Tamponi grassi mammari decellulari: derivazione di idrogel a matrice extracellulare da cuscinetti grassi mammari

In primo luogo, posizionare cuscinetti di grasso mammario o MFP in un piatto con soluzione trypsina-EDTA e incubare per la durata desiderata per rompere le aderenze della matrice cellulare. Lavare gli MFP con acqua deionizzata e filtrare attraverso un colino. Posizionare i tessuti in un becher con una barra di agitazione e aggiungere Triton X-100. Mescolare per liscire le cellule senza influire sui fattori di crescita nella matrice extracellulare del tessuto.

Filtrare gli MFP e risciacquare con acqua deionizzata. Trasferire i tessuti al becher e aggiungere acido deossicolico per lese le cellule rimanenti. Successivamente, filtrare gli MFP e posizionare in un bicchiere contenente acqua deionizzata con penicillina-streptomicina per prevenire la contaminazione. Incubare il becher a 4 gradi Celsius durante la notte.

Filtrare gli MFP e metterli in un becher contenente etanolo e acido peracetico. L'acido peracetico aumenta la rigidità della matrice extracellulare del tessuto. Mescolare per qualche tempo e ripetere il passo di sforzo. Lavare gli MFP con PBS e quindi con acqua deionizzata. Trasferire gli MFP vincolati in un becher contenente propano-1-olo.

Mescolare per qualche tempo, filtrare il contenuto e lavare gli MFP con acqua deionizzata. Asciugare gli MFP e conservare a meno 80 gradi Celsius. Nel seguente protocollo, eseguiremo la decellularizzazione dei cuscinetti di grasso mammario murino.

In primo luogo, posizionare gli MFP in piatti di sei centimetri con cinque millilitri di soluzione Trypsin-EDTA. Spruzzare e pulire i piatti con il 70% di etanolo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Utilizzare filtri da 0,7 millimetri per lavare gli MFP con acqua deionizzata versando acqua sul tessuto tre volte. Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto tra un lavaggio e l'altro.

Successivamente, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Mettere i tessuti essiccati in un bicchiere pre-autoclavato contenente una barra di agitazione di dimensioni appropriate e coprire i tessuti con 60 millilitri del 3% di t-ottilfenossi polietossietanolo per grammo di tessuto. Mescolare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, gettare il contenuto dei becher in un colino.

Risciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti. Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Riposizionare i tessuti e le barre di agitazione negli stessi becher e coprirli con 60 millilitri di acido deossicolico al 4% per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino a rete. Risciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti. Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro. Asciugare brevemente il tessuto risciacquato su una delicata salvietta e pesarlo.

Mettere i tessuti essiccati nello stesso becher insieme all'acqua fresca deionizzata integrata con l'1% di streptomicina penicillina. Coprire saldamente il becher con pellicola di paraffina e lasciare a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, scolare il contenuto del becher in un colino. Asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Quindi, posizionare gli MFP nello stesso becher con una barra di agitazione di dimensioni appropriate.

Coprire il tessuto con 60 millilitri di una soluzione contenente il 4% di etanolo e lo 0,1% di acido peracetico per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per due ore. Gettare il contenuto del becher in un colino da 0,7 millimetri. Utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di 1X PBS per grammo di tessuto.

Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta. Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino di 0,7 millimetri. Utilizzando le forcelle, massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.

Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta. Asciugare brevemente il tessuto lavato su una delicata salvietta e pesarlo. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e coprire i tessuti con 60 millilitri di n-propanolo al 100% per grammo di tessuto.

Mescolare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino di 0,7 millimetri e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.

Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Trasferire il tessuto in un tubo etichettato da 15 millilitri e congelare a -80 gradi Celsius durante la notte.