Tamponi grassi mammari decellulari: derivazione di idrogel a matrice extracellulare da cuscinetti grassi mammari

Overview

Questo video descrive una tecnica di derivazione degli idrogel a matrice extracellulare decellularizzando i cuscinetti di grasso mammario murino a seguito dell'irradiazione ex vivo per studi in vitro. Questo idrogel aiuta a imitare l'ambiente del tessuto mammario in vivo dopo il trattamento con radiazioni per studiare il comportamento delle cellule tumorali.

Protocol

1. Decellularizzazione

NOTA: Questa procedura è stata adattata da metodi precedentemente pubblicati incentrati sulla decellularizzazione adiposa, che includeva il detergente ionico deossicolato di sodio piuttosto che il solfato di dodecil di sodio per rimuovere il DNA in modo efficiente.

1. Il primo giorno,rimuovere i cuscinetti di grasso mammario congelato o gli MFP da -80 °C e scongelare a temperatura ambiente.
2. Una volta scongelati, asciugare brevemente gli MFP su una delicata salvietta per compiti. Pesare gli MFP utilizzando una bilancia analitica.
3. Utilizzando un paio di forcelle con forbici o bisturi, dividere il tessuto in campioni da 3 mm x 3 mm x 3 mm per lo studio dell'ECM intatto e del tessuto rimanente per la produzione di idrogel.
   NOTA: Il numero di campioni dipende dal numero di metodi di prova, ad esempio la raccolta di due campioni è descritta qui di seguito: uno per l'incorporamento di paraffina (fase 1.5) e uno per il congelamento nel mezzo di incorporamento criostato, se lo si desidera (vedere la tabella dei materiali e il passaggio 1.6).
4. Pesare i tessuti. Se si incorpora nella paraffina per il sessatura, continuare al passaggio 1.5. Se si congela nel supporto di incorporamento del criostato per il sessamento, continuare al passaggio 1.6.
5. In una cappa chimica, immergere il tessuto in formalina tamponata neutra al 10% (NBF) (vedi tabella dei materiali)per 24 ore a 4 °C. Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno. Immergere il tessuto in saccarosio al 30% per 48 ore a 4 °C.
   1. Pesare il tessuto ora che questo pezzo è stato rimosso. Continuare al passaggio 1.6.
6. In una cappa chimica, posizionare i pezzi MFP in una cassetta etichettata predisposta con un supporto di incorporamento criostato. Aggiungere più mezzo di incorporamento criostato per coprire il tessuto.
   1. Posizionare la cassetta in un becher di 2-metilbutano (vedere la tabella dei materiali) prerifuoddato con azoto liquido. Il becher dovrebbe avere abbastanza 2-metilbutano per coprire il fondo ma non abbastanza per immergere la cassetta perché il mezzo di incorporamento criostato non dovrebbe toccare il 2-metilbutano. Lasciare riposare la cassetta nel 2-metilbutano fino a quando il mezzo di incorporamento del criostato si blocca e diventa opaco.
   2. Avvolgere le cassette in un foglio, etichettare e lasciare a -80 °C fino a quando non viene utilizzato per il sessatura.
      NOTA: I tessuti posti immediatamente nel mezzo di incorporamento criostato sono stati sestati a 5 μm mentre i tessuti incubati in saccarosio sono stati sestati a 30 μm per mantenere la morfologia degli adipocite.
7. Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto rimanente.
   NOTA: I pezzi di tessuto possono anche essere collocati in NBF al 10% per 24-48 ore, risciacquati in PBS e lasciati in etanolo al 70% fino all'incorporamento in paraffina. Dopo l'incorporamento, le sezioni da 5 μm possono essere utilizzate per la colorazione dell'ematossilina e dell'eosina (H & E) (vedi sezione 2).
8. Posizionare gli MFP in piatti da 6 cm con soluzione EDTA 5 mL 0,02% trypsina/0,05%. Incubare a 37 °C per 1 h. Spruzzare e pulire i piatti con il 70% di etanolo prima di posizionare nell'incubatrice.
9. Utilizzare filtri da 0,7 mm per lavare gli MFP con acqua deionizzata (DI) versando acqua sul tessuto tre volte. Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto tra un lavaggio e l'altro.
10. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Posizionare i tessuti in un becher pre-autoclavato contenente una barra di agitazione di dimensioni appropriata. Coprire i tessuti con 60 mL di 3% t-ottilfenossipotetossietanolo (vedi tabella dei materiali)per 1 g di tessuto e mescolare per 1 h a temperatura ambiente. Utilizzare un minimo di 20 mL.
11. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino. Risciacquare il becher con acqua DI e versare sui tessuti. Ripeti altre due volte. Utilizzare le fasci per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro.
12. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Riposizionare i tessuti e mescolare le barre negli stessi becher e coprire con 60 mL di acido deossicolico al 4% per 1 g di tessuto. Mescolare per 1 h a temperatura ambiente. Utilizzare un minimo di 20 mL.
13. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino a rete. Risciacquare il becher con acqua DI e versare sui tessuti. Ripeti altre due volte. Utilizzare le fasci per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro.
14. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare.
15. Posizionare i tessuti nello stesso becher con acqua DI fresca integrata con l'1% di penicillina-streptomicina. Coprire saldamente con pellicola di paraffina. Lasciare durante la notte a 4 °C.
16. Lavare filtri e becher per l'uso il giorno successivo.
17. Il giorno 2, scolare il contenuto del becher in un colino. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare.
18. Posizionare gli MFP nello stesso becher con una barra di agitazione di dimensioni appropriata. Coprire con 60 mL 4% di etanolo/0,1% di soluzione di acido peracetico per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 2 ore a temperatura ambiente.
19. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino da 0,7 mm. Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 mL di 1x PBS per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripeti una volta.
20. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino da 0,7 mm. Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 mL di acqua DI per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripeti una volta.
21. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino. Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto.
22. Riposizionare il contenuto nel becher. Coprire tessuti con 60 mL di n-propanolo al 100% per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 1 h a temperatura ambiente.
23. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino da 0,7 mm. Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto.
24. Riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 mL di acqua DI per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripeti tre volte.
25. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino. Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.6 per raccogliere pezzi di tessuto per l'incubazione del saccarosio e il congelamento nel mezzo di incorporamento del criostato.
26. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Posizionare in un tubo etichettato da 15 ml. Congelare a -80 °C durante la notte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5