Dissection z larw CNS na Drosophila melanogaster

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie ośrodkowego układu nerwowego z państw larw Drosophila stadium.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hafer, N., Schedl, P. Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (1), e85, doi:10.3791/85 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ośrodkowego układu nerwowego (CNS) larw Drosophila jest złożone i słabo rozumiane. Jednym ze sposobów zbadania CNS jest użycie immunohistochemiczne badanie ekspresji różnych powieści i białka znacznika. Barwienie całego larw jest niepraktyczne, ponieważ twardy naskórek zapobiega przenikaniu przeciwciał wewnątrz jamy ciała. W celu plamy tych tkanek należy wnikliwie zwierząt przed układaniem i przebarwienia. W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie larwy muszki owocowej bez uszkodzenia OUN. Zacznij od rozdarcia larwa na pół parę drobnych szczypiec, a następnie włącz naskórka "inside-out", aby odsłonić CNS. Jeśli rozwarstwienie jest wykonywane dokładnie CNS pozostanie podłączony do naskórka. Zwykle utrzymanie CNS dołączone do naskórka na całym utrwalania i barwienia kroki i tylko całkowicie usunąć CNS z naskórka tuż przed zamontowaniem próbki na szkiełku. Pokazujemy także kilka reprezentatywnych obrazów larw CNS barwione z Ewą, czynnik transkrypcyjny wyrażone w podgrupie neuronów w OUN. Artykuł kończy się omówieniem niektórych praktycznych zastosowań tej techniki i potencjalne trudności, które mogą powstać.

Protocol

  1. Dissect 3 larwy III stadium, pozostawiając CNS dołączone do naskórka. Miejsce w 1,5 ml probówce.
  2. Fix w PBS (1x) zawierający 2% formaldehydu do 40 min z biegunach. ; Użyj 250ul za co 5-10 CNS rozcięta.
  3. Usuń formaldehydu i krótko przemyć 3 razy PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Użyj drobno wyciągnął pipety Pasteura, aby uniknąć utraty tkanki.
  4. Blok niespecyficzne białka wiążącego strony i permeabilize błon komórkowych przez inkubację tkanki 08/01 godzin w PBST + 5% BSA, kołysanie w temperaturze 4 ° C.
  5. Inkubować w pierwszym przeciwciałem rozcieńczony w PBST + 5% BSA kołysanie w temperaturze 4 ° C przez noc. Optymalnego rozcieńczenia przeciwciał będzie różny dla różnych przeciwciał.
  6. Spłukać 3x w PBST przez dwie 30min zmywa w temperaturze 4 ° C.
  7. Inkubować w drugim przeciwciałem rozcieńczony w PBST + 5% BSA na 1-3 godziny kołysania w 4 ° C. Spłukać 3x w PBST przez dwie 30min zmywa w temperaturze 4 ° C. Jeśli drugi jest sprzężony wrażliwy na światło związek, zawinąć w folię aluminiową rurę.
  8. Dissect tkanki dalej (w razie potrzeby) i zamontować na slajdach.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ten film pokazuje, jak wnikliwie CNS z państw larw Drosophila stadium. Po sekcji zwłok, OUN może być barwiony przy użyciu standardowego protokołu immunohistochemiczne. Obecnie wiele jest jeszcze znany, jak dla dorosłych układu nerwowego jest generowany, a także w jaki sposób przechowuje i przesyła informacje. Badania rozwoju Drosophila CNS larwy powinny poszerzyć naszą wiedzę na okablowanie systemu nerwowego i funkcji.

Larw Drosophila wykazują szereg stereotpyed zachowania, takie jak reakcja na bodźce środowiska. Jak dowiedział się tych zachowań i przechowywane w układzie nerwowym? Badania układu nerwowego w trakcie rozwoju larwalnego pomoże odpowiedzieć na to pytanie.

Na tym etapie rozwoju Drosophila, organizm przygotowuje się do poddania się ogromne zmiany morfologiczne, które występują podczas przepoczwarzenie. W tym czasie ogromne przebudowy układu nerwowo-mięśniowego występuje jako organsim przejścia z maggot wpełza dorosłych latać. To będzie interesujące, aby określić jak neurony zmiany na tym etapie rozwoju, a jeśli ten sam typ zachowania można zaobserwować w neuronach wyższych zwierząt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Forceps fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.

Comments

1 Comment

  1. The justification/ultimate goals are poorly explained. How dŒs the presence of a protein show function?

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 6:36 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics