Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية إعداد عينات البلورات التسلسلية لجمع البيانات على حاقن لزج عالي، هو Lipidico، الذي تم تكليفه مؤخراً في السنكروترون الأسترالي.
Abstract
وقد تم إنشاء مرفق لإجراء قياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي. يتضمن هذا المرفق غرضًا بني حاقنًا عالي اللزوجة، Lipidico، كجزء من خط شعاع البلورات الجزيئية (MX2) لقياس أعداد كبيرة من البلورات الصغيرة في درجة حرارة الغرفة. والهدف من هذه التقنية هو تمكين بلورات من أن تزرع / تنقل إلى المحاقن الزجاجية لاستخدامها مباشرة في حاقن لجمع البيانات البلورية المسلسل. وتشمل مزايا هذا الحقن القدرة على الاستجابة بسرعة للتغيرات في معدل التدفق دون انقطاع من تيار. توجد عدة قيود لهذا اللزوجة العالية عن طريق الحقن (HVI) والتي تتضمن تقييداً على اللزوجات العينة المسموح بها إلى >10 Pa.s. يمكن أن يكون استقرار الدفق أيضاً مشكلة اعتماداً على خصائص معينة من العينة. ويرد هنا بروتوكول مفصل لكيفية إعداد العينات وتشغيل حاقن لقياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي. توضح الطريقة إعداد العينة، بما في ذلك نقل بلورات الليسوزيم إلى وسائط لزجة عالية (شحم السيليكون)، وتشغيل حاقن لجمع البيانات في MX2.
Introduction
البلورات التسلسلية (SX) هي تقنية تم تطويرها في البداية في سياق أشعة إكس ليزر الإلكترون الحر (XFELs)1،2،3،4. على الرغم من أن النهج المستهدفة الثابتة يمكن استخدامها لSX5،6،7، وعادة ما تستخدم أنظمة الحقن لتقديم بلورات في تيار مستمر لشعاع الأشعة السينية. لأنه يجمع بين البيانات من عدد كبير من البلورات، SX يتجنب الحاجة إلى أي محاذاة البلورية أثناء التجربة، وتمكن من جمع البيانات في درجة حرارة الغرفة8،9. مع المعونة من حاقن مناسب، يتم تدفق بلورات واحدا تلو الآخر في منطقة التفاعل الأشعة السينية ويتم جمع البيانات الناتجة عن حيود على كاشف المنطقة9،10. حتى الآن، وقد SX ناجحة في حل عدد من الهياكل البروتين1،11،12،13 بما في ذلك بلورات صغيرة جدا لقياس استخدام البلورات التقليدية. كما قدم رؤى جديدة في الديناميات الجزيئية التي تم حلها في الوقت من خلال استغلال مدة نبض الفيمتو ثانية من XFEL. من خلال بدء ردود الفعل مضخة التحقيق مع مصادر الليزر البصرية، وقد أجريت دراسات متعمقة على photosystem الثاني14،15، الضوئية البروتين الأصفر16،17، cytochrome C oxidase18، وكذلك bacteriorhodopsin19،20،21. وقد بحثت هذه الدراسات ديناميات نقل الإلكترون التي تحدث بعد تنشيط الضوء مما يدل على الإمكانات الكبيرة للبلورات المسلسل لفهم العمليات البيولوجية التي تم حلها زمنيا.
تطور البلورات التسلسلية كما أصبحت سائدة على نحو متزايد في مصادر السنكروترون9،12،20،22،23،24. السنكروترون المستندة SX يسمح لأعداد كبيرة من بلورات الفردية أن تقاس بكفاءة في درجة حرارة الغرفة باستخدام نظام الحقن المناسب. هذا النهج هو مناسبة لبلورات أصغر، وبالتالي، بالإضافة إلى أن تتطلب جهاز الكشف بسرعة معدل الإطار لجمع البيانات، مطلوب أيضا شعاع التركيز الجزئي. بالمقارنة مع البلورات التقليدية، لا ينطوي SX على تركيب ومحاذاة البلورات الفردية في شعاع الأشعة السينية. ونظراً لأن البيانات المستمدة من عدد كبير من البلورات الفردية قد تم دمجها، فإن جرعة الإشعاع التي تتلقاها كل بلورة يمكن أن تنخفض بدرجة كبيرة مقارنة بأشعة الكريستال التقليدية. ويمكن أيضاً تطبيق السنكروترون SX على دراسة ردود الفعل التي تم حلها من وقت إلى نظام ميلي ثانية، شريطة أن يتوفر جهاز كشف بمعدل إطار مرتفع بما فيه الكفاية (على سبيل المثال، 100 هرتز أو أكثر). وقد أجريت العديد من التجارب البلورية التسلسلية في السنكروترون باستخدام الحقن التي وضعت في البداية في XFEL مصادر20,22,23. النوعان الأكثر شيوعا من حاقن هي فوهة الغاز الحيوي الظاهري (GDVN)25 و حاقن اللزوجة العالية (HVI)9,24,26,27,28. وGDVN مثالية لحقن اللزوجة المنخفضة، والعينات السائلة، ولكن يتطلب معدلات تدفق عالية لتحقيق تيارات مستقرة، مما يؤدي بدوره إلى ارتفاع معدلات الاستهلاك العينة. وعلى النقيض من ذلك، HVI هي مناسبة لعينات اللزوجة العالية التي تسمح توليد تيار مستقر بمعدلات تدفق أقل بكثير، مما يؤدي إلى استهلاك عينة أقل بكثير. ولذلك، فإن حقن HVI يفضل تسليم العينات حيث الناقل اللزوج هو الأفضل (على سبيل المثال، القائم على الدهون للبروتينات غشاء) و / أو كميات كبيرة من العينة غير متوفرة. حاقن SX عموما صعبة لاستخدام وتتطلب تدريبا مكثفا للعمل. كما أنها تنطوي على بروتوكولات طويلة لنقل العينات، حيث أن العينة تحتاج إلى تحميل في خزان متخصص، وهذا عموما لديه مخاطر عالية المرتبطة به من العينة التي فقدت إما في "الحجم الميت" أو عن طريق التسرب في الاتصالات. ولذلك، من المستحسن تحسين تصميم الحقن للتخفيف من أي خسائر قبل وصول العينة إلى شعاع الأشعة السينية.
في الآونة الأخيرة، نشرت أول نتائج SX باستخدام Lipidico23 مع هدف lysozyme، وذلك باستخدام كاشف Eiger 16M. يحد تصميم الحقن هذا من هدر العينات عن طريق تقليل عدد الخطوات التي ينطوي عليها الانتقال من التبلور الأولي إلى نقل البلورات إلى الحقن متبوعًا بتسليم العينة إلى شعاع الأشعة السينية. تصف هذه المخطوطة وتوضح عملية نقل العينة بدءاً من إعداد العينة، والانتقال إلى عملية الحقن، وأخيراً جمع البيانات، باستخدام نفس وعاء التبلور. كما وصف عملية حاقن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد البلورات في وسائط اللزجة عالية باستخدام الحقن الزجاجية
- الطرد المركزي حل الكريستال بلطف (~ 1000 س ز، ~ 10 دقيقة في 22 درجة مئوية) لتشكيل بيليه الكريستال الناعمة وإزالة العازلة الزائدة. وهذا سيؤدي إلى تركيز عال من البلورات في بيليه التي يمكن استخدامها لجمع البيانات.
ملاحظة: لمنع تخفيف الوسائط اللزجة زيادة تركيز البلورة في هذه الخطوة. تحسين نسبة الوسائط اللزجة إلى حجم الكريستال لكل عينة للحصول على تركيز عال من البلورات مع الحفاظ على لزوجة عالية لوسائل الإعلام. الطرد المركزي حل الكريستال لتشكيل بيليه وإزالة العازلة الزائدة لزيادة تركيز الكريستال في الحل، كما هو موضح في دارمانين وآخرون. ال29. - اضبط حقنتين 100 ميكرولتر مع قنينة
- ربط المنابر إلى نهاية الحقنة الأولى وإضافة 28 ميكرولتر من حل الكريستال إلى الجزء العلوي من الحقنة. ببطء، أدخل المكبس في الجزء العلوي من الحقنة ودفع بلطف الحل وصولا الى نهاية طرف قنينة، وإزالة أي فقاعات الهواء التي تشكل. قم بذلك باتباع إحدى طريقتين مناقشتها أدناه.
ملاحظة: يمكن أن يختلف حجم البلورات التي سيتم إضافتها إلى الوسائط اللزجة العالية إذا لم يغير بشكل كبير لزوجة العينة الكلية.- الطريقة الأولى: استخدام التغييرات الضغط السريع لتنفجر فقاعات الهواء.
- ضع إصبعًا قفازًا واحدًا بعناية على الجزء العلوي من نقطة إبرة التوصيل الحادة و(بلطف شديد) نطبق الضغط لإنشاء ختم. لا تطبق الكثير من الضغط لأن هذا قد يؤدي إلى إصابة عصا إبرة.
- الآن سحب المكبس مرة أخرى لرسم الحل بعيدا عن نقطة إبرة، وهذا سوف يولد تراكم الضغط في الحقنة.
- سرعان ما تحرر الضغط في الجزء العلوي من الحقنة عن طريق إزالة الإصبع القفاز من طرف الإبرة الحاد. كن حذرا، إذا كانت العينة قريبة جدا من طرف عند إزالة الإصبع قد رذاذ من يؤدي إلى فقدان العينة. سوف تفجر التغير السريع في الضغط داخل الحقنة فقاعات الهواء. كرر حتى تتم إزالة جميع الفقاعات.
- الطريقة الثانية: استخدام "الطرد المركزي البشري" لإزالة فقاعات الهواء.
- ضع الحقنة في يد واحدة مع الإبرة التي تواجه صعودا والم المكبس إسفين بين إصبعين، بحيث لا يمكن أن تتحرك.
- تدوير الذراع بسرعة عقد الحقنة في اتجاه واحد 2-3 مرات، وقوة الطرد المركزي الناتجة على العينة سوف تجبر أي فقاعات الهواء للخروج من الحقنة. كن حذرا، إذا فعلت ببطء جدا عينة يمكن أن تضيع.
- فحص حقنة لفقاعات الهواء، إذا بقيت فقاعات، كرر الخطوات 1.3.2.1 - 1.3.2.2 حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء.
- الطريقة الأولى: استخدام التغييرات الضغط السريع لتنفجر فقاعات الهواء.
- باستخدام ملعقة غرامة، إضافة ~ 42 ميكرولتر من زيوت السيليكون فراغ عالية مباشرة إلى الجزء العلوي من الحقنة الثانية. دفع المكبس على طول الطريق وصولا الى النهاية، وإزالة جميع فقاعات الهواء وضمان عدم وجود فجوة الهواء في نهاية الحقنة.
ملاحظة: التركيب الدقيق للشحوم السيليكون ليست حاسمة كما أنها تعمل باعتبارها الناقل الخامل. قيمة اللزوجة من > 10 باسكال ق أو نسبة من حوالي 60:40 الشحوم السيليكون إلى حل الكريستال هو الأمثل للحقن، ومع ذلك، فمن الممكن أن هذا قد تختلف تبعا للخصائص الدقيقة للعينة. ضبط حجم حل الكريستال المضافة إلى الشحوم سيليكون لتحسين تركيز الكريستال في الخليط، كما هو مبين في المناقشة. وسائل الإعلام عالية اللزوجة غير الشحوم سيليكون يمكن استخدامها طالما أنها متوافقة مع عينة30،31،32،33. - ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في أي من الحقن اثنين وإرفاق الحقن معا باستخدام قنينة. عقد الحقن عموديا عن طريق القبض على نهاية الحقنة كما الاحماء حقنة بسبب الحرارة المتولدة من الأصابع يمكن أن تؤثر على العينة.
- مزيج العينة معا عن طريق الاكتئاب بلطف المكبس على الجانب حل الكريستال بحيث يمزج في الشحوم سيليكون ومن ثم دفع المكبس على الجانب الشحوم سيليكون، بحيث يدفع العينة مرة أخرى نحو الجانب حل الكريستال. بلطف، كرر هذه العملية 50 إلى 100 مرة بحيث يتم خلط العينة جيدا وتبدومتجانسة.
ملاحظة: إذا كانت البلورات تزرع مباشرة في وسائط عالية اللزجة (على سبيل المثال، مرحلة مكعب الدهون، LCP)، فإن الخطوات 1.1-1.6 غير مطلوبة. ويمكن العثور على بروتوكولات لزراعة البلورات داخل الحقن في ليو et.al. 34,35. اتبع هذا البروتوكول حتى الدمج العينة، الخطوة 10، حيث يتم الآن احتوائها كل عينة في حقنة واحدة وإزالة المخزن المؤقت التبلور. إضافة 7.9MAG غير مطلوب لهذا البروتوكول. بدلا من ذلك، إزالة كل السائل الزائد من الحقنة عن طريق دفع بلطف المكبس إلى أسفل في العينة حتى لا يبقى المزيد من السائل في الحقنة. - تصور البلورات تحت المجهر البصري إما من خلال الحقنة أو، للحصول على أفضل النتائج، واستخراج كمية صغيرة (~ 1 ميكرولتر) على شريحة زجاجية ووضع زلة غطاء على الجزء العلوي.
- تحقق من تركيز الكريستال.
- تحديد تركيز البلورات في الشحوم السيليكون عن طريق عد عدد من البلورات في منطقة معينة باستخدام الصور المجهر البصري. للحصول على أفضل النتائج، وكثافة عالية من بلورات صرف موحدة في جميع أنحاء وسائل الإعلام مثالية (>6 بلورات / مل) من أجل الحصول على معدل ضرب الكريستال عالية.
- ضبط تركيز البلورات في الحقنة عن طريق تغيير نسبة البلورات إلى الوسائط اللزجة في الخطوتين 1.3 و 1.4.
- لتقليل تركيز البلورات، تخفيف البلورات في الحقنة عن طريق زيادة كمية الشحوم السيليكون / وسائط HV في الخطوة 1.4 أو عن طريق تخفيف بيليه الكريستال في الحل مع مخزن التبلور قبل إعداد الحقن في الخطوة 1.1.
- لزيادة تركيز البلورة، تقليل كمية الشحوم السيليكون في الخطوة 1.4 ولكن لا تضع في اعتبارها للحد من اللزوجة أقل من 10 Pa.s.
ملاحظة: تم تحسين تركيز البلورة المبلغ عنه هنا لهذه العينة المحددة وحجم الكريستال. ومع ذلك، فإن تركيز الكريستال المثالي تعتمد على حجم الكريستال، وحجم شعاع، وقطر إبرة الداخلية (I.D.)، والتدفق الأشعة السينية الحادث. ويمكن تحديد هذا من معدل ضرب مع معدل ضرب الأمثل من ~ 30٪ تعتبر "جيدة". في الممارسة العملية، يجب أن يكون التركيز الكريستال الأمثل لعينات مختلفة خلال وقت شعاع للحصول على معدل ضرب المطلوب. تبدأ مع تركيز عال من البلورات، 109 بلورات / مل. يتم إعطاء الإجراء لضبط تركيز الكريستال في ليو et.al. 35-
- يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا حتى يصبح المحاقن جاهزًا لجمع البيانات.
- إذا كانت تزرع بلورات في LCP، ثم ختم لهم والسماح لهم بالبقاء في المحاقن لمدة تصل إلى بضعة أيام في درجة حرارة الغرفة.
- إذا تم نقل البلورات إلى وسائط مختلفة لزجة عالية (على سبيل المثال، الشحوم السيليكون)، ثم اختبار الاستقرار من بلورات مع مرور الوقت ينبغي أن تنفذ قبل القياس. وهذا سيحدد كم من الوقت بلورات مستقرة في وسائل الإعلام الخاملة (من الناحية المثالية > 8 ح) والحد الزمني لجمع البيانات. هنا ، كانت بلورات lysozyme مستقرة لعدة أيام في شحوم السيليكون ولم تظهر علامات على الذوبان عند فحصها باستخدام المجهر البصري.
- نقل كل عينة في حقنة واحدة قبل فصل قنينة. افصلي من المُقننة من المحاقن واربطي إبرة الحقن. المسمار الإبرة بقوة في قاعدة الحقنة والتأكد من أن يتم تثبيتها بإحكام لمنع أي تسرب. وقد استخدمت هذه التجربة إبرة 108 ميكرومتر (طول الإبرة 13 مم، نمط النقطة 3). اعتمادا على حجم الكريستال وحجم شعاع إرفاق إما 51 ميكرومتر أو 108 ميكرومتر إبرة الوخز.
ملاحظة: يلزم إجراء اختبار مسبق لتيار العينة قبل وقت الشعاع حتى تتمكن من تحديد حجم إبرة الحقن الصحيحة. اعتمادا على خصائص العينة (أي اللزوجة، الشحن، وتكوين العازلة) وهوية إبرة، وسوف تتدفق العينات بشكل مختلف. لذلك، فمن المستحسن لاختبار مجموعة متنوعة من أحجام إبرة لإنتاج تيار الأكثر استقرارا مع أصغر ممكن إبرة تحديد الشخصية لتعظيم نسبة إشارة إلى الضوضاء أثناء جمع البيانات. - إذا تم بالفعل تركيب الحقن ومحاذاته على خط الحزمة الانتقال إلى القسم 3 وتركيب حقنة العينة مباشرة على حاقن.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
2. حاقن تركيب والسيطرة
- قم بتركيب المحاقن على خط الشعاع. إزالة فوهة المبردة على خط شعاع MX2 واستبدالها مع حاقن. تخفيف المسمار لقط الذي يحمل فوهة المبردة وإرفاقه إلى قوس يقع بجوار المرحلة الآلية.
- ارفع الحقن من عربةه عن طريق حمل المقبض الأسود وضعه على المسرح الآلي.
- ربط حاقن إلى المرحلة الآلية; اليد تشديد مقبض المسمار لقط أسود.
- قم بتركيب حقنة فارغة على المحاقن
- في واجهة التحكم الحاسوبية حاقن (أي برنامج التحكم في موقف EPOS)، حدد وضع Homing تحت أدوات في قائمة البرامج. ثم حدد التبديل الحد السلبي، وبدء Homing، والسماح لتشغيل البرنامج حتى يتم سحب المسمار بما فيه الكفاية للحقنة لتناسب تحت المسمار. إذا تركت لتشغيل غير خاضع للرقابة التبديل الحد توقف المسمار تلقائيا.
- قم بتركيب حقنة فارغة ('دمية') على المحاقن عن طريق إدخال الإبرة من خلال الشق في حامل الحقنة. صف الحقنة ضد القوس.
- ربط الحقنة مع اثنين من O-حلقات.
- التفاف أول O-حلقة عبر منتصف الجزء من حقنة توصيله إلى السنانير على جانبي الحقنة.
- حلقة الثاني O-حلقة حول السنانير على الجزء العلوي من الحقنة ثم وضع جزء واحد من O-حلقة على الجزء العلوي من حقنة الزجاج كما هو مبين في مظاهرة والشكل 1B.
- محاذاة حاقن شعاع الأشعة السينية
- حرك المرحلة الآلية مع المحاقن نحو نقطة التفاعل بالأشعة السينية عبر برنامج التحكم بخط الشعاع. ويمكن تصور ذلك باستخدام الكاميرا المضمنة. يتم الإشارة إلى حجم وموقع الشعاع بواسطة الصليب الأحمر على الشاشة ويمكن نقل المرحلة الآلية لمحاذاة الإبرة مع منطقة التفاعل بالأشعة السينية.
- ضبط x و ص موقف المرحلة لمحاذاة الإبرة مع الصليب الأحمر.
- ضبط موضع z حتى تلميح إبرة يأتي في التركيز.
- تحقق من محاذاة طرف الإبرة وشعاع الأشعة السينية بصريًا عن طريق التحقق من أن طرف الحقنة يفي بالشعر المتقاطع الذي يظهر في صورة المجهر البصرية التي تولدها الكاميرا خط الشعاع.
- بمجرد أن يتم محاذاة تلميح إبرة تحرك الطرف فوق الشعر الصليب ~ 100 μm. هذا يزيل الأشعة السينية مبعثر من طرف إبرة.
ملاحظة: يجب أن يتم تركيب ومحاذاة المحاقن على خط الشعاع MX2 في السنكروترون من قبل العلماء خط شعاع ويمكن أن تكتمل في أقل من 30 دقيقة.
3. تركيب حقنة عينة
- استبدال الحقنة فارغة مع حقنة عينة باتباع الخطوة 2.3.
- ضع غطاء الحقن على رأس المكبس حقنة عينة.
- نقل المسمار محرك الأقراص إلى أعلى الغطاء.
- في برنامج التحكم حاقن حدد وضع السرعة.
- إدخال 3000 دورة في الدقيقة (~ 115 nL / s) كقيمة الإعداد والضغط على تطبيق قيمة الإعداد.
- عندما يلمس المسمار محرك الأقراص الغطاء على رئيس المكبس حقنة، ووقف المحرك.
- تعيين قيمة دورة في الدقيقة إلى صفر في برنامج التحكم حاقن عن طريق تغيير قيمة الإعداد إلى '0' كما المسمار يقترب من الحد الأقصى.
- بمجرد إجراء الاتصال، قم بتنشيط القيمة المسبقة عن طريق الضغط على تطبيق قيمة الإعداد لإيقاف المسمار على الفور.
- تذبذب بلطف الغطاء للتأكد من أنه يتم عقد بحزم في مكان.
ملاحظة: كلما تم إدخال قيمة مجموعة جديدة في المربع قيمة الإعداد في برنامج التحكم يتم تنشيطها فقط بعد الضغط على تطبيق قيمة الإعداد.
4. تشغيل حاقن
- بعد أن أدلى المسمار محرك كاب اتصال ثابت مع الجزء العلوي من المكبس تغيير قيمة الإعداد دورة في الدقيقة إلى 100. وهذا يعادل ~ 4 nL / s.
- فحص بصريا طرف إبرة عندما يخرج العينة أولا أو ننظر في صورة الكاميرا شعاع من الإبرة لمراقبة عندما يبدأ العينة لبثق من طرف إبرة.
- قم بإجراء بحث في الكوخ، أغلق باب الكوخ، واطفئ شعاع الأشعة السينية. من هذه النقطة يجب أن يتم تشغيل حاقن عن بعد من خارج الكوخ.
- ضبط دورة في الدقيقة حتى يتم إنشاء تيار مستقر.
- تقليل قيمة الإعداد في دورة في الدقيقة إلى 90.
- كرر الخطوة 4.4.1، وتقليل قيمة الإعداد في دورة في الدقيقة بزيادات 10، لإبطاء الدفق ولكن لا يزال الحفاظ على تيار ثابت. للشحوم السيليكون قيمة 30 دورة في الدقيقة واستخدمت.
ملاحظة: يتراوح نطاق دورة الدقيقة النموذجية بين 30 إلى 100 دورة في الدقيقة (1 - 4 نيلتر/س) حسب خصائص العينة ووقت التعرض للأشعة السينية. بشكل عام، ينبغي ضبط دورة في الدقيقة لإنتاج أبطأ معدل تدفق (لتقليل استهلاك العينة) مع الحفاظ على تيار مستقر.
- إدارة دفق عينة لا تتدفق بشكل جيد.
- استمر في زيادة قيمة الإعداد في دورة في الدقيقة بزيادات قدرها 10 حتى يصبح الدفق أكثر استقامة. إذا لم يستقر الدفق، حتى بعد زيادة قيمة الإعداد في دورة في الدقيقة إلى الحد الأقصى لقيمة 100 دورة في الدقيقة في محاولة لتحسين الاستقرار من خلال تنفيذ إحدى الطريقتين الموضحتين أدناه.
- الطريقة الأولى: إدراج الماسك عينة البوليسترين تحت تيار عينة للمساعدة في توجيه العينة. يعمل هذا الأسلوب بشكل جيد لتدفقات العينات المشحونة للغاية.
- الطريقة الثانية: إدراج قمع شفط فيتوري إلى الماسك العينة. لتوريد الهواء إلى القمع، توصيله إلى أنبوب منفذ الهواء الموجود في الكوخ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توجيه وتثبيت تدفق العينة بشكل مستقل عن شحنة الدفق.
- استمر في زيادة قيمة الإعداد في دورة في الدقيقة بزيادات قدرها 10 حتى يصبح الدفق أكثر استقامة. إذا لم يستقر الدفق، حتى بعد زيادة قيمة الإعداد في دورة في الدقيقة إلى الحد الأقصى لقيمة 100 دورة في الدقيقة في محاولة لتحسين الاستقرار من خلال تنفيذ إحدى الطريقتين الموضحتين أدناه.
- بمجرد تحقيق تيار ثابت وثابت ، ابدأ في جمع البيانات ، وتحسين مسافة الكاشف حسب تجربة بلوروغرافية الأشعة السينية العادية.
ملاحظة: يتم تحويل دورة في الدقيقة إلى معدل تدفق باستخدام جدول التحويلات الموردة في المعلومات التكميلية ، "حاسبة جهاز Lipidico". أدخل قيمة دورة في الدقيقة وأقطار الإبرة وحجم الحقنة لحساب معدل التدفق باستخدام هذه الآلة الحاسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipidico هو HVI بنيت كنظام تسليم بديل للاستخدام على MX2 (الشكل 1). وهي مناسبة بشكل مثالي لSX حيث تزرع البلورات إما في مرحلة مكعب الدهون أو نقلها إلى وسائط خاملة لزجة عالية.
لإثبات استخدام حاقن تطبيق الشحوم سيليكون مختلطة مع بلورات lysozyme تم استخدامها لجمع البيانات SX في خط شعاع MX2 في السنكروترون الاسترالية. لتركيب حاقن على خط شعاع MX2 تتم إزالة فوهة المبردة واستبدالها عن طريق حاقن كما هو مبين في الشكل 1. يتم تركيب عينات الحقن مباشرة على الحقن وتثبيتها باستخدام O-حلقات (الشكل 1B). يمكن بدء جمع البيانات في غضون دقائق بعد تغيير العينة. تم تصميم حاقن للتحكم السريع في العينة مع إعداد بسيط يسهل تشغيله للمستخدمين الذين لا يألفون SX.
الشكل 1: صور Lipidico، وهو حاقن لزج يستخدم في السنكروترون الأسترالي لتجارب SX. (A) يظهر صورة من Lipidico دمجها في MX2. يشير السهم الأحمر إلى اتجاه شعاع الأشعة السينية. (ب) نظرة أقرب للمنطقة حامل العينة على Lipidico. يتم عقد الحقنة في مكانها بواسطة اثنين من O-حلقات ويتم جمع العينة في الماسك. (D) عرض عن قرب من تيار العينة التي تبين إبرة الحقن والماسك عينة النفايات التي يمكن تغييرها لدمج polystyrene / venturi شفط الماسك ينظر تحت إبرة في (A). وقد تم تكييف هذا الرقم من Berntsen et. al. 201923 بإذن من AIP النشر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
حاقن متوافق مع أنواع مختلفة من الناقلين لزجة للغاية. سرعة تشغيل العينة المثلى للحقن أمر بالغ الأهمية للاستقرار تيار، بطيئة جدا سوف يسبب تأثير الشباك / توسيع تيار وسريع جدا سيؤدي إلى تفكك تيار. وستختلف السرعة المثلى تبعا لنظام الناقل المستخدم. الشكل 2 والشكل 3 تظهر الشحوم السيليكون اختبارها في مختلف بالحقن وسرعة يوضح كيف يمكن أن يختلف سلوك تيار. ويؤدي معدل التدفق البطيء(الشكل 2A، 2.3 nL /s) إلى توسع شحوم السيليكون التي قذفها من الحقن في حين أن معدل التدفق الأسرع(الشكل 2C، 6.6 nL /s) ينتج تيارًا أرق. وقد لوحظ بانتظام الشباك من تيار الوسائط اللزجة (الشكل 3A). للتغلب على هذه المسألة تم اختبار اثنين من الحلول المبتكرة: الماسك البوليسترين وقمع شفط البطين تحت الإبرة. الماسك البوليسترين يدخل قوة ضعيفة الكهروستاتيكي ويعمل بشكل أفضل على عينات مشحونة للغاية، كما هو الحال في الشحوم سيليكون(الشكل 3B)،في حين أن قمع شفط فيتوري المساعدات في توجيه تيار عموديا إلى أسفل إلى الماسك، مستقلة عن الشحن العينة. اعتماداً على خصائص العينة يمكن استخدام الخيارين بنجاح.
الشكل 2: تأثير تيار حامل لزج عالي باستخدام سرعات حاقن مختلفة. تم اختبار 100٪ من الشحوم السيليكون في سرعات عينة مختلفة لتقييم خصائص تدفقها. (أ) . 2.3 nL / s (30 دورة في الدقيقة)،(ب)3.5 nl / s (90 دورة في الدقيقة) و (C) 6.6 ن / س (170 دورة في الدقيقة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: سلوك تيار الشحوم سيليكون 100٪ مما يدل على الشباك من وسائل الإعلام اللزجة. (A) تأثير الشباك في 2.3 nl / s (30 دورة في الدقيقة) (B) تأثير إضافة الماسك البوليسترين إلى حامل النفايات عينة مع سرعة الحقن تعمل في 2.3 nL / s (30 دورة في الدقيقة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم استخدام حقنة زجاجية تحتوي على 26 ميكرولتر من بلورات الليسوزيم (حجم الكريستال 10 ميكرومتر × 10 ميكرومتر × 20 ميكرومتر) معلقة في شحوم السيليكون (الشكل 4A). ولدت Lipidico تيار عينة ثابتة، وذلك باستخدام 108 ميكرومتر إبرة هويّة، مع معدل تدفق متوسط قدره 1.14 nL /s (مع تعيين المحرك إلى 30 دورة في الدقيقة). تم استخدام خوارزمية ذروة الاكتشاف36 لتقييم معدل القصف وتم جمع كمية كافية من البيانات (إجمالي 224200 صورة) في غضون 38 دقيقة من وقت جمع البيانات ، مما يتيح استرداد الهيكل (رمز PDB 6MQV). ويقدم الجدول 1 موجزا لإحصاءات جمع البيانات ويبين الشكل 4B صورة تمثيلية لخريطة كثافة الإلكترونات المحيطة بواحدة من روابط ثنائي السلفيد في بنية lysozyme20.
الشكل 4: صور ليسوزيم. (أ) صور بصرية من بلورات lysozyme في الشحوم السيليكون. عبر الاستقطاب (40x التكبير) صورة بلورات lysozyme مختلطة مع وسائل الإعلام اللزجة عالية، والشحوم سيليكون، وصور باستخدام مجهر الضوء المرئي. يتراوح حجم البلورات بين 15 و 20 ميكرومتر و (B)صورة تمثيلية لخريطة كثافة الإلكترون (2Fo-Fc، 1σ) المحيطة بسندات التكفيريد للlysozyme. وقد تم تكييف هذا الرقم من Berntsen et. al. 201923 بإذن من AIP النشر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
معلومات تكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول 1: جدول موجز يبين إحصاءات بيانات SX من Lipidico. تم خلط بلورات Lysozyme مع وسائط لزجة عالية ، والشحوم السيليكون ، وتدفقها من خلال منطقة التفاعل بالأشعة السينية من خط شعاع MX2. هذا هو ملخص الجدول الكامل للنتائج المنشورة في Berntsen et. الـ23. يتم تكييف الجدول هنا بإذن من AIP النشر.
| إحصاءات البيانات | Lipidico، خط شعاع MX2 |
| كاشف | Dectris EIGER X 16M, |
| معدل الإطارات | 100 هرتز |
| عينة للكشف عن بعد (مم) | 300 |
| طاقة الأشعة السينية (KeV) | 13 |
| حجم الشعاع (WxH) (μm) | 12x22 |
| لا. من الإطارات | 224200 |
| معدل القصف (٪) | 2.95 |
| لا. من الإطارات المفهرسة | 4852 |
| القرار (Å) | 17.74-1.83 |
| اكتمال | 99.44 |
| مجموعة الفضاء | P43212 |
| خلية وحدة | |
| أ، ب، ج (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| التكرار | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| R العمل/ Rمجانا | 0.18/0.26 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تطوير HVI بديل، مثالية لتنفيذ تجارب SX في مصادر السنكروترون. لديها ميزتين رئيسيتين على HVIs القائمة. أولا، فمن السهل لتثبيت على خط شعاع السماح التبديل السريع بين البلورات التقليدية و SX، مطلوب فقط ~ 30 دقيقة للتركيب والمحاذاة على MX2. ثانياً، يمكن استخدام الحقن العينة المستخدمة في زراعة البلورات مباشرة كخزانات للحقن، مما يحد من الهدر أثناء نقل العينة. وقد تم وصف بروتوكول تغيير العينات وجرى عرضها. التصميم يلغي الحاجة إلى تيار الغاز معقدة للسيطرة على الطائرة مقارنة مع غيرها من HVIs. وقد ثبت عملية بسيطة لتغيير معدل تدفق حاقن والتي يمكن تعديلها دون استجابة متأخرة.
والخطوات الأكثر أهمية لنجاح جمع البيانات SX هي تحسين التركيز البلوري، والحصول على خليط متجانس من الوسائط اللزجة العالية، وإنتاج تيار مستقر لجمع البيانات. يمكن تحقيق التركيز البلوري الأمثل والتجانس عن طريق الطرد المركزي للبلورات وصولاً إلى بيليه وإضافة تركيز أعلى من البلورات إلى الوسائط الحاملة ، مما يضمن أن العينة مختلطة تمامًا في نظام الـ قنينة التوصيل. بمجرد أن يتم تحسين تركيز البلورة، يمكن بسهولة تعديل معدل تدفق الحقن خلال وقت الشعاع للحصول على تيار مستقر. ويلاحظ عادة الشباك من تيار لزج مع عينات اللزوجة عالية. يتم تقديم حلين: استخدام الماسك عينة البوليسترين لعينات مشحونة أو إضافة قمع شفط فيتوري بمثابة الماسك. وقد نجح هذا في التحكم في تيار في الاختبارات الأولية، ولكن تحت ظروف مختلفة من الشباك عينة من تيار قد يؤدي إلى التمسك العينة إلى نقطة إبرة. فمن الممكن أن هذا يمكن التغلب عليها عن طريق تغيير خصائص تهمة السطح من الإبرة عن طريق إضافة الطلاء خاصة. الإبر المغلفة مع المواد الكيميائية المختلفة (أي سيليكون) وقد تم تكييفها سابقا بنجاح للاستخدام مع الروبوتات مناولة السائل ويمكن أن تكون مخصصة أمر من المصنوعات لتناسب حقنة37.
لا يقتصر الحقن على الشحوم سيليكون ويمكن استخدامها مع السوائل الأخرى اللزجة للغاية. وقد أظهرت عدة بدائل مختلفة23 والتي يمكن استخدامها بنجاح لحقن الكريستال وتوصف في عدد من المنشورات الأخرى22,30,33. لا يزال الحد الأعلى على اللزوجة عينة باستخدام هذا HVI قيد التحقيق، ولكن اللزوجات عينة تصل إلى 25 Pa.s (باستخدام 100 ٪ من الشحوم سيليكون) قد أسفرت عن تيار مستقر. ومع ذلك، عندما تم تخفيض اللزوجة العينة إلى < 10 Pa.s (باستخدام عينة الشحوم سيليكون 70٪ ) لا يمكن إنتاج تيار موثوق بها. ومن ثم، يمثل 10 Pa.s الحد الأدنى الحالي على اللزوجة العينة للحقن باستخدام HVI هذا. إنّ هويّة الإبرة هي أيضاً من الاعتبارات المهمة. على الرغم من أن 51 ميكرومتر تم اختبارها بنجاح في حين حقن الناقلات المختلفة دون أي بلورات، وإدخال بلورات يعطل تدفق العينة. وبالتالي ، اعتمادا على حجمها ، مع إدخال البلورات في المصفوفة ، هناك احتمال أكبر بكثير من انسداد عند استخدام 51 ميكرومتر إبرة تعريف مقارنة بحجم الإبرة أكبر. عندما يحدث انسداد تراكم الحرجة من الضغط يمكن أن يحدث، في الحقن الأخرى وهذا يمكن أن يؤدي إلى كسر حقنة. ومع ذلك ، فإن تصميم هذا HVI يتضمن آلية السلامة حيث سيتم سحب ميكانيكا محرك الأقراص بعيدا عن المكبس حقنة إذا كان الضغط يصبح مرتفعا جدا حتى يتم تمكين مفتاح التعطيل. وهذا يؤدي إلى توقف محرك الأقراص ويمنع الحقنة الزجاجية من التمزق.
توجد عدة قيود لهذا حاقن. تم تصميم الحقن خصيصا لعينات لزجة للغاية، وبالتالي، السائل مثل العينات لا يمكن استخدامها مباشرة لتسليم العينات. للتغلب على هذا القيد، يمكن خلط البلورات التي تزرع في أنظمة العازلة مع وسائل الإعلام الخاملة مناسبة كما هو موضح في الخطوة 1، ومع ذلك، هناك احتمال أن تصبح الكريستال غير مستقرة. لذلك، ينبغي فحص مجموعة متنوعة من وسائل الإعلام الخاملة26،27،28،29 يجب التحقيق أولا لضمان الحفاظ على استقرار العينة. ثانيا، فإن حجم الكريستال ونوعية التعبئة الكريستال تؤثر على نوعية الحيود. يعمل خط الحزم MX2 بحجم شعاع مثالي 22 × 12 ميكرومتر (H × W) وتدفق ~ 1012 فوتون / ث. حجم الكريستال الأمثل لتنفيذ SX في MX2 هو ~ 10 ميكرومتر، وقد تبين أن تسفر عن نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء. ومع ذلك، فمن الممكن لجمع البيانات على بلورات أصغر حجما إذا كانت مرتبة بشكل جيد وdiffract إلى عالية الدقة. هناك خيار لشق أسفل حجم شعاع في هذا الخط شعاع إلى ~ 7.5 μm، ومع ذلك، وهذا يأتي بتكلفة لأنه يقلل من تدفق الحادث الذي يحتاج إلى النظر في أثناء التجربة.
تطوير هذا حاقن يجعل SX بسهولة الوصول إلى البلورات السائدة. عملية ناجحة من Lipidico، يفتح الباب أمام طريقة سريعة وسهلة لجمع البيانات SX في مجموعة واسعة من مصادر السنكروترون. وهو يتيح جمع بيانات درجة حرارة الغرفة على البلورات التي تبلغ 10 ميكرومتر أو أقل في MX2، مما يحد من آثار الضرر الإشعاعي للبلورات الفردية. كما أنه يوفر فرصة جديدة في أستراليا لتنفيذ وقت ميلي ثانية حل SX الذي هو الدولة الحالية من بين الفن واجلادي البلورات. وتمتد التطبيقات المستقبلية لهذا النظام بالحقن إلى توصيف الأشعة السينية للمواد اللزجة للغاية باستخدام زاوية صغيرة تشتت الأشعة السينية (SAXS) مما يسمح للمحاقن بأن يكون مهيأ بسهولة لخطوط الحزم الأخرى في السنكروترون الأسترالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MK يعمل لتصاميم كوزيل. Kusel التصميم ، وهو مطور جهاز مختبر مخصص ، وكان من قبل الدكتور بيتر بنتسن من جامعة لا تروب والدكتور توم كارادوس ديفيز من ANSTO وتطوير جهاز منخفض التكلفة لتمكين الدراسات اللزجة عالية في خط شعاع MX2 في السنكروترون الأسترالي. تم تطوير الجهاز بالتشاور الوثيق مع الدكتور كارادوش ديفيز. ولا يملك أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل مركز التميز في التصوير الجزيئي المتقدم التابع لمجلس البحوث الأسترالي (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). وقد أُجري هذا البحث جزئيا باستخدام خط الشعاع MX2 في السنكروترون الأسترالي، وهو جزء من منظمة أنستو، واستخدم كاشف المؤسسة الأسترالية لأبحاث السرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al.
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
