Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Først legger du mammaryfettputer eller MFPer i en tallerken med Trypsin-EDTA-løsning og inkuberer i ønsket varighet for å bryte cellematriseadhesjonene. Vask MFP-ene med deionisert vann og spenne gjennom en sil. Legg vev i et beger med en rørestang og tilsett Triton X-100. Rør til lyse celler uten å påvirke vekstfaktorene i vevets ekstracellulære matrise.
Sil MFP-ene og skyll med deionisert vann. Overfør vev tilbake til begeret, og tilsett deoksykolsyre for å lyse de resterende cellene. Deretter spenne MFPs og plasser i et beger som inneholder deionisert vann med penicillin-streptomycin for å forhindre forurensning. Inkuber begeret ved 4 grader Celsius over natten.
Sil MFPer og legg dem i et beger som inneholder etanol og peracetic acid. Den peracetic syre øker stivheten i vevets ekstracellulære matrise. Rør en stund og gjenta anstrengelsestrinnet. Vask MFP-ene med PBS og deretter med deionisert vann. Overfør de anstrengte MFPs til et beger som inneholder propan-1-ol.
Rør i noen tid, spenne innholdet og vask MFPer med deionisert vann. Tørk MFP-ene og lagre på minus 80 grader Celsius. I følgende protokoll vil vi utføre decellularisering av murinpattedyrfettputer.
Først plasserer du MFPs i seks centimeter retter med fem milliliter Trypsin-EDTA-løsning. Spray og tørk oppvasken med 70% etanol og inkuber ved 37 grader Celsius i en time. Bruk 0,7 millimeter siler til å vaske MFPs med deionisert vann ved å helle vann over vevet tre ganger. Bruk tang til å massere vevet manuelt mellom vaskene.
Tørk deretter vevet kort på en delikat oppgaveserviett og vei det. Legg det tørkede vevet i et pre-autoklavert beger som inneholder en passende størrelse rørestang, og dekk vevet med 60 milliliter 3% t-octylphenoxy polyetoksyetanol per gram vev. Rør i en time ved romtemperatur. Dump deretter begerinnholdet i en sil.
Skyll begeret med deionisert vann og hell dette på vevet. Gjenta denne skylleprosessen to ganger til, og sørg for å bruke tang til å massere vevet manuelt mellom skyllinger. Etter dette tørker du kort vevet på en delikat oppgaveserviett og veier. Plasser vevet og rørestengene tilbake i de samme begerene og dekk dem med 60 milliliter 4% deoksykolsyre per gram vev. Rør ved romtemperatur i en time.
Deretter dumper du begerets innhold i en maskesil. Skyll begeret med deionisert vann og hell dette på vevet. Gjenta denne skylleprosessen to ganger til, og sørg for å bruke tang til å massere vevet manuelt mellom skyllinger. Tørk kort det skyllede vevet på en delikat oppgaveserviett og vei det.
Legg det tørkede vevet i samme beger sammen med ferskt deionisert vann supplert med 1% penicillin streptomycin. Dekk begeret tett med parafinfilm og la det stå på 4 grader Celsius over natten. Neste dag drenerer du begerinnholdet i en sil. Tørk kort vevet på en delikat oppgaveserviett og vei det. Plasser deretter MFP-ene i samme beger med en passende størrelse rørestang.
Dekk vevet med 60 milliliter av en løsning som inneholder 4% etanol og 0,1% peratisk syre per gram vev. Rør ved romtemperatur i to timer. Dump begerets innhold i en 0,7 millimeter sil. Bruk tang til å massere vevet manuelt og plassere innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 milliliter 1X PBS per gram vev.
Rør ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta hele vaskeprosessen en gang til. Deretter dumper du begerets innhold i en 0,7 millimeter sil. Bruk tang, masser vevet manuelt og legg innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 milliliter deionisert vann per gram vev.
Rør ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta hele vaskeprosessen en gang til. Tørk kort det vaskede vevet på en delikat oppgaveserviett og vei det. Dump vevet og innholdet i en sil og bruk tang til å massere vevet manuelt. Legg innholdet tilbake i begeret og dekk vevet med 60 milliliter 100% n-propanol per gram vev.
Rør ved romtemperatur i en time. Tørk deretter vevet kort på en delikat oppgaveserviett og vei det. Dump vevet og innholdet i en 0,7 millimeter sil og bruk tang til å massere vevet manuelt. Legg innholdet tilbake i begeret og vask vevet ved å dekke det med 60 milliliter deionisert vann per gram vev.
Rør ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta denne vaskeprosessen tre ganger. Etter dette tørker du kort vevet på en delikat oppgaveserviett og veier det. Overfør vevet til et merket 15 milliliterrør og frys ved negative 80 grader Celsius over natten.
