Avcellulariserande fettkuddar från mammary: Härleda extracellulära matrishydrogeler från mammary fettkuddar

Placera först bröstfettkuddar eller MFPs i en maträtt med Trypsin-EDTA-lösning och inkubera under önskad tid för att bryta cellmatrisens vidhäftningar. Tvätta MFPs med avjoniserat vatten och spänna genom en sil. Placera vävnader i en bägare med en omrörstång och tillsätt Triton X-100. Rör om till lysceller utan att påverka tillväxtfaktorerna i vävnadens extracellulära matris.

Sila av MFP:erna och skölj med avjoniserat vatten. Överför vävnader tillbaka till bägaren och tillsätt deoxykolsyra för att lysa de återstående cellerna. Därefter spänna MFPs och placera i en bägare som innehåller avjoniserat vatten med penicillin-streptomycin för att förhindra förorening. Inkubera bägaren vid 4 grader Celsius över natten.

Sila MFPs och placera dem i en bägare som innehåller etanol och peracetsyra. Peracetic syran ökar styvheten i vävnadens extracellulära matris. Rör om en tid och upprepa belastningssteget. Tvätta MFPs med PBS och sedan med avjoniserat vatten. Överför de ansträngda MFP:erna till en bägare som innehåller propan-1-ol.

Rör om en tid, spänn innehållet och tvätta MFPs med avjoniserat vatten. Torka MFPs och lagra på minus 80 grader Celsius. I följande protokoll kommer vi att utföra avcellulering av murin bröst fettkuddar.

Placera först MFPs i sex centimeter rätter med fem milliliter Trypsin-EDTA-lösning. Spraya och torka disken med 70% etanol och inkubera vid 37 grader Celsius i en timme. Använd 0,7 millimeters silar för att tvätta MFPs med avjoniserat vatten genom att hälla vatten över vävnaden tre gånger. Använd tång för att manuellt massera in vävnaden mellan tvättarna.

Torka sedan kort vävnaden på en delikat uppgiftsservett och väg den. Placera de torkade vävnaderna i en för autoklaverad bägare som innehåller en lämplig omrörningsstång i lämplig storlek och täck vävnaderna med 60 milliliter 3% t-oktylfenoxipolyetoxietanol per gram vävnad. Rör om i en timme i rumstemperatur. Dumpa sedan näbbinnehållet i en sil.

Skölj bägaren med avjoniserat vatten och häll den på vävnaderna. Upprepa sköljningsprocessen ytterligare två gånger och se till att använda tång för att manuellt massera in vävnaden mellan sköljningar. Därefter torkar du kort vävnaden på en delikat uppgiftsservett och väger. Placera vävnaderna och omrörstängerna tillbaka i samma bägare och täck dem med 60 milliliter 4% deoxykolsyra per gram vävnad. Rör om i rumstemperatur i en timme.

Dumpa sedan bägarens innehåll i en nätsil. Skölj bägaren med avjoniserat vatten och häll den på vävnaderna. Upprepa sköljningsprocessen ytterligare två gånger och se till att använda tång för att manuellt massera in vävnaden mellan sköljningar. Torka kort den sköljda vävnaden på en delikat uppgiftsservett och väg den.

Placera de torkade vävnaderna i samma bägare tillsammans med färskt avjoniserat vatten kompletterat med 1% penicillin streptomycin. Täck bägaren tätt med paraffinfilm och lämna vid 4 grader Celsius över natten. Nästa dag, dränera bägarens innehåll i en sil. Torka kort vävnaden på en delikat uppgiftsservett och väg den. Placera sedan MFP:erna i samma bägare med en lämplig omrörningsstång i lämplig storlek.

Täck vävnaden med 60 milliliter av en lösning som innehåller 4% etanol och 0,1% peracetikasyra per gram vävnad. Rör om i rumstemperatur i två timmar. Dumpa bägarens innehåll i en 0,7 millimeters sil. Använd tång för att manuellt massera vävnaden och placera innehållet tillbaka i bägaren. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 milliliter 1X PBS per gram vävnad.

Rör om i rumstemperatur i 15 minuter. Upprepa hela tvättprocessen en gång till. Dumpa sedan bägarens innehåll i en 0,7 millimeters sil. Använd tång, massera manuellt vävnaden och placera innehållet tillbaka i bägaren. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 milliliter avjoniserat vatten per gram vävnad.

Rör om i rumstemperatur i 15 minuter. Upprepa hela tvättprocessen en gång till. Torka kort den tvättade vävnaden på en delikat uppgiftsservett och väg den. Dumpa vävnaden och innehållet i en sil och använd tång för att manuellt massera vävnaden. Placera tillbaka innehållet i bägaren och täck vävnaderna med 60 milliliter 100% n-propanol per gram vävnad.

Rör om i rumstemperatur i en timme. Torka sedan kort vävnaden på en delikat uppgiftsservett och väg den. Dumpa vävnaden och innehållet i en 0,7 millimeters sil och använd tång för att manuellt massera vävnaden. Placera tillbaka innehållet i bägaren och tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 milliliter avjoniserat vatten per gram vävnad.

Rör om i rumstemperatur i 15 minuter. Upprepa denna tvättprocess tre gånger. Därefter torkar du kort vävnaden på en delikat uppgiftsservett och väger den. Överför vävnaden till ett märkt 15 milliliterrör och frys vid negativa 80 grader Celsius över natten.