetskontroller og pasientprøver. Sett minst åtte løsemiddel tomme injeksjoner etter injeksjoner av kalibreringskurvekurven og høy kvalitet kontroll hetteglass for å redusere analyte overføring.
      MERK: Flere løsemiddel tomme injeksjoner må kanskje legges til avhengig av kolonnealder.
    2. Skriv inn riktig autosamplerposisjon for det tilsvarende hetteglasset i kolonnen ved siden av eksempelnavnene.
    3. Klikk Legg til sett. Skriv inn antall eksempler i bunken i popup-vinduet.
    4. Kopier og lim inn eksempelnavn og hetteglassplasseringer fra regnearket til det nylig opprettede partiet.
    5. Gå til Submit Send-fanen.
  5. Likevekten systemet ved å sette løsemiddellinje A inn i mobil fase A og løsemiddellinje B i mobilfase B. Åpne spyleventilen på den binære pumpen.
    1. Sett løsemiddelsammensetning til 50 % B ved 4 ml/min strømningshastighet. Slå på binær pumpe.
    2. Etter 5 min, reduser strømmen til 0,3 ml/min. Lukk spyleventilen. Se etter lekkasjer.
    3. Trykk på Equilibrate på den øverste verktøylinjen i programvaren. Still inn tid til >5 min, trykk OK.
    4. Etter at instrumentet har likegjort, vil modulene nederst til høyre i vinduet vises grønt. Kontroller at trykket har stabilisert seg, og start deretter satsvis ved å klikke Start eksempel.

4. Dataanalyse

  1. Når partiet er fullført, åpner du mengdeprogramvaren. Klikk på tryllestavikonet for å opprette en ny resultattabell.
    1. Klikk Bla gjennom for å navigere til riktig mappe, og merk deretter ut datafilen og klikk pil høyre for å flytte dataene til Valgt-området. Klikk Neste.
    2. Velg Opprett ny metode, og klikk Ny. Skriv inn nytt navn på antallsmetode, og trykk lagre og deretter Neste.
    3. Velg den første injeksjonen av det midterste kalibreringspunktet. Trykk på Neste.
    4. Merk av for alle overganger av de interne standardene i IS-kolonnen.
    5. For kvantifikatisaterovergangene for referansestandardene velger du den tilsvarende IS-en i IS-navn-kolonnen. Klikk Neste.
    6. Bla gjennom overgangene for å sikre at den automatisk valgte oppbevaringstiden er nøyaktig. Kontroller at Gaussian Utjevning er satt til 1,5. Alle andre standardinnstillinger kan forbli som de er (dvs. støyprosent 100 %, opprinnelig grunnlag. Vindu 2,00 min, Peak Splitting 2 poeng).
      MERK: Hvis du vil, kan du endre parametere for automatisk integrering på dette tidspunktet. Siden disse parametrene endres basert på instrumentoppsett, har vi ikke inkludert vår her.
    7. Klikk Fullfør for å bruke mengdemetoden på partiet.
  2. Klikk øverst til venstre Viser toppgjennomgangsknappen for å vise kromatogram. Naviger gjennom overgangene ved hjelp av venstre sidefelt. Bla gjennom hver injeksjon av hver kvantifikatorovergang og integrer riktig topp manuelt om nødvendig.
    1. Hvis du vil integrere en topp manuelt, klikker du på knappen Aktiver manuell integreringsmodus, zoomer inn i kromatogramet ved å klikke og dra langs x- eller y-aksen, og deretter tegne en linje fra en grunnlinje til den andre grunnlinjen, definere toppen. Figur 3 viser to kromatogram: en som har INH, og derfor er integrert manuelt, og en annen som ikke har INH.
      MERK: Alle injeksjoner må integreres ved hjelp av de samme parametrene. Toppbredde kan gi en retningslinje for å følge disse parametrene, men noen ganger vil toppbredden variere. For å kvantifisere en topp, må oppbevaringstiden være innenfor ± 0,15 min av forventet oppbevaringstid for den analyte (som definert av referansestandardtoppene), kvalitativt bekreftet som å ha forventet kvantifikator til kvalifikator til kvalifikator forholdstall (som vist i figur 2),og har et signal-til-støy-forhold på større enn 10.
  3. I Eksempeltype-kolonnen setter du kalibreringskurveinjeksjonene (med unntak av de tomme kalibreringskurveinjeksjonene) til Standard. Sett kvalitetskontrollinjeksjonene til Kvalitetskontroll. La de resterende injeksjonene være ukjente.
    MERK: Dette vil bli satt på tvers av alle overganger.
  4. I kolonnen Faktisk konsentrasjon skriver du inn konsentrasjonene som finnes i tabell 5 for alle kalibreringskurve- og kvalitetskontrollinjeksjoner.
  5. Klikk på den andre fra øverst til venstre Viser kalibreringskurveknappen. Klikk regresjonsknappen.
  6. Sett Vektingstype Type til 1/x, og trykk ok.
  7. Valider kalibreringskurven og kvalitetskontrollprøvene for å sikre at batchen kjørte.
    1. For hver kvantifiserreferanseovergang (ikke interne standardoverganger) kan du se på hver kalibreringskurveinjeksjonsnøyaktighet (i Nøyaktighet-kolonnen). Minst to tredjedeler av kalibreringspunktene må ha en nøyaktighet innen 80-120%.
    2. For kalibreringspunkter langt utenfor forventet nøyaktighet kan injeksjonen være en outlier. Ekskluder outliers hvis deres beregnede konsentrasjon er mer enn to standardavvik unna de to andre injeksjonene av hetteglasset. Ved å klikkepå "et peak to 'not found button above each chromatogram.
    3. Kontroller at R-verdien som vises over kalibreringskurven, er >0,975.
    4. Kontroller at alle kvalitetskontrollinjeksjoner har en nøyaktighet innen 80-120%.
  8. Hvis alle ovennevnte betingelser er oppfylt, har partiet passert, og prøver kan kvantifiseres. Klikk Rediger på verktøylinjen, og klikk deretter Kopier hele tabellen. Lim inn tabellen i et regneark.
  9. Ta gjennomsnittet av den beregnede konsentrasjonen av de to prøveinjeksjonene for å bestemme den rapporterte konsentrasjonen av hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En illustrasjon av et kromatogram med bekreftede nivåer av alle 11 DR-TB-legemidler er vist i figur 1. Oppbevaringstiden for hver analyte kan endres når du bruker forskjellige instrumenter og kolonner, slik at den nøyaktige oppbevaringstiden bør bestemmes individuelt.

Den ekstraherte Ion Chromatograms (EICs) for ett bestemt stoff (isoniazid, INH) i en av kalibratorene (blank hårprøve spiked med DR-TB narkotika referansestandarder) er vist i figur 2. Kvantifikatoren og kvalifiseringsovergangene brukes til kvalitativt å bekrefte tilstedeværelsen av stoffet, da forholdet mellom arealet av kvantifikator og arealet av kvalifikator forblir konstant på tvers av prøver. Den interne standarden overvåkes også for å sikre at hver prøveinjeksjon normaliseres.

I forbindelse med demonstrasjon analyserte vi en praktisk prøve på 15 hårprøver blant en total studiepopulasjon på 96 pasienter som tok DR-TB-legemidler under DOT-forhold fra Western Cape, Sør-Afrika. Tabell 6 presenterer representative nivåer av DR-TB narkotika på tvers av de laveste og høyeste nivåene målt for hver analyte. Selv om data for 15 pasientprøver presenteres, hadde hver analyte ikke 15 nivåer rapportert fordi hver pasient er på en annen kombinasjon av DR-TB medisiner. Ingen av pasientene var på prothionamid, og bare en enkelt pasient tok pretomanid.

Figure 1
Figur 1. En illustrasjon av et representativt kromatogram som viser topper av de 11 analytter i DR-TB-metoden (EMB = ethambutol; INH = isoniazid; PZA = pyrazinamid; ETH = ethionamid; PTH = prothionamid; LFX = levofloxacin; MFX = moxifloxacin; LZD = linezolid; PTM = pretomanid; BDQ = bedaquiline; CLF = klofazimin). Fordi følsomheten til metoden for hver analyte er forskjellig, inh, LZD, LFX, MFX og LZD ble spiked på 20 ng / mg hår mens BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH og PTM ble spiked på 2 ng / mg hår. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. To ekstraherte Ion Chromatograms (EICs) fra en injeksjon av kalibreringspunkt 9 (C9), isoniazid (INH) ved 20 ng/mg. Den øverste EIC viser både INH quantifier overgangen (blå, merket INH-2) og INH kvalifiseringsovergang (rød, merket INH-3). Den nederste EIC viser respons fra INH-d4, den interne standarden (IS) som brukes til å kvantifisere INH. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Skjermbilder av kvantitetsprosessen. Den øverste delen er en delvis prøveliste som viser injeksjonsdata for en analyte (INH, isoniazid) på tvers av 12 kalibreringspunkter (merket C0-C11), tre QC-nivåer og seks prøver. Nedre venstre del er kalibreringskurven, fra 0,5 ng/mg –100 ng/mg. Ugjennomsiktige blå prikker er kalibreringspunkter. Gjennomsiktige blå firkanter er kvalitetskontrollpunkter. R-verdien vises øverst til venstre (0,99722) med vekting 1/x. De to kromatogrammene nederst til høyre illustrerer en prøve med INH (toppkromatogram) og en prøve uten INH (bunnkromatogram). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Legemidler i hver blanding Konsentrasjonen av hvert legemiddel i blanding Volum av blanding lagt til 50ml vol. kolbe
Mix 1: CLF-d7, EMB-d4 10 μg/ml 40 μL (40 μL)
Mix 2: LFX-d8, PTH-d5 10 μg/ml 10 μL (10 μL)
Mix 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS for PTM) 10 μg/ml 20 μL (20 μL)
Mix 4: PZA 15N-d3 10 μg/ml 200 μL (200 μL)
Bland 5: INH-d4 10 μg/ml 100 μL

Tabell 1. Konsentrasjon og mengde av hver intern standard for å legge til en 50 ml volumetrisk kolbe.

Stoffet Konsentrasjon av lager Volum lagt til
BDQ (andre er i seg selv) 0,5 mg/ml 8 μL (8 μL)
Clf (andre kan være på 0,5 mg/ml 8 μL (8 μL)
EMB (andre kan være på 1 mg/ml 4 μL (andre er i sl)
PTH (andre er i kraft) 1 mg/ml 4 μL (andre er i sl)
PTM (andre kan være på samme 1 mg/ml 4 μL (andre er i sl)
INH (andre har vært på stedet 1 mg/ml 40 μL (40 μL)
LFX (andre er i ferd med 1 mg/ml 40 μL (40 μL)
Lzd (andre har vært på plass 1 mg/ml 40 μL (40 μL)
Mfx 1 mg/ml 40 μL (40 μL)
PZA (andre er i seg selv 1 mg/ml 40 μL (40 μL)

Tabell 2. Mengden av hver legemiddelreferansestandard for å legge til "Ref Std Mix 1" hetteglass.

Etikettnavn Hetteglass hentet fra Volum lagt til
C0 (andre er) N/a 0 μL
C1 (andre) Ref Std Mix df1000 5 μL (5 μL)
C2 (andre) Ref Std Mix df1000 10 μL (10 μL)
C3 (andre) Ref Std Mix df1000 20 μL (20 μL)
C4 (andre er) Ref Std Mix df100 5 μL (5 μL)
C5 (andre er) Ref Std Mix df100 10 μL (10 μL)
C6 (andre) Ref Std Mix df100 20 μL (20 μL)
C7 (andre) Ref Std Mix df10 5 μL (5 μL)
C8 (andre) Ref Std Mix df10 10 μL (10 μL)
C9 (andre er) Ref Std Mix df10 20 μL (20 μL)
C10 (andre er) Ref Std Mix df1 5 μL (5 μL)
C11 (andre er i 2015 Ref Std Mix df1 10 μL (10 μL)

Tabell 3. Mengden av hver Ref Std Mix mellomliggende for å legge til de 12 kalibreringspunktene.

Total tid (min) Strømningshastighet (μL/min) A (%) B (%)
0 450 95 5
0.3 450 95 5
2.3 450 0 100
5 550 0 100
11 550 0 100
11.1 550 95 5
13 450 95 5
16.75 450 95 5

Tabell 4. Strømningshastigheten og den mobile fasegradienten som brukes til hver injeksjon.

Kalibreringspunkt Faktisk konsentrasjon av BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (ng/mg) Faktisk konsentrasjon av INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg)
C0 (andre er) 0 0
C1 (andre) 0.005 0.05
C2 (andre) 0.01 0.1
C3 (andre) 0.02 0.2
C4 (andre er) 0.05 0.5
C5 (andre er) 0.1 1
C6 (andre) 0.2 2
C7 (andre) 0.5 5
C8 (andre) 1 10
C9 (andre er) 2 20
C10 (andre er) 5 50
C11 (andre er i 2015 10 100

Tabell 5. Endelig konsentrasjon av analytter i hvert kalibreringspunkt.

Stoffet Lod
(ng /mg hår)
Lloq
(ng /mg hår)
ULOQ (andre er i seg selv)
(ng /mg hår)
Prøveverdier (ng/mg hår)
Eksempler: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109
Bedaquiline (andre er i slekt) 0.005 0.05 10 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64
Clofazimin (andre kan foregåava) 0.005 0.05 10 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01
Ethambutol (nær Ethambutol) 0.005 0.05 10 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76
Ethionamide 0.01 0.01 10
Isoniazid (Nær Isoniazid) 0.05 0.5 100
Levofloxacin 0.1 0.5 100 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96
Linezolid 0.1 0.5 100 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22
Moxifloxacin 0.05 0.5 100 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64
Pretomanid (andre er i verk) 0.005 0.05 10 0.57
Prothionamide (andre betydninger) 0.002 0.01 10
Pyrazinamid 0.05 1 100 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66

Tabell 6. Representative nivåer av legemidler målt hos 15 pasienter som tar DR-TB medisiner under DOT. Grensen for deteksjon (LOD), nedre grense for kvantifisering (LLOQ) og øvre grense for kvantifisering (ULOQ) av metoden for hvert legemiddel er gitt for sammenligning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi rapporterer her protokollen for metoden vi utviklet og validert for å kvantifisere 11 anti-TB medisiner benyttet i behandlingen av DR-TB i små hårprøver ved hjelp av LC-MS / MS. Ingen annen metode for å kvantifisere disse 11 stoffene i håret er tidligere utviklet, validert og publisert. Vår metode kan kvantifisere sub-nanogram nivåer av narkotika i bare 20-30 hårtråder på ca 3 centimeter (cm) i lengde (~ 2 mg) og har allerede blitt validert22. Den lave vekten av hår analysert betyr at pasienter som er involvert i studien kan delta diskret og potensielt gå tilbake for gjentatt testing uten frykt for å utsette skallet hodebunn. Vi har tidligere publisert data om sammenhengen mellom DR-TB narkotika nivåer i hår og DR-behandling utfall23. Derfor representerer utvikling og validering av denne multi-analyte panelmetoden et betydelig fremskritt innen DR-TB terapeutisk legemiddelovervåking.

Håret krever forskjellige homogeniseringsteknikker enn de som kreves med flytende biomatrices. Pulverisering av hårstrå ene ga effektiv tilgang til ekstraksjonsløsningsmiddel for å analytter i hårmatrisen. Dermed er en viktig funksjon i vår metode den raske og enkle ekstraksjonsprosessen av legemidler fra hår ved hjelp av pulveriserte prøver. Inkubasjonstiden under ekstraksjonsprosessen er bare to timer, på grunn av det store tilgjengelige overflatearealet av pulverisert hår, og det er ingen oppryddingstrinn, på grunn av den lille prøvestørrelsen (2 mg). Det må imidlertid utvises forsiktighet for å begrense nedbrytning av legemidler under utvinningsprosessen. Protokollen bruker en to-syklus pulverisering, med en 45 s kjøleperiode mellom syklusene. Denne prosessen unngår overoppheting og potensielt nedverdigende stoffene i håret.

I motsetning til mange håranalyser for misbruk, bruker denne metoden ikke et vasketrinn. DR-TB narkotika kommer i kapsel eller tablett form, begrense mulige kilder til ekstern forurensning og påfølgende behov for å vaske håret før analyse. Fremtidige studier kan analysere vaskemiddel fra DR-TB pasienthår for å vurdere ekstern forurensning.

Selv om hårpulverisering fremmer effektiv legemiddelutvinning, har den sine egne begrensninger. Vårt laboratorium har funnet ut at hvis håret pulveriseres i perleruptoren og forlatt ved romtemperatur, reduseres konsentrasjonen av noen av de 11 legemidlene over uker og måneder. Dette kan skyldes det store overflatearealet av det pulveriserte håret utsatt for atmosfæren som kan fremme oksidasjon og andre nedbrytningsreaksjoner. Hvis en stabilitetsstudie av stoffene i håret er ønsket, kan håret klippes med saks i små segmenter av <1 cm, homogenisert for hånd, og deretter igjen ved romtemperatur i uker eller måneder under stabilitetsstudien. Når dette klippehåret pulveriseres på analysedagen, har vi ikke observert noen signifikant narkotikanedbrytning over tid. Derfor, i å utføre den beskrevne protokollen, anbefaler vi at håret pulveriseres den dagen det er hentet ut. På samme måte bør alle legemiddelblandinger under 10 μg/ml konsentrasjoner fremstilles på utvinningsdagen.

Ingen tidligere publiserte metoder er tilgjengelige for å vurdere egnetheten til de lineære dynamiske områdene (LLOQ-ULOQ) vi etablerte for hvert TB-stoff i multi-analyte-metoden. Imidlertid indikerer praktisk prøve av hårprøver fra Western Cape, Sør-Afrika, egnetheten til det lineære dynamiske området av denne metoden. Med unntak av ethionamid, pretomanid og prothionamid, er mer enn 95% av legemiddelnivåene vi målte hos disse pasientene innenfor det lineære dynamiske området for hver analyte. Bare én pasient tok pretomanid (som ble påvist), og ingen pasienter tok protionamid. For ethionamid, vi hypotetisere at stoffet ikke kan deponere til hårmatrisen godt, som vår LOD er 0,01 ng / mg hår (eller 10 pg / mg hår) og likevel bare en av de åtte pasientene som tar ethionamid har nivåer større enn 0,02 ng / mg hår. Videre undersøkelse er berettiget til å bestemme farmakokinetikken til forskjellige TB-legemidler i håret. For eksempel er et potensielt alternativ for overvåking av legemidler som ethionamid å utvikle en metode rettet mot deres metabolitter(er) i stedet. Vi har gjort en lignende observasjon for delamanid, en roman DR-TB medisiner, som i utgangspunktet var en del av dette panelet. En metode rettet mot delamanids metabolitt er for tiden i ferd med å bli validert i laboratoriet vårt, fordi metabolitten finnes i høyere konsentrasjoner enn det overordnede stoffet. Den samme prosedyren kan utføres for ethionamid. Legemiddelkonsentrasjonene i tabell 6 presenteres som en gruppe fordi de enkelte resultatene og kliniske resultatene ikke er fokus for denne metodeoppgaven. Individuell vurdering av denne pasientgruppen er publisert andre steder23.

Pasientene som bidro med små hårprøver for demonstrasjonsstudien ble administrert en rekke legemiddelregimer via DOT i en pasientsetting, og alle regimer ble dokumentert i henhold til sykepleiejournaler i pasientperioden. Men, som det er vanlig blant DR-TB-pasienter, hadde tidligere, dårlig dokumenterte legemiddelregimer også blitt administrert før deres innleggelsesopphold. Dette førte til påvisning av legemidler i pasienthår som ikke ble notert på deres innleggelsesjournaler. Derfor kunne vi ikke bruke disse prøvene til å bestemme spesifisitet av metoden, da vi ikke kunne avgjøre om disse prøvene var virkelig falske positive. I stedet testet vi hår fra pasienter som ikke tok DR-TB-legemidler. Ingen DR-TB-legemidler ble påvist i disse prøvene, noe som indikerer at metoden er spesifikk.

Selv om vår metode demonstrerer nytten av å bruke hår i å måle DR-TB narkotika, håranalyse har sitt eget sett med begrensninger. Fordi hår er en solid matrise, spiking av narkotika referansestandarder under metodevalidering tillater ikke for standardenes full integrasjon i matrisen som med urin og blod. Dermed er utvinningvurdering begrenset til påvisning av stoffet etter spiking på den faste matrisen, og ikke faktisk gjenfinning fra matrisen. Likeledes, fordi håret er en alternativ matrise som fortsatt blir utforsket for testing, ingen lett tilgjengelige referanseområder for medisiner er tilgjengelig for å vurdere metoden egnethet. Mer farmakokinetiske studier på inkorporering av legemidler i håret vil være nyttig for å ytterligere forstå nytten av hår narkotika nivåer i etterlevelse overvåking. Til slutt har riktig samling av hårprøver på feltsteder sine egne unike utfordringer. Mens innsamling og lagring av hårprøver krever færre ressurser enn andre biomatrices, må det tas hensyn til å identifisere de distale og proksimale endene av hårstråene lenger enn 2 cm. Lengre hårtråder kan ha forskjellige legemiddelkonsentrasjoner langs tråden, avhengig av medisineringsbruk over tid. Riktig merking gir mulighet for analyse av bestemte segmenter av trådene; i tilfelle av vår metode ble de tre centimeterne med hår nærmest hodebunnen brukt til å bestemme de nyeste dataene om medisineringsoverholdelse. Riktig merking krever opplæring og kvalitetssikringsprosedyrer på nettstedene.

Oppsummert har vi utviklet det første multi-analyte-panelet for å analysere TB-medisiner som brukes til DR-TB via LC-MS/ MS i små hårprøver. Gitt muligheten for å samle inn og lagre hår i ressursbegrensede innstillinger, representerer vår metode et potensielt betydelig fremskritt innen TB terapeutisk legemiddelovervåking. Objektive tiltak for legemiddeleksponering som tar hensyn til både etterlevelse og individuell farmakokinetisk variabilitet, kan gi tidlig indikasjon på ineffektive behandlingsregimer, og dermed hjelpe både individuell behandling samt begrense samfunnet overføring av DR-TB24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe og Monica Gandhi).

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail og Marietjie Pretorius ved University of Cape Town Lung Institute som tilrettelagte innsamling av hårprøver for studien. Forfatterne anerkjenner videre bidragene fra deltakerne i denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL injection vials Agilent Technologies 5182-0716
250 uL injection vial inserts Agilent Technologies 5181-8872
Bead ruptor 24 OMNI International 19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) OMNI International 19628
Bedaquiline Toronto Research Chemicals B119550
Bedaquiline-d6 Toronto Research Chemicals B119552
Clofazimine Toronto Research Chemicals C324300
Clofazimine-d7 Toronto Research Chemicals C324302
Disposable lime glass culture tubes VWR 60825-425
Ethambutol Toronto Research Chemicals E889800
Ethambutol-d4 Toronto Research Chemicals E889802
Ethionamide Toronto Research Chemicals E890420
Ethionamide-d5 ClearSynth CS-O-06597
Formic acid Sigma-Aldrich F0507-100mL
Glass bottles Corning 1395-1L
Hot Shaker Bellco Glass Inc 7746-32110
HPLC Agilent Technologies Infinity 1260
HPLC grade acetonitrile Honeywell 015-4
HPLC grade methanol Honeywell 230-1L
HPLC grade water Aqua Solutions Inc W1089-4L
Isoniazid Toronto Research Chemicals I821450
Isoniazid-d4 Toronto Research Chemicals I821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm Phenomenex 00D-4371-B0
LC guard cartridge Phenomenex AJ0-8788
LC guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000
LC-MS/MS quantitation software Sciex Multiquant 2.1
Levofloxacin Sigma-Aldrich 1362103-200MG
Levofloxacin-d8 Toronto Research Chemicals L360002
Linezolid Toronto Research Chemicals L466500
Linezolid-d3 Toronto Research Chemicals L466502
Micro centrifuge tubes E&K Scientific 695554
Moxifloxacin Toronto Research Chemicals M745000
Moxifloxacin-13C, d3 Toronto Research Chemicals M745003
MS/MS Sciex Triple Quad 5500
OPC 14714 Toronto Research Chemicals O667600
Pretomanid (PA-824) Toronto Research Chemicals P122500
Prothionamide Toronto Research Chemicals P839100
Prothionamide-d5 Toronto Research Chemicals P839102
Pyrazinamide Toronto Research Chemicals P840600
Pyrazinamide-15N, d3 Toronto Research Chemicals P840602
Septum caps for injection vials Agilent Technologies 5185-5862
Turbovap LV evaporator Biotage 103198/11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Global Tuberculosis Control 2017. Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  2. WHO. Tuberculosis. Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
  3. Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
  4. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. (2017).
  5. Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
  6. Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24, (11), 1448-1452 (2012).
  7. Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10, (9), 1001511 (2013).
  8. Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46, (2), 163-168 (1989).
  9. Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134, (10), 968-977 (2001).
  10. Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
  11. Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. (2019).
  12. Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. (2019).
  13. Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9, (4), 238-246 (2008).
  14. Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56, (2), 90-100 (2018).
  15. Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28, (3), 442-446 (2006).
  16. Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3, (1), 67-79 (2011).
  17. Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52, (10), 1267-1275 (2011).
  18. Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29, (7), 825-830 (2015).
  19. Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76, (4), 367-371 (2017).
  20. Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10, (6), 0129100 (2015).
  21. Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
  22. Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
  23. Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5, (2), (2019).
  24. Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12, (9), 1001877 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics