Utarbeidelse av Drosophila Larval og Pupal Testiklene for analyse av celledivisjon i Live, intakt vev

JoVE Journal
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Målet med denne protokollen er å analysere celledeling i intakt vev ved levende og fast cellemikroskopi ved hjelp av Drosophila meiotic spermatocytes. Protokollen demonstrerer hvordan man isolerer hele, intakte testikler fra Drosophila larver og tidlig pupae, og hvordan du behandler og monterer dem for mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eksperimentell analyse av celler som deler seg i levende, intaktvev og organer er avgjørende for vår forståelse av hvordan celledeling integreres med utvikling, vev homeostase og sykdomsprosesser. Drosophila spermatocytes som gjennomgår meiose er ideelle for denne analysen fordi (1) hele Drosophila testiklene som inneholder spermatocytter er relativt lett å forberede seg på mikroskopi, (2) spermatocytes store størrelse gjør dem godt egnet for høyoppløselig bildebehandling, og (3) kraftige Drosophila genetiske verktøy kan integreres med in vivo analyse. Her presenterer vi en lett tilgjengelig protokoll for fremstilling av hele testikler fra Drosophila tredje instar larver og tidlig pupper. Vi beskriver hvordan du identifiserer meiotic spermatocytes i forberedt hele testiklene og hvordan å bilde dem leve av time-lapse mikroskopi. Protokoller for fiksering og immunfarging av hele testiklene er også gitt. Bruken av larval testiklene har flere fordeler fremfor tilgjengelige protokoller som bruker voksne testiklene for spermatocytter analyse. Viktigst, larval testiklene er mindre og mindre overfylt med celler enn voksne testiklene, og dette forenkler i stor grad høyoppløselig avbildning av spermatocytter. For å demonstrere disse fordelene og anvendelsene av protokollene presenterer vi resultater som viser omfordelingen av endoplasmatisk reticulum med hensyn til spindelmikrotubuli under celledeling i en enkelt spermatocyte avbildet av tidsforløp konfokal mikroskopi. Protokollene kan kombineres med uttrykk for en rekke fluorescerende merkede proteiner eller organelle markører, samt genmutasjoner og andre genetiske verktøy, noe som gjør denne tilnærmingen spesielt kraftig for analyse av celledelingmekanismer i den fysiologiske konteksten av hele vev og organer.

Introduction

Celledeling studeres ofte ved hjelp av cellelinjer dyrket i kultur1. Mens vi har fått et vell av uvurderlig innsikt og forståelse av grunnleggende mekanismer fra disse studiene2, celler dyrket i kultur kan ikke fullt ut rekapitulere fysiologien til celledeling som det oppstår i intakt, levende vev. For eksempel, i intakt vev og organer, celler må dele på rett sted og til rett tid slik at avkom celler er riktig plassert i vevet, slik at de kan gjennomgå passende differensiering eller funksjonelle programmer, og slik at cellespredning er riktig koordinert med vevvekst eller homeostase3. For celler dyrket i kultur derimot, er celledeling generelt regulert av vekstfaktorer i kulturmediet4, og dermed kan vi ikke lære av disse cellene hvordan vivo miljøfaktorer som vevarkitektur eller utviklingssignaler påvirker divisjonsprosessen. Det er også viktig å merke seg at mange av cellelinjene som brukes til å studere celledeling, som HeLa og U2OS-celler, ble avledet fra metastatiske svulster5. Derfor har mange aspekter ved den grunnleggende fysiologien til disse kreftcellene, som cellesyklusregulatoriske mekanismer og kromosomstabilitet, sannsynligvis blitt endret sammenlignet med friske celler. Fullstendig forståelse av celledelingsfysiologi avhenger derfor av vår evne til å studere skilleceller i sitt opprinnelige, in vivo-miljøer som bevarer fysiologiske regulatoriske mekanismer og vevsarkitektur.

Fremskritt i å forstå hvordan celledeling opererer innenfor intakt vev og organer er hemmet av vanskeligheter som er iboende for in vivo eller ex vivo analyse. For det første kan det være vanskelig eller umulig å få tilgang til skilleceller for mikroskopisk analyse i store organer eller tykt vev. For det andre er det ofte vanskelig å forutsi når individuelle celler vil dele seg in vivo. For det tredje kan vevsfysiologi raskt forverres under ex vivo-kulturen. I denne protokollen beskriver vi lett tilgjengelige metoder for levende og fast analyse av Drosophila melanogaster spermatocytes som de gjennomgår meiotiske celledivisjoner innenfor helt intakte testikler. Disse cellene er ideelle for live, ex vivo analyse fordi de er lett tilgjengelig med standard optiske metoder som konfokal mikroskopi, de deler seg på forutsigbare tider og steder, og intakte testiklene kan opprettholdes i ex vivo kultur for opptil ca 24 timer. I tillegg er Drosophila spermatocytes store runde celler (ca. 20–30 μm i diameter) som ikke endrer form når de deler seg, noe som gjør dem ideelle for høy oppløsning, tidsforløpsavbildning av cellulære komponenter som spindelapparatet og cytoplasmatiske organeller. Selv om disse cellene gjennomgår meiose i motsetning til mitose, er mange av de essensielle celledelingsprosessene svært like mellom disse to celledelingsmekanismene6. Disse fordelene, kombinert med kraftige Drosophila genetiske verktøy, har gjort Drosophila spermatocytes en mye brukt modell for ex vivo analyse av essensielle celledeling prosesser inkludert spindel dannelse og regulering, cytokinese, og organelle remodeling og partisjonering7,8,9,10,11.

Spermatocytter er celler som er på det meiotiske stadiet av spermatogenese. I Drosophilabegynner spermatogenese med en gruppe kimline stamceller som ligger i en liten region eller "hub" på en pol av testis12,13. Disse cellene deler seg ved en asymmetrisk mitose, noe som gir opphav til et enkelt differensiert spermatogonium. Spermatogonia gjennomgår deretter fire synkrone mitoseer for å produsere en gruppe på 16 celler som forblir nært forbundet i en enkelt cyste. På dette stadiet, cellene overgang fra en mitotisk til en meiotisk celle syklus og er referert til som spermatocytes. Spermatocytter tilbringer omtrent to til tre dager i et utvidet G2-stadium av cellesyklusen, der de vokser dramatisk og gjennomgår cytologiske endringer i forberedelse til de to meiotiske divisjonene og påfølgende spermiogenese13,14. Hele gruppen av 16 spermatocytter i en enkelt cyste går deretter inn i den første meiotiske divisjonen samtidig. Dermed kan flere meiotiske spermatocytter avbildes samtidig som de fortsetter gjennom celledeling. Den første meiotiske divisjonen fortsetter for ca 1,5 timer og følges nesten umiddelbart av den andre meiotiske divisjonen, noe som gir 64 totale spermatider som fortsetter å differensiere til modne spermatozoa.

En unik fordel ved å bruke spermatocytter til å studere celledeling i levende, intakt vev er at grupper eller cyster av celler stadig utvikler seg gjennom de forskjellige stadiene av spermatogenese, og celler i alle stadier av spermatogenese kan vanligvis identifiseres i en gitt testis (se figur 3A). Derfor er det relativt enkelt å finne meiotiske celler i hele testiklene. Vi fokuserer generelt våre analyser på den første i motsetning til andre meiose fordi disse cellene er mye større og mer mottagelige for høyoppløselig bildebehandling, men hele prosessen som omfatter begge meiotiske divisjoner kan bli avbildet. Det bør også bemerkes at den generelle protokollen for testis forberedelse og kultur kan brukes til å analysere andre prosesser av spermatogenese også, for eksempel den tidligere mitotiske stamcelle eller spermatogonial divisjoner eller cytologiske endringer som oppstår som spermatids modnes i spermatozoa15. Mange av disse aspektene av spermatogenese er svært bevart mellom Drosophila og mennesker16.

Drosophila spermatocytes begynner å nå den meiotiske fasen av spermatogenese under den tredje instar larval stadium av Drosophila utvikling13. Derfor kan testiklene isolert fra livssyklusstadier som begynner med tredje instar larver og inkludert pupper og voksne brukes til analyse av å dele spermatocytter. Flere gode protokoller er tilgjengelige for utvinning av testiklene fra voksne mannlige fluer for levende og fast analyse av spermatogenese17,18,19. Disse protokollene kan være å foretrekke for å studere sene stadier av spermatogenese eller hvis genetiske markører som bare er synlige hos voksne, må brukes. Protokollen fokuserer i stedet på testis forberedelse fra larver og tidlig pupae, fordi testiklene på disse stadiene har flere fordeler som er spesielt relevant for celledelinganalyse ved høy oppløsning, tidsforløpmikroskopi. For det første er testiklene fra larver og pupper mindre enn de fra voksne, og cellene i orgelet er mindre overfylte. På grunn av dette kan deling av spermatocytter ofte avbildes nær den ytre overflaten av larvetestikler, uten å måtte trenge gjennom flere lag med lysspredningsvev. For det andre beveger voksne testikler seg rytmisk på grunn av sammentrekninger av de vedlagte tilbehørsorganene, og disse bevegelsene gjør tidsforløpsavbildning av individuelle celler utfordrende. Og for det tredje er larvaltestiklere fordelaktige når de studerer genmutasjoner som forårsaker pupal eller voksen dødelighet. Våre metoder er optimalisert for langsiktig kultur av testikler på mikroskopstadiet, noe som gjør det mulig å bilde av flere runder med celledeling eller utviklingen av individuelle celler gjennom flere stadier av spermatogenese i samme preparat. Vi beskriver også en protokoll for fiksering og immunfarging av hele testikler. Samlet sett er våre protokoller spesielt nyttige for de som er interessert i å studere celledeling i intakt vev, og evnen til å kombinere spermatocytteranalyse med svært tractable Drosophila genetiske verktøy gjør dette til en spesielt kraftig tilnærming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjør dyr, verktøy og medier for disseksjon

  1. Cross mannlige og kvinnelige fluer for å få avkom av ønsket genotype. Nyttige transgene markører for identifisering og iscenesettelse av meiotiske spermatocytter inkluderer GFP-tubulin for å merke meiotisk spindel og RFP-histone 2A for å merke krosomer8. Bruk fem til ti hunner per kors og vedlikehold kors på standard flymat i hetteglass i en 25 °C inkubator til tredje instar larver begynner å krype opp på sidene av hetteglasset (4-5 dager). Tidlig hvit pupper vil begynne å danne en dag senere.
  2. Få to par rette tang med fine tips. Sørg for at spissene er skarpe, selv i lengde og rett (Figur 1A). Bruk disse pinsettene kun til deksjoner, og lokk med 10 μL pipettespisser når den ikke er i bruk.
  3. Forbered et skalpellverktøy.
    1. Sett den stumpe enden av en svart anodisert stålinsektpinne inn i en pinholder, og vri skruen på holderen for å feste pinnen på plass. Ved hjelp av et par tang og under et dissekerende mikroskop, ta tak i insektpinnen i midten og bøy den for å danne en intern vinkel på 135° (Figur 1B). Den skarpe enden er for skjærevev, mens kanten brukes til å overføre testikler mellom dråper media.
    2. Hette med en pipettespiss på 1000 μL når den ikke er i bruk.
  4. Arbeide i en vev kultur hette, forberede 5 ml aliquots av Schneiders medier og lagre på 4 °C til brukstidspunktet. Når du er klar til å begynne desseksjoner, varm en 5 ml media aliquot til romtemperatur. Overfør deretter de oppvarmede disseksjonsmediet til en 10 ml sprøyte og fest et sprøytefilter på 0,22 μm.

2. Disseksjon av testiklene fra larver og tidlig pupae

  1. Bruk den mediefylte filtersprøyten til å utvise tre dråper papir (50 μL hver) øverst, midten og bunnen av et glasslysbilde.
  2. Bruk en dissekerende sonde for å overføre fem til ti tredje instar larver eller tidlig pupper (pupper som fortsatt er hvite eller gule) til toppdråpen. Rør forsiktig larver og pupper i media med dissekering sonden for å fjerne mat eller rusk.
  3. Under et dissekerende mikroskop, snu en enkelt larve eller pupa på siden med en dissekerende sonde for å identifisere de to bilaterale testiklene hvis det er tilstede, som vises som ovale gjennomsiktige strukturer i den bakre tredjedelen av kroppen (Figur 2A, B). Dyr som mangler testikler er kvinnelige og bør kastes.
  4. Når en mannlig larve eller pupa er funnet og er ren, flytt den til den andre dråpe med media. Gjenta til 3 eller 4 mannlige larver og/ eller pupper har blitt overført til den andre dråpen av media.
  5. Arbeider i den andre dråpe av media, forstå en enkelt mannlig larve eller pupa med et par tang i midten av regionen, bare fremre til testiklene. Bruk det andre paret med tang til å forsiktig rive dyret i to.
  6. Hold den bakre enden av larven eller puppen nede på glasssklien med et par tang. Starter like ved siden av pinsett, trykk ned på skjellaget ved hjelp av kanten av skalpellverktøyet og flytt skalpellen mot kuttet enden av dyret. Dette vil utvise dyrets indre organer, som inkluderer guts, fett kropper, og testiklene.
  7. Tease forsiktig fra hverandre testiklene fra resten av organene. Testiklene er klare, ovale formede organer innebygd i bånd av fettkropp (Figur 2C).
  8. Overfør testiklene én om gangen til det tredje dråpen av medier. For å oppnå dette, sett kanten av skalpellen under fettkroppen, løft vevet ut av media, og raskt flytte det til tredje dråpe.
  9. Alternativt, hvis det ikke er nok fett kroppen fortsatt festet til testiklene for å løfte vevet, forsiktig overføre vevet ved hjelp av et glass Pasteur pipette som har blitt pre-fuktet med disseksjon media.
  10. Bruk den skarpe enden av skalpellverktøyet til å forsiktig skjære bort overflødig fettkropp fra testiklene, slik at bare en liten kant av fettkroppen rundt kantene (Figur 2C). Det er ikke nødvendig å fjerne hele fettkroppen, og forsøk på å gjøre det vil sannsynligvis resultere i skadelig eller rupturing av testiklene.
  11. Gjenta trinnene ovenfor for alle de mannlige larver på glasslysbildet.
  12. Fortsett enten til trinn 3 eller trinn 5.

3. Montering testiklene for Live Mikroskopisk bildebehandling

MERK: Denne monteringsprosedyren ble tilpasset fra en nylig publisert protokoll for avbildning av Drosophila larval hjerne neuroblasts20. Du finner mer informasjon i denne referansen.

  1. Bruk filtersprøyten til å sette en enkelt dråpe Schneiders medier (ca. 30 μL) på midten av en 50 mm gassgjennomtrengelig kulturrett.
  2. Bruk en forhåndsfuktet Pasteur pipette til å overføre de tilberedte testiklene til fallet på gasspermeable parabolen. Testiklene vil vanligvis flyte til overflaten av fallet.
  3. Bruk skalpellverktøyet til å forsiktig skyve testiklene ned på den gassgjennomtrengelige membranen. Pass på at du ikke bryter den gassgjennomtrengelige membranen med det skarpe punktet i skalpellen. Skyv alle testiklene til midten av dråpen.
  4. Bruk en 1 ml sprøyte fylt med halokarbonolje for å lage fire dråper olje, ca. 30 μL hver, på gasspermeable membranen. Space dråpene av olje rundt dråpe av media som inneholder testiklene tilsvarer de fire hjørnene av en 22 mm glass coverslip.
  5. Linje opp hjørnene av en 22 mm glass coverslip med de fire dråper halokarbonolje og forsiktig senke dekselet slip på media og olje. La dekkseddelen slå seg til ro og at mediene som inneholder testiklene kan spre seg mellom oljedråpene.
  6. Fjern overflødig ei for å la dekksklien slå seg ned på overflaten av testiklene. Mens du observerer testiklene under et dissekerende mikroskop, setter du hjørnet av en delikat oppgave tørke inn i media under dekselet slip for å transportere bort en liten mengde væske. Fukt bort nok media til glassdekselet bare kommer i kontakt med overflaten av de største testis. Det er avgjørende å ikke fjerne for mye media og senke dekkseddelen for langt, da dette vil utøve press på testiklene og få dem til å briste (se figur 5).

4. Live Imaging av meiotiske spermatocytter

MERK: Spermatocytes kan avbildes ved hjelp av en laser skanning eller spinning disk confocal mikroskop. Systemet må ha tilstrekkelig hastighet og følsomhet for å unngå fotobleking av fluorescerende proteiner eller fotoskade av vevet.

  1. Plasser en dråpe nedsenking olje på glassdekselet like over testiklene. Vend over fatet og plasser den på mikroskopstadiet og flytt mikroskopmålet (40x eller 60x) inn i oljen til den er like under testiklene. Bruk overført lys for å finne en enkelt testis og bringe den i fokus.
  2. Mens du tar raske bilder med konfokal, flytte testene rundt for å undersøke organiseringen av cellene. Den ene enden av testis vil ha mange små, tettpakkede celler. Denne enden inneholder germline stamceller og spermatogoni. Beveger seg mot den andre enden av orgelet, identifisere gradvis større celler organisert i diskrete klynger eller cyster. Disse store cellene er spermatocytter (Figur 3A).
  3. Hvis bildebehandling av GFP-tubulin, identifisere spermatocytter som vil starte meiose innen 30-60 min ved tilstedeværelse av to lyse microtubule asters (dvs. centrosomes) ligger ved cortex av cellen (Figur 3B, C).
  4. Når en cyste av meiotiske spermatocytter er identifisert, sette opp oppkjøpparametere for å fange z-stabler av bilder over tid. Vanligvis er oppkjøp av 15-20 bilder plassert 1,5 μm fra hverandre i z-dimensjonen tilstrekkelig til å fange hele volumet av flere spermatocytter i samme cyste.
  5. Skaffe full z-stabler hver 2 min hvis imaging hele første meiotic divisjon, som tar ca 1,5 timer. Det er mulig å bruke raskere oppkjøpsrater, spesielt hvis bare en bestemt hendelse av meiose skal analyseres. Vær imidlertid forsiktig så du ikke forårsaker fotobleking eller fotoskade på grunn av gjentatt eksponering av prøven for lasereksitasjon.
  6. Bruk et kontinuerlig, automatisk fokuskontrollsystem for å hindre fokal drift i løpet av det lange tidsforløpet av oppkjøpet. Temperaturkontroll av prøven på mikroskopstadiet er vanligvis ikke nødvendig, forutsatt romtemperatur på ca. 22–23 °C. Hvis temperaturkontroll er tilgjengelig, må du vedlikeholde prøven ved 25 °C på mikroskopstadiet.
  7. Hvis meiotiske spermatocytter ikke blir funnet, oppbevar prøven i flere timer eller over natten i en 25 °C inkubator og bilde igjen.

5. Fiksering og immunfarging

  1. Fra trinn 2.10 ovenfor, bruk en glass Pasteur pipette for å overføre testiklene til en brønn i en 9-brønnglass dissekerende tallerken som inneholder 0,5 ml 8% paraformaldehyd i PBSTx (fosfat bufret saltvann med 0,3% Triton X-100). Pass på at testiklene ligger på bunnen av parabolen.
    MERK: Paraformaldehyd er giftig og bør håndteres med hansker i en røykhette.
  2. Fest testiklene i 20 min ved romtemperatur.
  3. Overfør testiklene til en brønn som inneholder 0,5 ml PBSTx. Vask i 5 min med mild agitasjon. Gjenta vasketrinnet i nye brønner med fersk PBSTx to ganger til.
  4. Fortynn primær antistoff til ønsket konsentrasjon i 0,5 ml PBSTx som inneholder 5% storfe serum albumin (BSA) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Overfør testiklene fra 9-brønnglassdissekeringsfatet til røret av fortynnet primær antistoff og inkuber over natten ved 4 °C med mild gynge eller nøttasjon.
  5. Vask testiklene i 0,5 ml PBSTx i 5 min i en brønn av en 9-brønn glass dissekerende tallerken. Gjenta vasketrinnet med fersk PBSTx to ganger til.
  6. Fortynn sekundært antistoff i 250 μL PBSTx som inneholder 5% BSA og dispenser ei en ren brønn av en 9-brønn glass dissekerende tallerken. Hvis ønskelig, tilsett DAPI for å beise DNA. Overfør testiklene til det godt inneholdende sekundære antistoffet, dekk med plastfolie og inkuber i mørket med mild agitasjon i 4 timer ved romtemperatur.
  7. Overfør testiklene til en ren brønn fylt med 0,5 ml PBSTx. Vask med fersk PBSTx to ganger i 5 min og en tredje gang i 30 min.

6. Montering av faste testikler

  1. Overfør testiklene fra siste vask til et glassmikroskopilysbilde med pasteurpipette. Bruk eventuelt kanten av skalpellverktøyet til å skyve testiklene ned på overflaten av lysbildet.
  2. Bruk hjørnet av en delikat oppgave tørk for å transportere bort overflødig væske fra testiklene. Fjern så mye væske som mulig.
  3. Påfør en 30–50 μL dråpe mikroskopimonteringsmedium på testiklene.
  4. Plasser en 22 mm dekselslip på dråpeav monteringsmediet og la dekselet slå seg til ro og monteringsmediet spre seg under dekseletslip. Påfør mildt trykk på dekkslip om nødvendig for å klemme ut overflødig monteringsmedium og la dekkslipen hvile på overflaten av testiklene.
  5. Bruk neglelakk til å forsegle kantene på trekkslip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når denne protokollen utføres, vil testiklene forbli helt intakte for avbildning av konfokal mikroskopi eller andre fluorescensmikroskopimetoder. Som sett i figur 3A, er den cellulære organiseringen av testiklene bevart, og utviklingen av celledifferensiering fra den ene enden av testis til den andre, inkludert spermatogoni, spermatocytter og haploid spermatids er synlig. GFP-tubulin er en nyttig markør for å identifisere skille spermatocytter og for levende avbildning av utviklingen av cellene gjennom meiose. Som vist i figur 3B, spermatocytes om start meiosis kan identifiseres av sine to fremtredende microtubule asters. Ved metafase er de store meiotiske spindlene vakkert merket av GFP-tubulin (Figur 3C).

Drosophila spermatocytes store størrelse og deres relative langsom progresjon gjennom meiose gjør dem ideelle for analyse av dynamikken og omorganiseringen av cellulære komponenter som cytoplasmatiske organeller under celledeling8,,11,21. Figur 4 og Video 1 viser live imaging analyse av den dynamiske omorganiseringen av endoplasmic reticulum (ER) med hensyn til mikrotubuli gjennom løpet av meiose. Som beskrevet ovenfor, i sen interfase like før utbruddet av meiose, er to centrosomer som ligger ved cortex av cellen tydelig synlig av GFP-tubulin fluorescens. På dette stadiet avslører ER-målrettet RFP (RFP-KDEL) fluorescens at ER er jevnt fordelt gjennom cytoplasma. Centrosomes begynner deretter å migrere til motsatte sider av atomkonvolutten for å etablere de to spindelpolene. I løpet av denne tiden akkumuleres ER raskt rundt centrosomale mikrotubuli og blir gradvis ryddet fra resten av cytoplasma. Kjernefysisk konvoluttsammenbrudd (NEB) avsløres av utseendet til GFP-tubulinfluorescens i atomregionen. Det bør bemerkes at Drosophila celler dele med semi-åpen mitose eller meiosis, noe som betyr at kjernefysiske konvoluttkomponenter bryte ned og spre og store cytoplasmatiske molekyler inn i kjernefysisk eviomregionen, men en konvolutt av ER-avledede membraner omgir spindel og kromatider gjennom celledivisjon22,,23,24. Ved tidspunktet for NEB og utvikler seg gjennom metafasen, er ER nesten helt forbundet med astralmikrotubuli som omgir de to spindelpolcentrolittene. Disse to astral mikrotubule akkumuleringer av ER deretter partisjon til de to dattercellene i anaphase, noe som sikrer riktig ER arv av de nydannede cellene8,11.

Figur 5 viser effekten av testis brudd på levende avbildning av spermatocytter. Som beskrevet i protokollen, må det tas stor forsiktighet for ikke å senke dekkseddelen for langt på overflaten av testiklene under monteringstrinnene, da dette vil legge press på testiklene og føre til at de sprekker. Som sett i figur 5 og video 2,strømmer cyster av spermatocytter raskt ut av de ødelagte testis, og denne bevegelsen av cellene gjør live, time-lapse imaging ekstremt vanskelig.

Figure 1
Figur 1: Verktøy som kreves for vellykket disseksjon. (A) Tang som brukes til disseksjon må være rett og ha skarpe, ubrutte tips (indikert med grønt merke). Ikke bruk tang med bøyde eller ødelagte tips (røde X-merker), da de vil være ineffektive til å gripe larver og erte fra hverandre vev. (B) For å forberede skalpellverktøyet, bøy en svart anodisert stålinsektpinne til en intern vinkel på ca. 135°. Det skarpe punktet brukes som en kniv for å skjære gjennom vev, og den rette kanten brukes til å flytte vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Identifikasjon av larve- og pupaltestikler. (A) Bilder av mannlige og kvinnelige larver. Testiklene er identifiserbare i hannen som de sirkulære eller ovale gjennomsiktige strukturene i den bakre tredjedelen av dyret (pilhode). Legg merke til mangelen på en lignende struktur i kvinnen. (B) Bilde av en tidlig mannlig pupa, med de to gjennomsiktige testiklene indikert av pilspisser. (C) Testiklene med vedlagte fettlegemer etter disseksjon. De to testiklene til venstre har overdreven fett kropper fortsatt festet som må trimmes bort. De to testiklene til høyre har blitt riktig trimmet av sine fettkropper og er klare for bildebehandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Identifisering av meiotiske spermatocytter i en vellykket forberedt testis. (A) Confocal bilde av en vellykket forberedt live, intakt testis uttrykker GFP-tubulin. Navet av stamceller er plassert mot den nedre spissen av testis, selv om det ikke er identifiserbart i dette preparatet. Flere lag med små spermatogonier er indikert, og disse etterfølges av mange cyster av spermatocytter. En cyste av spermatocytter i den første meiotiske divisjonen er identifiserbar basert på den store størrelsen på cellene (ca. 20 – 30 μm i diameter) og tilstedeværelse av GFP-tubulin merket meiotiske spindler. Spermatocytes i den andre meiotiske divisjonen har på samme måte spindler, men disse cellene er omtrent halvparten av størrelsen meiosis jeg celler. Post-meiotic spermatids er også synlige, som er langstrakt spermatozoa. (B) Spermatocytes som vil begynne meiosis innen 30 - 60 min kan identifiseres av sine to store, svært lyse mikrotubule asters (indikert med pilhoder) merket av GFP-tubulin. Cysten av pre-meiotiske celler er avgrenset av den stiplede gule linjen. (C) Celler i meiosis er identifiserbare av sine store meiotiske spindler som lett visualiseres med GFP-tubulin. Cysten av meiotiske celler er avgrenset av den stiplede gule linjen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Tidsforløpsavbildning av meiose i en enkelt spermatocytter. En enkelt spermatocyte co-uttrykkende GFP-tubulin og RFP rettet mot ER (RFP-KDEL) ble avbildet hvert andre minutt gjennom løpet av meiose. Vist er representative bilder av spermatocyte på bestemte stadier av meiose, begynner i sen interphase og utvikler seg gjennom telophase. Tidene er i løpet av minutter. Hvert bilde er et enkelt optisk plan fra en stabel med femten optiske skiver kjøpt på hvert tidspunkt. Dette tallet ble endret fra Karabasheva og Smyth, 20198. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative bilder av en test is før og etter rupturing. Bildet til venstre, merket "Intakt", viser en GFP-tubulin uttrykker testis like før rupturing. Bildet til høyre viser de samme testis etter rupturing. Cyster av spermatocytter kan sees streaming ut av sprukket testis. Pilhodene indikerer en cyste av meiotiske spermatocytter; legg merke til den betydelige bevegelsen av disse spermatocytter etter testis brudd, noe som gjør imaging disse spermatocytes over tid ekstremt utfordrende. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Full meiotisk deling av en enkelt spermatocyte. Vist er fulltid-bortfall av GFP-tubulin og RFP-KDEL uttrykker spermatocyte i figur 4. Bilder ble tatt hvert annet minutt, og avspillingshastigheten er tre bilder per sekund. Denne videoen ble endret fra Karabasheva og Smyth, 20198. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Sprukket testis. Time-lapse av en testis før og etter rupturing. Bruddet er tydelig på grunn av plutselig streaming av cyster av celler gjennom nedre venstre hjørne av testis. Bilder ble tatt hvert annet minutt, og avspillingshastigheten er tre bilder per sekund. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en protokoll for fremstilling av larval eller tidlig pupal Drosophila testiklene, optimalisert for langsiktig, levende avbildning av spermatocyte celledeling. Dette er en kraftig metode for analyse av celledeling i den fysiologiske konteksten av intakt vev. Kraften i denne metoden utvides ytterligere når den kombineres med drosofilgenetiske verktøy, for eksempel spesifikke genmutasjoner, vevsspesifikk RNAi-mediert undertrykkelse og fluorescerende merkede protein- og organellemarkører. I tillegg gjør den lille størrelsen på larval og pupal testikle, og evnen til å bildedele celler svært nær glassdekselet, metoden ideell for høyoppløselig bildebehandling, inkludert superoppløsningstilnærminger. Allsidigheten til dette eksperimentelle systemet er demonstrert av de representative resultatene som beskriver den dynamiske omorganiseringen av ER under celledeling. Drosophila spermatocytes er spesielt nyttig for en slik analyse av organelle dynamikk under celledeling på grunn av disse cellenes store størrelse og relativt langsom transitt gjennom meiose. Videre kan de samme cellene avbildes post-meiotically for å forstå hvordan endringer i organelledynamikk eller celledelingsmekanismer påvirker etterfølgende hendelser av spermatogenese. Dermed er det stort potensial med denne eksperimentelle tilnærmingen til å forstå fysiologien til celledeling innenfor større sammenheng med vevsutvikling og celledifferensiering, resultater som er uoppnåelige når du studerer celler dyrket i kultur.

Protokollen inneholder flere elementer som letter den langsiktige ex vivo kulturen av testikler i opptil ca 24 timer. For det første inneholder Schneiders medier, som ble utviklet for vedlikehold av drosofilvevskulturceller, lett tilgjengelige energikilder og er optimalisert for å opprettholde fysiologisk pH i atmosfærisk luft. For det andre gir den gassgjennomtrengelige membranen som brukes til montering av testikler, rask gassutveksling. En viktig fordel med langsiktig kultur er at hvis celler på ønsket utviklingsstadium eller meiose ikke finnes umiddelbart etter prøveforberedelse, kan prøven lagres og avbildet igjen på et senere tidspunkt. Vi har bekreftet at testiklene som vedlikeholdes i en 25 °C inkubator over natten, i totalt 16-24 timer, er levedyktige og ser friske ut basert på rutinemessig tilstedeværelse av celler som aktivt gjennomgår meiose og utvikler seg gjennom senere stadier av spermdifferensiering. Forholdsregler bør imidlertid tas når du tar i testikler i mer enn 2-3 timer for å sikre at vevsfysiologi ikke påvirkes negativt. Viktigst, testiklene fortsetter å vokse i kultur som celler spre og modning sperm elongate. Dette kan føre til at testiklene forstørres til det punktet at de brister på grunn av det restriktive rommet mellom membranen og dekkseddelen, noe som gjør testiklene uegnet for live bildebehandling av grunner som er beskrevet nedenfor. I tillegg, hvis langsiktige kulturer skal rutinemessig brukes i eksperimenter, er det tilrådelig å teste om laboratoriespesifikke utvidede kulturforhold resulterer i meiotiske abnormiteter som langvarigme meiotiske varigheter eller økte frekvenser av lagging kromosomer eller cytokinesesvikt.

For å bilde enkeltceller over lange tidskurs, er det viktig at cellene ikke beveger seg betydelig når de forberedte testiklene er på mikroskopstadiet. Dermed er det viktig når du utfører protokollen at testiklene forblir intakte og uskadet, fordi celler søler ut av skadede testikler og alle cellene i orgelet beveger seg som et resultat (se figur 5 og video 2). Det kan fortsatt være mulig å bilde spermatocytes i skadede testikler hvis cellene til slutt bosette seg og slutte å bevege seg, men når dette skjer stadier av meiosis som man har til hensikt å analysere kan allerede ha skjedd. I tillegg kan effekten av vevsskader på selve celledelingsprosessen diskonteres. Skade på testiklene kan oppstå når du fjerner fettlegemer etter fjerning av testiklene fra larver. Det må derfor utvises stor forsiktighet for å unngå piercing eller tugging på organene i løpet av dette trinnet av protokollen. Faktisk er det ofte ikke nødvendig å fjerne veldig mye av fettlegemene, så lenge de ikke skjuler visualisering av testis. Oftere er testisskade et resultat av å fjerne for mye kulturmedium etter plassering av dekkseddelen under monteringsprosedyren for live imaging (trinn 3.6). Når mediet fjernes, faller dekksklien lavere og utøver press på testiklene, og overtrykk vil føre til at testiklene brister. Dermed, mens det er viktig for coverslip å være så nær testiklene for å lette optimal avbildning av spermatocytes, noen praksis er nødvendig for å unngå å fjerne for mye medium og senke coverslip for langt. Det er også nyttig å påpeke at for noen applikasjoner, for eksempel akutt eksponering av spermatocytter til narkotika eller andre små molekyler, kan det være en fordel å forstyrre testiklene og spre cyster av spermatocytter for analyse. Flere gode protokoller er tilgjengelige for forberedelse og kultur av dispergert spermatocyte cyster18,25.

En viktig vurdering når du bruker spermatocytes for celledeling analyse er at disse cellene utfører meiotic i motsetning til mitotiske divisjoner. Viktigere, mange av de viktigste aspektene ved celledeling mekanikk, som spindel arkitektur og cytokinese, er lik mellom mannlig meiosis og mitose6. Dermed kan mekanistisk innsikt samlet fra å studere spermatocyte meiose, være bredt anvendelig for generelle mekanismer for dyrecelledeling7. Men, avhengig av mekanistiske spørsmål som blir adressert, kan viktige forskjeller mellom spermatocytter og mitotiske celler i prosesser som kromosomdynamikk og cellesyklusregulering må betraktessom 26. Samtidig presenterer Drosophila spermatocytes den unike muligheten til å sammenligne mitotiske og meiotiske celler innenfor samme vev og germline avstamning. For eksempel kan det samme testispreparatet brukes til å analysere kimske stamceller eller spermatogoni som gjennomgår mitose og spermatocytter som gjennomgår meiose. Vi prøver vanligvis ikke å bilde germline stamcelle eller spermatogoniale mitoses i live testis preparater fordi tidspunktet for disse divisjonene er vanskelig å forutsi. Vi har imidlertid fortuitously fanget disse divisjonene i våre eksperimenter, viser at den generelle protokollen kan brukes til analyse av mitotiske celler i testiklene også.

Metodikken som presenteres fokuserer på testis forberedelse for levende avbildning av spermatocyte meiosis, da dette gir mulighet for sanntidsanalyse av cellulær og molekylær dynamikk. Vi tilbyr også en metode for fiksering og immunfarging av intakte testikler, da denne tilnærmingen kan være å foretrekke hvis nødvendig fluorescerende merkede uttrykkskonstruksjoner ikke er tilgjengelige eller for å unngå forvirrende effekter av proteinoveruttrykk. En viktig vurdering er imidlertid at fiksering ikke alltid trofast bevare innfødt vev og cellulær arkitektur. For eksempel har vi og andre funnet ut at fiksering ofte resulterer i fragmentering eller forstyrrelse av ER11,27. Noen av disse problemene kan lindres ved hjelp av forskjellige fikseringsmetoder eller vevsforberedelsesmetoder, og noen feilsøking kan derfor være nødvendig for å identifisere den optimale fikseringsprotokollen for bevaring av en bestemt cellekomponent eller proteinorganisasjon. Heldigvis, en rekke ekstra protokoller for Drosophila spermatocyte fiksering er også tilgjengelig18,28,29.

Til slutt har vi beskrevet allsidige metoder for fremstilling av Drosophila testiklene for levende og fast celleanalyse av spermatocyte meiose. Spesifikke styrker av denne eksperimentelle tilnærmingen inkluderer analyse av celledeling i intakt vev, høyoppløselig avbildning av store celler og integrasjon med Drosophila genetiske verktøy. Eksperimenter som benytter metodikken har potensial til å gi viktige bidrag til vår forståelse av hvordan celledeling integreres med komplekse mekanismer for vevsutvikling og homeostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementets oppstartsmidler til J.T.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294, (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131, (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291, (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14, (4), 111 (2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69, (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9, (1), 12456 (2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187, (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2, (1), 8 (2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5, (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68, (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10, (12), 1001460 (2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20, (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125, (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94, (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19, (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190, (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (1), 102-104 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics