Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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Transcript
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Primeiro, coloque almofadas de gordura mamária ou MFPs em um prato com solução Trypsin-EDTA e incubar para a duração desejada para quebrar as aderências da matriz celular. Lave os MFPs com água deionizada e coe através de um coador. Coloque os tecidos em um béquer com uma barra de mexida e adicione Triton X-100. Mexa para as células de lise sem afetar os fatores de crescimento na matriz extracelular do tecido.
Coe os MFPs e enxágue com água deionizada. Transfira os tecidos de volta para o béquer, e adicione ácido desoxicólico para lise as células restantes. Em seguida, coe os MFPs e coloque em um béquer contendo água deionizada com penicilina-estreptomicina para evitar contaminação. Incubar o béquer a 4 graus Celsius durante a noite.
Coe os MFPs e coloque-os em um béquer contendo etanol e ácido peracético. O ácido peracético aumenta a rigidez da matriz extracelular do tecido. Mexa por algum tempo e repita o passo de tensão. Lave os MFPs com PBS e depois com água deionizada. Transfira os MFPs tensos para um béquer contendo propano-1-ol.
Mexa por algum tempo, coe o conteúdo e lave os MFPs com água deionizada. Seque os MFPs e armazene a menos 80 graus Celsius. No protocolo a seguir, realizaremos a descelularização das almofadas de gordura mamária murina.
Primeiro, coloque os MFPs em pratos de seis centímetros com cinco mililitros de solução Trypsin-EDTA. Pulverize e limpe os pratos com 70% de etanol e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Use 0,7 milímetros de cepas para lavar os MFPs com água desionizada despejando água sobre o tecido três vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as lavagens.
Em seguida, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Coloque os tecidos secos em um béquer pré-autoclaved contendo uma barra de agitação de tamanho apropriado, e cubra os tecidos com 60 mililitros de 3% t-octilphenoxy poliexitoetanol por grama de tecido. Mexa por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, despeje o conteúdo dos béquers em um coador.
Enxágüe o béquer com água deionizada e despeje isso nos tecidos. Repita este processo de lavagem mais duas vezes, certificando-se de usar fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues. Depois disso, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese. Coloque os tecidos e as barras de mexida de volta nos mesmos béquers e cubra-os com 60 mililitros de ácido desoxicólico de 4% por grama de tecido. Mexa em temperatura ambiente por uma hora.
Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador de malha. Enxágüe o béquer com água deionizada e despeje isso nos tecidos. Repita este processo de lavagem mais duas vezes, certificando-se de usar fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues. Seque brevemente o tecido enxaguado em uma tarefa delicada limpe e pese-o.
Coloque os tecidos secos no mesmo béquer junto com água deionizada fresca suplementada com estreptomicina de penicilina de 1%. Cubra o béquer firmemente com filme de parafina e saia a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, drene o conteúdo do béquer em um coador. Seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Em seguida, coloque os MFPs no mesmo béquer com uma barra de agitação de tamanho apropriado.
Cubra o tecido com 60 mililitros de uma solução contendo 4% de etanol e 0,1% de ácido peracético por grama de tecido. Mexa em temperatura ambiente por duas horas. Despeje o conteúdo do béquer em um coador de 0,7 milímetros. Use fórceps para massagear manualmente o tecido e colocar o conteúdo de volta no béquer. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de 1X PBS por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita todo esse processo de lavagem mais uma vez. Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador de 0,7 milímetros. Usando fórceps, massageie manualmente o tecido e coloque o conteúdo de volta no béquer. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de água deionizada por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita todo esse processo de lavagem mais uma vez. Seque brevemente o tecido lavado em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Despeje o tecido e o conteúdo em um coador e use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer e cubra os tecidos com 60 mililitros de 100% n-propanol por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Despeje o tecido e o conteúdo em um coador de 0,7 milímetros e use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer e lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de água deionizada por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita este processo de lavagem três vezes. Depois disso, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Transfira o tecido para um tubo de 15 mililitros rotulado e congele a 80 graus Celsius negativos durante a noite.
