Dezellularisierung von Mammary Fat Pads: Ableiten von extrazellulären Matrix-Hydrogelen von Mammary Fat Pads

Legen Sie zunächst Brustfettpolster oder MFPs in eine Schüssel mit Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie für die gewünschte Dauer, um die Zellmatrix-Adhäsionen zu brechen. Waschen Sie die MFPs mit entionisiertem Wasser und belasten Sie sie mit einem Sieb. Gewebe in einen Becher mit Rührstange geben und Triton X-100 hinzufügen. Rühren Sie zu Lysezellen, ohne die Wachstumsfaktoren in der extrazellulären Matrix des Gewebes zu beeinflussen.

Die MFPs abseihen und mit entionisiertem Wasser abspülen. Übertragen Sie Gewebe zurück in den Becher, und fügen Sie Desoxycholsäure, um die verbleibenden Zellen zu lyse. Als nächstes die MFPs abseihen und in einen Becher geben, der entionisiertes Wasser mit Penicillin-Streptomycin enthält, um eine Kontamination zu verhindern. Bebrüte den Becher bei 4 Grad Celsius über Nacht.

MfPs belasten und in ein Becherglas geben, das Ethanol und Peressigsäure enthält. Die Peressigsäure erhöht die Steifigkeit der extrazellulären Matrix des Gewebes. Rühren Sie für einige Zeit und wiederholen Sie den anstrengenden Schritt. Waschen Sie die MFPs mit PBS und dann mit entionisiertem Wasser. Übertragen Sie die gespannten MFPs auf einen Becher, der Propan-1-ol enthält.

Rühren Sie für einige Zeit, belasten Sie den Inhalt, und waschen MFPs mit entionisiertem Wasser. Trocknen Sie die MFPs und lagern Sie bei minus 80 Grad Celsius. Im folgenden Protokoll führen wir die Dezellularisierung von murinen Brustfettpolstern durch.

Legen Sie zunächst die MFPs in sechs Zentimeter große Gerichte mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA-Lösung. Die Teller mit 70% Ethanol besprühen und abwischen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius brüten. Verwenden Sie 0,7-Millimeter-Siebe, um die MFPs mit entionisiertem Wasser zu waschen, indem Sie dreimal Wasser über das Gewebe gießen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Wärten manuell zu massieren.

Als nächstes trocknen Sie das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen. Legen Sie das getrocknete Gewebe in einen vorautoklavierten Becher, der einen entsprechend großen Rührstab enthält, und bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 3% t-Octylphenoxy polyethoxyethanol pro Gramm Gewebe. Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Dann entsorgen Sie den Becherinhalt in ein Sieb.

Spülen Sie den Becher mit entionisiertem Wasser und gießen Sie es auf das Gewebe. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren. Danach das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Legen Sie die Gewebe und die Rührstäbe wieder in die gleichen Becher und bedecken Sie sie mit 60 Millilitern 4% Desoxycholsäure pro Gramm Gewebe. Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren.

Als Nächstes dumpen Sie den Inhalt des Bechers in ein Netzsieb. Spülen Sie den Becher mit entionisiertem Wasser und gießen Sie es auf das Gewebe. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren. Das spülende Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und abwischen.

Legen Sie die getrockneten Gewebe in das gleiche Becherglas zusammen mit frischem deionisiertem Wasser, ergänzt mit 1% Penicillin Streptomycin. Den Becher fest mit Paraffinfolie bedecken und bei 4 Grad Celsius über Nacht verlassen. Am nächsten Tag den Becherinhalt in ein Sieb abtropfen lassen. Trocknen Sie das Gewebe bei einer heiklen Aufgabe kurz abwischen und wiegen. Legen Sie dann die MFPs in den gleichen Becher mit einer entsprechenden Rührstange.

Bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern einer Lösung, die 4% Ethanol und 0,1% Peressigsäure pro Gramm Gewebe enthält. Bei Raumtemperatur zwei Stunden rühren. Den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb zu werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren und den Inhalt wieder in den Becher zu legen. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Millilitern 1X PBS pro Gramm Gewebe bedecken.

15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal. Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb. Mit Zangen das Gewebe manuell massieren und den Inhalt wieder in den Becher legen. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.

15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal. Das gewaschene Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Dump das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher und bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern von 100% n-Propanol pro Gramm Gewebe.

Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Dann trocknen Sie das Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen Sie es. Dump das Gewebe und den Inhalt in ein 0,7-Millimeter-Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in das Becherglas und waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.

15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal. Danach das Gewebe bei einer heiklen Aufgabe kurz trocknen und abwischen. Übertragen Sie das Gewebe in eine beschriftete 15-Milliliter-Röhre und frieren Sie bei negativen 80 Grad Celsius über Nacht ein.